豐超杰，劉霞飛，張穎，呂偉華，韓世成，張永泉，許式見，馬波*

(1.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱 150076；3.大連海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧 大連 116023；4.杭州千島湖鱘龍科技股份有限公司，浙江 衢州 324000)

溫度是影響魚類生長、代謝過程中最重要的環(huán)境脅迫因子之一[1]。魚類作為變溫動(dòng)物，由于缺乏自身體溫調(diào)節(jié)機(jī)制，水溫可直接或間接影響魚類正常生命活動(dòng)[2]。溫度變化可引起魚類機(jī)體新陳代謝、免疫應(yīng)答等生命活動(dòng)發(fā)生紊亂，從而引發(fā)疾病甚至死亡[3]。近年來，隨著全球氣候變暖，夏季連續(xù)高溫對(duì)魚類的生長存活產(chǎn)生了諸多不良影響，研究者開始廣泛關(guān)注魚類應(yīng)對(duì)高溫或熱脅迫下的生理調(diào)控機(jī)制[4]。對(duì)細(xì)鱗鮭(Brachymystaxlenok)[5]、大菱鲆(Scophthalmusmaximus)[6]、哲羅鮭(Huchotaimen)[7]及虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[2]等冷水性魚類的研究表明，急性溫度變化可引起魚類機(jī)體穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)失衡，導(dǎo)致肝臟、鰓及腸等器官組織損傷并失去生理調(diào)節(jié)功能。

RNA測(cè)序(RNA-Seq)又稱轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，指在生物的某一發(fā)育時(shí)期或特定條件下組織或細(xì)胞所轉(zhuǎn)錄的全部RNA，包括mRNA和非編碼RNA[8]。目前，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)已在羅非魚(Oreochromismossambicus)[9]、虹鱒[10]和細(xì)鱗鮭[11]等多個(gè)水生生物中得到廣泛應(yīng)用，從分子水平上解釋了這些魚類在特定生存環(huán)境條件下的生理調(diào)控機(jī)制。

黑龍江茴魚(Thymallusarcticusgrubei)隸屬于鮭形目(Salmoniformes)鮭科(Salmonidae)茴魚屬(Thymallus)，主要分布于中國黑龍江、牡丹江、烏蘇里江及松花江等流域[12]。黑龍江茴魚肉質(zhì)細(xì)嫩、味道鮮美且營養(yǎng)豐富，是黑龍江省特有的經(jīng)濟(jì)物種。近年來，由于過度捕撈、環(huán)境污染及棲息地被破壞等因素影響，黑龍江茴魚的野生資源量急劇下降，已被列入《中國瀕危動(dòng)物紅皮書魚類》[13]。作為冷水性魚類，黑龍江茴魚對(duì)外界環(huán)境水溫變化較為敏感，尤其是全球環(huán)境變暖的大趨勢(shì)下，高溫脅迫對(duì)其正常生理代謝產(chǎn)生較大的負(fù)面影響。目前，盡管在國內(nèi)已開展了黑龍江茴魚人工繁殖[14]及種質(zhì)鑒定[15]等研究工作，但有關(guān)黑龍江茴魚應(yīng)對(duì)高溫脅迫的分子調(diào)控機(jī)制尚未見報(bào)道。肝臟在魚類的物質(zhì)代謝、免疫防御等生命活動(dòng)中扮演著極為重要的角色。本研究中，探究了在持續(xù)高溫脅迫下黑龍江茴魚幼魚肝臟組織的病理變化及轉(zhuǎn)錄組表達(dá)特征，以期為探索黑龍江茴魚在高溫脅迫下的響應(yīng)機(jī)制提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

黑龍江茴魚幼魚采集自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所渤海試驗(yàn)基地。選取健康狀況良好、體表無明顯外傷且個(gè)體相近的黑龍江茴魚幼魚240尾，體長為(5.25±0.25)cm，體質(zhì)量為(1.73±0.23)g。試驗(yàn)魚置于全自動(dòng)溫控循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中暫養(yǎng)7 d，期間光暗比為12 h∶12 h，水溫為(11±0.5)℃，pH為(6.91±0.08)，溶解氧≥6 mg/L。每天換水一次，每次換水量為總體積的20%。每天8：00和17：00各投喂1次，日投喂量為魚體質(zhì)量的2%～3%。試驗(yàn)前禁食24 h，試驗(yàn)期間不投喂。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 基于課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)，黑龍江茴魚分別在8、11、14、17 ℃不同溫度的循環(huán)水系統(tǒng)中養(yǎng)殖30 d時(shí)，17 ℃組魚的體長和體質(zhì)量增長緩慢且死亡率較高，為11 ℃組的兩倍多。為此，本試驗(yàn)中設(shè)置11 ℃對(duì)照組(control，C)和17 ℃高溫組(heat，H)，每個(gè)處理組設(shè)置3個(gè)平行，每個(gè)平行放養(yǎng)40尾魚。以1 ℃/h的升溫速率進(jìn)行升溫，直至達(dá)到目標(biāo)溫度。在達(dá)到目標(biāo)溫度后的1、6、12、24、48 h對(duì)高溫組和對(duì)照組分別進(jìn)行采樣，從每組隨機(jī)取18尾，即每個(gè)平行取6尾。使用麻醉劑(MS-222)麻醉后，從每個(gè)平行取3尾魚的肝臟組織混合后，置于-80 ℃超低溫冰箱中保存，用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序；每個(gè)平行余下3尾魚的肝臟組織于Bouin氏液中固定，48 h后轉(zhuǎn)入體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇中保存，用于組織結(jié)構(gòu)觀察。

1.2.2 肝臟石蠟切片制作 取固定后的肝臟組織樣品分別經(jīng)過流水沖洗、乙醇脫水、二甲苯透明和石蠟包埋等處理后進(jìn)行切片，制作成厚度為5～6 μm的組織切片，HE染色后用中性樹脂封片，在Nikon(Eclipse Ci-L)光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.3 RNA提取及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序 為了減少個(gè)體之間的差異，各處理組轉(zhuǎn)錄組測(cè)序設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。使用Trizol試劑從解凍黑龍江茴魚肝臟組織混合樣品中分別提取RNA，采用Aglient 2100生物分析儀系統(tǒng)，檢測(cè)各RNA樣品的純度、濃度及完整性等。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序由歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司(上海)完成，利用Illumina HiSeq 2500平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.2.4 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)控、組裝測(cè)序及基因功能注釋

為了保證信息分析的準(zhǔn)確性，對(duì)原始數(shù)據(jù)(raw reads)進(jìn)行過濾后，采用Trinity軟件Paired-end的拼接方法得到Transcript序列，根據(jù)序列同源性及長度，挑選出最長的一條作為Unigenes；之后再利用CD-HIT軟件聚類去冗余得到一套最終的Unigenes，以此作為后續(xù)分析的參考序列。利用Diamond軟件對(duì)Unigene進(jìn)行NR、KOG、GO、Swiss-Prot、eggNOG及KEGG數(shù)據(jù)庫比對(duì)(E<10-5)，篩選具有最高序列同源性的蛋白，從而得到功能注釋信息。利用HMMER 3.0軟件在Pfam數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Unigenes功能分析。

1.2.5 差異基因的表達(dá)和聚類分析 采用RSEM軟件中bowtie 2獲取每個(gè)樣本中比對(duì)到Unigenes上的clean reads數(shù)，同時(shí)采用Express軟件計(jì)算Unigenes的表達(dá)量(FPKM值)。利用DESeq2軟件包對(duì)各個(gè)樣本基因的counts數(shù)目進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，分析基因表達(dá)水平。為了控制假陽性率，將P<0.05且|log2(fold change)|>1作為顯著性差異基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)，并對(duì)不同養(yǎng)殖時(shí)間得到的差異基因進(jìn)行聚類分析。

1.2.6 差異基因的富集分析 對(duì)差異基因進(jìn)行GO富集分析，對(duì)其功能進(jìn)行描述(結(jié)合GO注釋結(jié)果)。利用KEGG數(shù)據(jù)庫對(duì)差異基因進(jìn)行Pathway分析(結(jié)合KEGG注釋結(jié)果)，并用超幾何分布檢驗(yàn)方法計(jì)算每個(gè)Pathway條目中差異基因富集的顯著性。

1.2.7 qPCR驗(yàn)證 為驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，在轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果中選取6個(gè)差異基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。使用與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序同批次的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得相應(yīng)的cDNA，稀釋后每個(gè)樣本設(shè)置3次重復(fù)試驗(yàn)，以β-actin為參考基因。使用NCBI Primer BLAST設(shè)計(jì)引物(表1)。反應(yīng)程序：95 ℃下預(yù)變性 3 min；95 ℃下變性 5 s，60 ℃下退火 15 s，72 ℃下延伸 30 s(收集熒光)，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；最后在72℃下再延伸2 min。用熔解曲線分析PCR產(chǎn)物的特異性。

表1 引物及序列Tab.1 Primers and sequences

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±S.D.)表示。利用熒光定量PCR儀系統(tǒng)軟件分析PCR結(jié)果，計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量(2-ΔΔCt)，采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 肝臟組織結(jié)構(gòu)的病理變化

對(duì)兩組黑龍江茴魚幼魚的肝臟組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，光鏡下對(duì)照組魚的肝臟肝板結(jié)構(gòu)清晰，排列規(guī)則，肝細(xì)胞質(zhì)均勻，細(xì)胞核呈規(guī)則圓形，位于細(xì)胞中央，肝血竇形態(tài)正常，分布于肝細(xì)胞之間(圖1A)。高溫17 ℃組，隨著脅迫時(shí)間的延長，肝臟表現(xiàn)出不同程度及形式的損傷，與對(duì)照組相比，在脅迫1 h時(shí)，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)比較清晰，未見其他明顯變化(圖1B)；在脅迫6 h時(shí)，肝臟基本結(jié)構(gòu)無明顯異常，胞核呈圓球形，位于細(xì)胞中央，但有極少量的肝細(xì)胞核萎縮變形(圖1C)；在脅迫12 h時(shí)，少量肝細(xì)胞胞質(zhì)出現(xiàn)空泡化，肝細(xì)胞核萎縮程度加重，位于細(xì)胞邊緣，肝血竇間隙收縮(圖1D)；在脅迫24 h時(shí)，肝細(xì)胞形狀不規(guī)則，肝細(xì)胞核萎縮變性加劇，較多肝細(xì)胞空泡化，肝血竇不清晰(圖1E)；在脅迫48 h時(shí)，肝臟組織結(jié)構(gòu)進(jìn)一步被破壞，細(xì)胞間界限雜亂模糊，大量肝細(xì)胞出現(xiàn)空泡化及細(xì)胞核萎縮，嚴(yán)重的甚至出現(xiàn)溶解(圖1F)。

A—肝臟(對(duì)照組)；B—肝臟(17 ℃高溫脅迫1 h)；C—肝臟(脅迫6 h)；D—肝臟(脅迫12 h)；E—肝臟(脅迫24 h)；F—肝臟(脅迫48 h)。VS—空泡；PN—核固縮；CV—中央靜脈；LC—肝細(xì)胞；BC—紅細(xì)胞；HS—肝血竇。A—liver (control group)；B—liver (17 ℃ temperature stress for 1 h)；C—liver (stress for 6 h)；D—liver (stress for 12 h)；E—liver (stress for 24 h)；F—liver (stress for 48 h).VS—cavitation；PN—nuclear condensation；CV—central vein；LC—hepatocytes；BC—red blood cell；HS—hepatic sinusoid.圖1 高溫脅迫下黑龍江茴魚的肝臟結(jié)構(gòu)(HE×400)Fig.1 Liver histological structure of Thymallus arcticus grubei under high temperature stress

2.2 測(cè)序數(shù)據(jù)組裝

對(duì)黑龍江茴魚幼魚肝臟組織的30個(gè)樣本進(jìn)行測(cè)序，共獲得214.44 Gbp的clean data，過濾后各樣本中的有效數(shù)據(jù)量分布為6.82～7.50 Gbp。去除低質(zhì)量、冗余及接頭序列后，各樣本平均GC含量為49.45%，Q30堿基分布為93.48%～96.06%，說明測(cè)序質(zhì)量較好，可為后續(xù)的組裝提供可靠的原始數(shù)據(jù)(表2)。原始數(shù)據(jù)已上傳至NCBI-SRA數(shù)據(jù)庫(PRJNA907151)。

表2 測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Tab.2 Summary of RAN-seq data

采用Trintiy軟件對(duì)clean reads進(jìn)行組裝，共獲得的Unigenes總數(shù)目為106 347條 reads，N50長度為2 262 bp，序列平均長度為1 268.96 bp，最長序列為58 563 bp，最短序列為301 bp(表3)。

表3 轉(zhuǎn)錄本拼接結(jié)果統(tǒng)計(jì)Tab.3 Statistics of transcript splicing results

利用bowtie 2將clean reads比對(duì)到Unigenes，總比對(duì)率為88.08%～89.94%，多位點(diǎn)比對(duì)率為29.94%～32.35%，單一位點(diǎn)比對(duì)率為56.94%～59.30%(表4)。這表明，拼接數(shù)據(jù)結(jié)果可靠，可進(jìn)一步進(jìn)行注釋與富集分析。

表4 Reads與Unigenes比對(duì)結(jié)果統(tǒng)計(jì)Tab.4 Comparison results statistics of reads and Unigenes

2.3 轉(zhuǎn)錄組注釋

為獲得Unigenes全面信息，將全部Unigenes(106 347個(gè))分別在7個(gè)公共數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行序列比對(duì)。從表5可見，在氨基酸序列數(shù)據(jù)庫(NR)被注釋的Unigene序列數(shù)最多，有59 039個(gè)，其次是GO、eggNOG和經(jīng)過注釋的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(Swissprot)，分別有36 876、46 437、41 177個(gè)Unigenes獲得功能注釋，Pfam和蛋白質(zhì)直系同源數(shù)據(jù)庫(KOG)分別有33 058和30 154個(gè)Unigenes被注釋，而KEGG數(shù)據(jù)庫被注釋的Unigenes序列數(shù)最少，只有15 077個(gè)。

表5 數(shù)據(jù)庫注釋結(jié)果Tab.5 Database annotation results

將拼接所得的 Unigene與NR蛋白數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性比對(duì)，相似序列所占比例前5的物種分別有虹鱒、大西洋鮭(Salmosalar)、褐鱒(Salmotrutta)、鯡形白鮭(Coregonusclupeaformis)和銀大麻哈魚(Oncorhynchuskisutch)等，均為鮭科魚類(表6)。

表6 NR注釋top 10物種分布Fig.6 Top 10 species distribution in NR notes

2.4 差異基因的表達(dá)與聚類

使用DESeq對(duì)差異基因進(jìn)行分析，以P<0.05且|log2(fold change)|>1作為閾值來篩選差異基因。結(jié)果顯示，隨脅迫時(shí)間的延長，差異基因的數(shù)量呈先升高后下降的趨勢(shì)，且在各時(shí)間段下調(diào)的差異基因(DEGs)數(shù)均多于上調(diào)的DEGs。在脅迫24 h時(shí)，差異基因數(shù)顯著高于其他4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，差異基因數(shù)量為7 148個(gè)，包括3 653個(gè)上調(diào)基因與3 495個(gè)下調(diào)基因(圖2(d))；脅迫1 h時(shí)，有602個(gè)差異基因，包括180個(gè)上調(diào)基因與422個(gè)下調(diào)基因(圖2(a))；脅迫6 h時(shí)，有921個(gè)差異基因，包括206個(gè)上調(diào)基因與715個(gè)下調(diào)基因(圖2(b))；脅迫12 h時(shí)，有1 203個(gè)差異基因，包括399個(gè)上調(diào)基因與804個(gè)下調(diào)基因(圖2(c))；脅迫48 h時(shí)，有1 022個(gè)差異基因，包括321個(gè)上調(diào)基因與701個(gè)下調(diào)基因(圖2(e))。

圖2 差異基因火山圖Fig.2 Volcano map of differentially expressed genes

為了驗(yàn)證各處理組3個(gè)生物學(xué)重復(fù)DEGs的可靠性，對(duì)各處理組差異基因進(jìn)行聚類熱圖分析。結(jié)果顯示，高溫組(H)和對(duì)照組(C)在不同高溫脅迫時(shí)間的差異基因分別聚類，同組樣本不同重復(fù)的表達(dá)相似(圖3)。

圖3 差異基因聚類圖Fig.3 Cluster map of differentially expressed genes

2.5 差異基因的GO富集

將DEGs比對(duì)到GO數(shù)據(jù)庫進(jìn)行功能分類，結(jié)果顯示，隨著脅迫時(shí)間的延長，富集到GO數(shù)據(jù)庫的DEGs數(shù)呈先升高后下降的趨勢(shì)(圖4)，在脅迫24 h時(shí)DEGs數(shù)最多(2 786個(gè))，其中935個(gè)基因上調(diào)，1 851個(gè)基因下調(diào)，且隨脅迫時(shí)間的延長，差異表達(dá)下調(diào)基因均多于上調(diào)基因(圖4(d))。在不同脅迫時(shí)間下，DEGs富集到GO三大類別(BP、CC和MF)中，其中生物過程(BP)的DEGs數(shù)量最多，主要由代謝過程、細(xì)胞過程、生物調(diào)控和單生物過程組成；富集在細(xì)胞成分(CC)的DEGs數(shù)量次之，主要由細(xì)胞膜、細(xì)胞組分和細(xì)胞器組成；富集在分子功能(MF)的基因數(shù)量最少，主要由催化活性和細(xì)胞結(jié)合組成(圖4)。

圖4 GO富集分析結(jié)果(前 30)Fig.4 Go enrichment analysis(top 30)

DEGs隨高溫脅迫時(shí)間的延長，在BP中，脅迫前期(1～6 h)糖酵解過程、絲氨酸合成甘氨酸過程、碳水化合物代謝過程和基因表達(dá)過程等顯著富集；脅迫中期(12～24 h)脂蛋白脂質(zhì)氧化和細(xì)胞合成過程顯著富集；脅迫后期(48 h)基因表達(dá)過程和糖酵解過程顯著富集。在CC中，脅迫前期吞噬體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體及線粒體呼吸鏈復(fù)合物顯著富集；脅迫中期細(xì)胞外基質(zhì)和溶酶體腔顯著富集；脅迫后期核糖體和吞噬囊泡顯著富集。在MF中，脅迫前期ATP結(jié)合、連接酶活性、氨基酸結(jié)合及核糖體結(jié)構(gòu)成分顯著富集；脅迫中期肌球蛋白結(jié)合、肝素結(jié)合和絲氨酸酶活性顯著富集；脅迫后期ATP結(jié)合、核糖體結(jié)合和連接酶活性顯著富集(圖4)。

2.6 差異基因的KEGG通路富集

將DEGs比對(duì)到KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行富集(P<0.05且q<0.05)，結(jié)果顯示，脅迫1 h時(shí)，差異基因共富集到170個(gè)通路中，其中，顯著富集的通路有37個(gè)，糖酵解/糖異生(ko00010)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工(ko04141)及p53信號(hào)通路(ko04115)等通路顯著富集(圖5(a))；脅迫6 h時(shí)，差異基因共富集到264個(gè)通路，其中，顯著富集的通路有47個(gè)，糖酵解/糖異生(ko00010)、核糖體(ko03010)及吞噬體(ko04145)等通路顯著富集(圖5(b))；脅迫12 h時(shí)，差異基因共富集到253個(gè)通路，其中，顯著富集的通路有46個(gè)，糖酵解/糖異生(ko00010)、乙醛酸與二羧酸代謝(ko00630)及核糖體(ko03010)等通路顯著富集(圖5(c))；脅迫24 h時(shí)，差異基因共富集到329個(gè)通路，其中，顯著富集的通路有30個(gè)，蛋白質(zhì)消化吸收(ko04974)、ECM受體(ko04512)及吞噬體(ko04145)等通路顯著富集(圖5(d))；脅迫48 h時(shí)，差異基因共富集到238個(gè)通路，其中，顯著富集的通路有26個(gè)，乙醛酸與二羧酸代謝(ko00630)、半胱氨酸與蛋氨酸代謝(ko00270)及糖酵解/糖異生(ko00010)等通路顯著富集(圖5(e))。

圖5 KEGG顯著富集結(jié)果(前 20)Fig.5 KEGG significant enrichment results(top 20)

DEGs在脅迫前期(1～6 h)，糖酵解/糖異生(ko00010)、乙醛酸與二羧酸代謝(ko00630)、果糖與甘露糖代謝(ko00051)、半胱氨酸與蛋氨酸代謝(ko00270)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工(ko04141)和核糖體(ko03010)等通路顯著富集；在脅迫中期(12～24 h)，蛋白質(zhì)消化吸收(ko04974)、ECM受體(ko04512)、抗原加工與呈遞(ko04612)、AMPK信號(hào)通路(ko04152)及乙醛酸與二羧酸代謝(ko00630)等通路顯著富集；在脅迫后期(48 h)，乙醛酸與二羧酸代謝(ko00630)、糖酵解/糖異生(ko00010)、半胱氨酸與蛋氨酸代謝(ko00270)、PPAR信號(hào)通路(ko03320)和抗原加工與呈遞(ko04612)等通路顯著富集(圖5)。在急性高溫脅迫過程中，隨著脅迫時(shí)間的延長，差異基因主要在免疫應(yīng)激和能量代謝等調(diào)控過程中顯著富集。這表明，黑龍江茴魚幼魚肝臟組織產(chǎn)生了大量參與調(diào)控代謝和應(yīng)激等相關(guān)的活動(dòng)過程。

2.7 RT-qPCR驗(yàn)證

隨機(jī)選擇6個(gè)差異基因，利用RT-qPCR相對(duì)定量法檢測(cè)高溫組與對(duì)照組幼魚不同養(yǎng)殖時(shí)間下的差異基因表達(dá)情況。結(jié)果顯示，隨著養(yǎng)殖時(shí)間的延長，黑龍江茴魚幼魚的HSP70、HSP90a、DNAJA2及CASP9 mRNA表達(dá)水平總體上呈上調(diào)的趨勢(shì)，而GAPDH和MDH1的mRNA表達(dá)水平則呈下調(diào)的趨勢(shì)，其變化趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果一致，表明測(cè)序結(jié)果可靠(圖6)。

圖6 qPCR檢測(cè)RNA-Seq結(jié)果Fig.6 Validation of RNA-Seq data using qPCR

3 討論

3.1 溫度脅迫對(duì)魚類肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響

肝臟(或肝胰腺)是魚類進(jìn)行物質(zhì)代謝和免疫防御的重要樞紐之一，在溫度脅迫過程中，肝臟對(duì)于機(jī)體減少或免受熱應(yīng)激的傷害具有極其重要的作用[16]。研究表明，高溫脅迫會(huì)引起魚類肝臟組織結(jié)構(gòu)變化，以及肝細(xì)胞空泡化、細(xì)胞核偏移和細(xì)胞溶解等，造成肝臟基本功能受損，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體代謝紊亂并損害健康[17]。周彥靜等[18]通過電鏡觀察虹鱒肝臟組織發(fā)現(xiàn)，在持續(xù)高溫脅迫下肝臟出現(xiàn)淤血、肝竇不清晰、肝細(xì)胞水泡變性甚至溶解。張思敏等[19]對(duì)許氏平鲉(Sebastesschlegelii)高溫處理12 h后發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，高溫處理組肝細(xì)胞雜亂分布，肝細(xì)胞出現(xiàn)空泡化及細(xì)胞核萎縮，嚴(yán)重的甚至出現(xiàn)溶解，表明高溫導(dǎo)致魚類肝臟細(xì)胞受損。本研究中，高溫脅迫下黑龍江茴魚幼魚肝臟組織結(jié)構(gòu)已經(jīng)發(fā)生了明顯的病理損傷，在17 ℃高溫脅迫12～48 h時(shí)，其肝臟組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了不同程度的核萎縮變形及空泡化現(xiàn)象，且在脅迫48 h時(shí)部分肝細(xì)胞出現(xiàn)溶解，這與虹鱒和許氏平鲉在高溫脅迫下肝組織病變癥狀相似。這表明，在17 ℃急性高溫脅迫下，黑龍江茴魚幼魚肝臟組織在脅迫12 h時(shí)已經(jīng)受到微弱損傷，隨著脅迫時(shí)間的延長肝臟組織損傷持續(xù)加劇。

3.2 溫度脅迫對(duì)魚類應(yīng)激反應(yīng)的影響

維持蛋白質(zhì)的功能構(gòu)象對(duì)于機(jī)體抵抗各種環(huán)境應(yīng)激至關(guān)重要。魚類在急性高溫脅迫下機(jī)體細(xì)胞許多酶和蛋白質(zhì)的功能和結(jié)構(gòu)被破壞，使蛋白質(zhì)變性和錯(cuò)誤折疊，形成對(duì)機(jī)體細(xì)胞有害的物質(zhì)[20]。分子伴侶在蛋白質(zhì)合成的折疊、組裝及對(duì)變性蛋白質(zhì)的修復(fù)和降解等過程中起著重要作用[21]。本試驗(yàn)中，差異基因顯著富集在核糖體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工及抗原加工與呈遞等蛋白質(zhì)合成與降解通路上。核糖體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成、轉(zhuǎn)運(yùn)及修飾的細(xì)胞器，抗原加工與呈遞是清除、降解變性蛋白質(zhì)的重要生理過程[22]。富集在以上通路中的差異基因主要為熱休克蛋白家族基因(HSPs)。

研究表明，HSPs在高溫脅迫下大量表達(dá)，以維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)和提高機(jī)體應(yīng)激耐受性。魏亞麗等[20]對(duì)高溫下尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，參與肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)性降解過程的HSP70和HSP90表達(dá)顯著上調(diào)，進(jìn)而維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。對(duì)虹鱒的研究發(fā)現(xiàn)，熱休克蛋白具有高度的調(diào)節(jié)作用，在急性熱脅迫下，HSP70和HSP90均顯著上調(diào)表達(dá)[10]。在短期急性高溫脅迫下，細(xì)鱗鮭肝臟中HSP70基因上調(diào)表達(dá)，隨脅迫時(shí)間的延長，因肝臟組織受損HSP70基因表達(dá)顯著下調(diào)[11]。張晨光等[23]研究證實(shí)，急性高溫脅迫下，翹嘴鱖(Sinipercachuatsi)肝臟HSP70和HSP90基因相對(duì)表達(dá)量呈先上升后下降的變化趨勢(shì)，分別于脅迫12 h和24 h時(shí)升至最高值，在脅迫后期由于肝臟氧化損傷較嚴(yán)重，引發(fā)免疫水平降低，從而引起基因表達(dá)顯著下調(diào)。本研究中，黑龍江茴魚幼魚在17 ℃溫度脅迫下，熱休克蛋白家族基因HSP40、HSP70和HSP90的mRNA均顯著上調(diào)表達(dá)，隨脅迫時(shí)間的延長，HSPs基因表達(dá)量呈先升高后下降的趨勢(shì)，并于脅迫24 h時(shí)達(dá)最高值，與上述研究結(jié)果一致。推測(cè)可能是因?yàn)闊嵝菘说鞍讓?duì)細(xì)胞的保護(hù)作用只能在一定時(shí)間范圍內(nèi)，在短期的急性高溫脅迫下，可以通過誘導(dǎo)產(chǎn)生大量HSPs蛋白提高機(jī)體耐受性，以應(yīng)對(duì)高溫脅迫對(duì)細(xì)胞的損傷；隨著脅迫時(shí)間的延長，機(jī)體內(nèi)平衡被打破，肝臟組織損傷程度加劇，使HSPs基因表達(dá)量顯著降低，合成的分子伴侶蛋白不足以修復(fù)損傷并維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。此外，對(duì)肝臟組織結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，在脅迫48 h時(shí)損傷最嚴(yán)重，而在轉(zhuǎn)錄組分析中發(fā)現(xiàn)差異基因數(shù)在脅迫24 h時(shí)最高，這可能與肝臟組織在脅迫24 h后損傷程度加劇有關(guān)。

3.3 溫度脅迫對(duì)魚類能量代謝的影響

溫度變化可能對(duì)魚類機(jī)體新陳代謝過程產(chǎn)生影響，在一定的溫度范圍內(nèi)，魚類需消耗更多的能量以抵抗溫度脅迫帶來的壓力[24]。對(duì)草魚(Ctenopharyngodonidella)在高溫脅迫下的轉(zhuǎn)錄組研究發(fā)現(xiàn)，高溫脅迫對(duì)精氨酸與脯氨酸代謝、脂肪酸代謝及糖酵解/糖異生等代謝過程有顯著影響[25]。對(duì)細(xì)鱗鮭在急性高溫脅迫下的轉(zhuǎn)錄組研究也發(fā)現(xiàn)，與代謝過程相關(guān)的酶基因下調(diào)表達(dá)，進(jìn)而抑制能量代謝過程[11]。許氏平鲉在急性高溫脅迫下，高溫組的MDH和NADH等代謝相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)，糖代謝過程受抑[26]。紅鰭東方鲀(Takifugurubripes)在熱脅迫下，富集在能量代謝途徑上的差異基因表達(dá)出現(xiàn)下調(diào)[27]。與上述研究結(jié)果一致，本研究中，表達(dá)下調(diào)的差異基因(MDH、GAPDH和GRHPR)主要富集在代謝途徑中的糖酵解/糖異生、果糖與甘露糖代謝、乙醛酸與二羧酸代謝及半胱氨酸與蛋氨酸代謝等代謝通路，表明在17 ℃高溫下，黑龍江茴魚幼魚機(jī)體能量代謝水平受阻。而尼羅羅非魚[20]和胡瓜魚(Osmerusmordax)[28]在高溫脅迫后，其代謝水平明顯上調(diào)，這可能是由于魚類種類的差異在受到溫度脅迫后存在不同的適應(yīng)機(jī)制。

本研究中還發(fā)現(xiàn)，差異基因通過富集在代謝信號(hào)通路上，相互作用共同應(yīng)答高溫脅迫，如PPAR和AMPK信號(hào)通路。研究表明，PPAR信號(hào)通路與動(dòng)物免疫和代謝有關(guān)，在脂質(zhì)氧化過程中具有重要作用[29]。對(duì)大黃魚(Larimichthyscrocea)在高溫脅迫下的轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，差異基因顯著富集到PPAR信號(hào)通路中，調(diào)控糖和脂肪代謝[30]。在高溫脅迫下，大口黑鱸(Micropterussalmoides)呼吸頻率加快，耗氧量增加，肝糖原或脂肪被大量氧化分解，從而造成肝細(xì)胞空泡化，甚至細(xì)胞核萎縮[31]。本試驗(yàn)中，黑龍江茴魚幼魚在17 ℃高溫脅迫12 h后，表達(dá)上調(diào)的差異基因富集在AMPK和PPAR信號(hào)通路，此結(jié)果與對(duì)大黃魚和大口黑鱸的研究結(jié)果一致。推測(cè)此時(shí)機(jī)體能量可能處于比較低的水平，通過增加對(duì)脂肪酸的氧化分解來補(bǔ)充能量，進(jìn)而維持機(jī)體內(nèi)穩(wěn)態(tài)，這與本試驗(yàn)中黑龍江茴魚幼魚肝臟細(xì)胞在脅迫12 h后出現(xiàn)不同程度的核萎縮變形及空泡化結(jié)果一致。

4 結(jié)論

1)在17 ℃高溫脅迫下，黑龍江茴魚幼魚肝臟組織結(jié)構(gòu)隨脅迫時(shí)間的延長損傷程度加劇，說明高溫脅迫能引起黑龍江茴魚幼魚肝臟組織受損。因此，在黑龍江茴魚養(yǎng)殖生產(chǎn)中，應(yīng)密切關(guān)注溫度的變化，降低高溫脅迫對(duì)魚體生理機(jī)能的影響。

2)黑龍江茴魚幼魚肝臟中響應(yīng)急性高溫脅迫的差異基因主要富集在能量代謝和應(yīng)激反應(yīng)過程相關(guān)的通路上。