李艷紅 陸澄瀅 盛桂林 沈迎春 周亮亮 施海燕 王鳴華

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院， 南京 210095； 2.江蘇省農(nóng)藥總站， 南京 210017）

菠菜和芹菜富含類胡蘿卜素、 葉黃素和多種維生素， 具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值， 同時(shí)還有降脂、 降糖、抗氧化等藥用價(jià)值， 在我國(guó)種植面積比較大[1～4]。菠菜和芹菜種植過(guò)程中易受病蟲害的侵襲， 造成產(chǎn)量與品質(zhì)的下降， 農(nóng)藥仍是病蟲害防治的有效手段[5]。 然而， 菠菜、 芹菜都是農(nóng)藥殘留污染風(fēng)險(xiǎn)較高的蔬菜[6～9]， 因此芹菜和菠菜中農(nóng)藥殘留情況和膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)格外值得關(guān)注。

蟲酰肼是一種促進(jìn)鱗翅目幼蟲蛻皮的新型仿生型殺蟲劑， 能有效防治鱗翅目害蟲[10～12]， 已在甘藍(lán)、 蕹菜、 蘋果等作物上登記使用[13]。 目前， 蟲酰肼在不同基質(zhì)中的消解及殘留情況已有報(bào)道， 如其在甘藍(lán)中的半衰期為2.96～4.08 d， 在土壤中的半衰期為4.95～7.70 d[10]； 在蘋果上的半衰期為3.14～4.63 d[12]； 在萵苣和大白菜中的半衰期為5.0～8.2 d和4.5～4.8 d[14～15]。 但蟲酰肼在菠菜和芹菜中的殘留行為和膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)尚未見(jiàn)報(bào)道。 本研究擬建立測(cè)定菠菜和芹菜中蟲酰肼殘留的分析方法， 并在良好農(nóng)業(yè)規(guī)范下開(kāi)展20%蟲酰肼懸浮劑在菠菜和芹菜中的殘留試驗(yàn)， 測(cè)定蟲酰肼在菠菜和芹菜上的殘留量， 同時(shí)結(jié)合居民膳食數(shù)據(jù)資料， 對(duì)蟲酰肼的膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評(píng)估， 旨在為蟲酰肼在菠菜和芹菜上的登記及最大殘留限量制定提供科學(xué)依據(jù)。

一、 材料與方法

（一） 儀器與藥劑ACQUITY UPLC-XEVO TQS-micro 液相色譜/三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)Waters 科技有限公司）； JN25-12D 型超聲波清洗儀 （寧波江南儀器廠）； 臺(tái)式切割攪拌機(jī)（法國(guó)羅伯特有限公司）； BSA124S 電子天平（德國(guó)賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）； Talboys 數(shù)顯型渦旋混合器（美國(guó)Henry Troemne 公司）； N- EVAP111型氮吹儀 （美國(guó)Agilent 科技有限公司）； 0.22 μm微孔濾膜（上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）。

蟲酰肼標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.64%， 德國(guó)Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司）； 20%蟲酰肼懸浮劑 （江蘇寶靈化工股份有限公司）； 甲醇 （色譜純， 美國(guó)TEDIA 公司）； 無(wú)水硫酸鎂 （分析純， 永華化學(xué)科技有限公司）； 氯化鈉 （分析純， 西隴科學(xué)股份有限公司）； 石墨化碳黑 （GCB）（40～120 μm， 德國(guó)CNW Technologies GmbH 公司）。

（二） 田間試驗(yàn)按照NY/T 788-2018 《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則》[16]， 于2022 年在江蘇、 河南、 北京、 內(nèi)蒙古、 廣東、 廣西、 湖南、 山西8 地進(jìn)行了20%蟲酰肼懸浮劑在菠菜和芹菜上的最終殘留試驗(yàn)， 并在江蘇、 河南、 廣東、 廣西4 地進(jìn)行了蟲酰肼在菠菜上的消解動(dòng)態(tài)試驗(yàn)； 在江蘇、 湖南、 河南、 廣西4 地進(jìn)行了蟲酰肼在芹菜上的消解動(dòng)態(tài)試驗(yàn)。 20%蟲酰肼懸浮劑以推薦最高劑量125 g a.i./hm2， 在菠菜和芹菜上施藥1 次， 每個(gè)試驗(yàn)設(shè)置1 個(gè)對(duì)照小區(qū)和1 個(gè)處理小區(qū)， 小區(qū)面積為50 m2， 對(duì)照和處理小區(qū)設(shè)置隔離帶。 于施藥后2 h 和1、 3、 5、 7、 10 d 采集消解樣品， 于施藥后5、 7 d 采集最終殘留樣品。 每小區(qū)采集兩個(gè)獨(dú)立樣本 （≥1 kg）， 切碎混勻， 分取150 g， 低溫（-20℃） 保存。

（三） 樣品前處理將田間采集的菠菜和芹菜樣本用干冰粉碎后， 準(zhǔn)確稱取10.0 g 樣本于50 mL離心管中， 加入10 mL 乙腈， 渦旋5 min， 再加入4 g 無(wú)水硫酸鎂和1 g 氯化鈉， 渦旋2 min， 以4 000 r/min 離心5 min。 吸取4 mL 有機(jī)相轉(zhuǎn)移到15 mL含有600 mg 無(wú)水硫酸鎂和100 mg GCB 的離心管中， 渦旋1 min， 以4 000 r/min 離心5 min， 移取1 mL 上清液， 氮?dú)獯蹈桑?將殘留物用1 mL 色譜純甲醇復(fù)溶。 移取0.2 mL 復(fù)溶溶液， 加入1.8 mL 色譜純甲醇稀釋， 過(guò)0.22 μm 濾膜， 待測(cè)。

（四） 檢測(cè)條件

1.色譜條件。 色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm × 50 mm， 1.7 μm）； 進(jìn)樣體積為2 μL； 流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液 （A 相） 和甲醇（B 相）； 流速為0.30 mL/min。 梯度洗脫程序?yàn)椋?→0.5 min， 90%A； 0.5→0.6 min， 90%A→10%A；0.6 →3.0 min， 10% A； 3.0 →3.1 min， 10% A →90%A； 3.1→5.0 min， 90%A。

2.質(zhì)譜條件。 電噴霧離子源正離子模式（ESI+）；毛細(xì)管電壓為4.0 kV； 離子源溫度為150℃； 脫溶劑溫度為500℃； 脫溶劑氣流量為1 000 L/h； 錐孔氣流量為50 L/h； 采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式 （MRM），定量離子m/z353.25/133.12， 碰撞電壓18 V； 定性離子m/z353.25/297.19， 碰撞電壓6 V。 蟲酰肼保留時(shí)間為2.67 min。

（五） 標(biāo)準(zhǔn)溶液及標(biāo)準(zhǔn)曲線準(zhǔn)確稱取0.010 0 g 99.64%蟲酰肼標(biāo)準(zhǔn)樣品于10 mL 容量瓶中， 用色譜純甲醇稀釋至刻度， 配成1 000 mg/L 的蟲酰肼標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液， 再用色譜純甲醇梯度稀釋配制成1.000、 0.500、 0.100、 0.050、 0.010、 0.001 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。 在上述檢測(cè)條件下進(jìn)行測(cè)定， 以蟲酰肼標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（x） 和相應(yīng)峰面積（y） 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

分別按照上文 “（三） 樣品前處理” 步驟制得空白菠菜、 芹菜樣本， 氮?dú)獯蹈桑?準(zhǔn)確加入10.00、5.00、 1.00、 0.50、 0.10、 0.01 mg/L 系列濃度的蟲酰肼標(biāo)準(zhǔn)工作溶液1 mL， 再移取0.2 mL 溶液， 加1.8 mL 色譜純甲醇稀釋， 即得1.000、 0.500、 0.100、0.050、 0.010、 0.001 mg/L 的系列蟲酰肼菠菜、 芹菜基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液。

（六） 添加回收實(shí)驗(yàn)分別向空白菠菜樣本中添加4 個(gè)水平濃度 （0.01、 0.10、 10.00、 20.00 mg/kg） 的蟲酰肼標(biāo)準(zhǔn)溶液； 向空白芹菜樣本中添加3 個(gè)水平濃度 （0.01、 0.10、 10.00 mg/kg） 的蟲酰肼標(biāo)準(zhǔn)溶液； 每個(gè)濃度重復(fù)5 次， 按上文“（三）樣品前處理”“（四） 檢測(cè)條件” 進(jìn)行樣品處理和檢測(cè)， 計(jì)算添加回收率以及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

（七） 消解動(dòng)態(tài)及半衰期的計(jì)算蟲酰肼在芹菜和菠菜中的消解動(dòng)態(tài)用一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程［見(jiàn)公式（1）］ 擬合， 半衰期按公式（2） 計(jì)算。

公式（1）～（2）中，Ct為時(shí)間t時(shí)的農(nóng)藥殘留量（mg/kg）；C0為施藥后的原始沉積量（mg/kg）；k為消解系數(shù)；t為施藥后時(shí)間（d）；t1/2為半衰期（d）。

（八） 膳食風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

1.急性膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。 蟲酰肼在菠菜和芹菜中的急性膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估按公式 （3） ～（5）計(jì)算， 其中芹菜的平均單份質(zhì)量為0.86 kg， 由于芹菜的單份質(zhì)量大于大份餐數(shù)據(jù)， 因此其短期膳食攝入量可通過(guò)公式（4） 計(jì)算而得[17～18]。

公式 （3）～（5） 中， ESTI 為短期膳食攝入量（mg/kg bw）； HR 為最大殘留量（mg/kg）； LP 為菠菜/ 芹菜大份餐數(shù)據(jù) （kg/d）； bw 為平均體重；v為樣品消費(fèi)量個(gè)體之間的變異因子， 取3； ARfD為急性參考劑量 （mg/kg bw）； RQa為急性膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)商 （%）， 當(dāng)RQa>100%時(shí)表示存在不可接受的急性風(fēng)險(xiǎn)， RQa值越大， 風(fēng)險(xiǎn)越大。 上述不同人群的菠菜和芹菜消費(fèi)大份餐數(shù)據(jù)與體重?cái)?shù)據(jù)均參考世界衛(wèi)生組織（WHO）相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)[19～20]。

2.慢性膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。 蟲酰肼的慢性膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估按公式（6）～（7）計(jì)算[21～22]。

公式（6）～（7）中， NEDI 為國(guó)家估計(jì)每日攝入量 ［mg/（kg bw·d）］； STMRi為蟲酰肼在某一食品中的殘留試驗(yàn)中值（mg/kg）；Fi為某一食品的消費(fèi)量［g/（kg bw·d）］； ADI 為農(nóng)藥的每日允許攝入量（mg/kg bw）； RQc為慢性膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)商 （%），當(dāng)RQc＞100%表示所評(píng)估的食品具有不可接受的高健康風(fēng)險(xiǎn)， RQc值越高， 風(fēng)險(xiǎn)越高。 本研究中一般人群對(duì)各類食品的攝入量數(shù)據(jù)以及不同年齡階段人群對(duì)菠菜、 芹菜的消費(fèi)量均來(lái)自《中國(guó)居民營(yíng)養(yǎng)與健康狀況調(diào)查報(bào)告之十： 2022 營(yíng)養(yǎng)與健康狀況數(shù)據(jù)集》[23]和WHO 相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)[24]。

二、 結(jié)果與分析

（一） 凈化劑的選擇十八烷基硅烷 （C18）、N-丙基乙二胺 （PSA） 和石墨化碳黑 （GCB） 是QuEChERS 方法中常用的凈化劑。 C18易吸附非極性物質(zhì)， 如脂肪、 甾醇和揮發(fā)油； PSA 能有效吸附和去除蔬菜水果中的脂肪酸、 糖類和少量脂溶性色素， 但對(duì)色素的凈化效果較差； GCB 是一種具有均勻石墨化表面的規(guī)則多面體， 表現(xiàn)出廣譜的吸附性能， 為茶葉、 蔬菜等高色素含量樣品凈化的首選材料[25～27]。 本研究比較了3 種凈化劑在相同用量下對(duì)菠菜和芹菜樣品的凈化效果， 結(jié)果見(jiàn)圖1。 從圖1 結(jié)果可以看出， 3 種凈化劑及組合的平均回收率均在80%～120%之間。 但是使用GCB 時(shí)， 提取液清澈透明， 對(duì)菠菜和芹菜中色素的凈化效果較好， 因此最終選擇GCB 作為吸附劑來(lái)凈化提取液。

圖1 不同凈化劑對(duì)菠菜和芹菜中蟲酰肼的回收率（A）及凈化效果（B）的影響

（二） 方法驗(yàn)證蟲酰肼在菠菜和芹菜中的線性方程、 決定系數(shù) （R2） 和基質(zhì)效應(yīng)見(jiàn)表1。 由表1 可知， 在0.001～1.000 mg/L 范圍內(nèi)， 蟲酰肼在甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液和基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液中的峰面積（y）與進(jìn)樣質(zhì)量濃度 （x） 間呈良好線性關(guān)系 （R2＞0.999）。 蟲酰肼在菠菜和芹菜中的基質(zhì)效應(yīng)為3.5%、 9.6%， 均為弱基質(zhì)效應(yīng)。 為減少基質(zhì)效應(yīng)對(duì)檢測(cè)分析的影響， 采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線定量來(lái)消除基質(zhì)效應(yīng)。 添加回收試驗(yàn)結(jié)果表明， 蟲酰肼在菠菜樣本中添加濃度為0.01～20.00 mg/kg 時(shí)， 平均回收率在90.0%～99.3%之間， RSD 為1.6%～5.6%（見(jiàn)表2）； 蟲酰肼在芹菜樣本中添加濃度為0.01～10.00mg/kg 時(shí)， 平均回收率在90.0%～100.8%之間， RSD 為1.4%～4.8%。 蟲酰肼在菠菜和芹菜中的定量限 （LOQ） 均為0.01 mg/kg。 分析方法的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性均能滿足農(nóng)藥殘留分析要求。

表1 蟲酰肼在菠菜和芹菜中的線性方程、 決定系數(shù)及基質(zhì)效應(yīng)

表2 蟲酰肼在菠菜和芹菜中的添加回收率、 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差和定量限 （n＝5）

（三） 消解動(dòng)態(tài)20%蟲酰肼懸浮劑以125 g a.i./hm2施用1 次， 施藥后2 h， 江蘇、 湖南、 河南、廣西4 地芹菜中蟲酰肼的原始沉積量分別為4.70、12.32、 7.27、 6.82 mg/kg； 蟲酰肼在江蘇、 河南、廣東、 廣西等4 地菠菜中的原始沉積量分別為10.80、 10.63、 8.30、 16.55 mg/kg。 菠菜葉片表面積較大， 更容易附著農(nóng)藥， 其初始沉積量高于芹菜。 蟲酰肼在菠菜和芹菜中的消解規(guī)律符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程（見(jiàn)圖2）， 其在菠菜中的半衰期為2.9～4.5 d， 在芹菜上的半衰期為2.4～13.1 d。 芹菜較菠菜的降解速率較慢， 可能是由于芹菜葉片形態(tài)和氣孔數(shù)、 蠟狀表面以及特殊的微管結(jié)構(gòu)， 不利于農(nóng)藥的降解[3，10，20]。 此外， 分析發(fā)現(xiàn)蟲酰肼在大棚種植的菠菜（江蘇、 河南） 和芹菜（江蘇、 湖南） 中的半衰期總體較露地種植的菠菜（廣東、 廣西） 和芹菜（河南、 廣西） 的半衰期長(zhǎng)。 這可能是由于種植模式不同， 環(huán)境條件也不同， 在露地條件下， 受光照、 雨水、 氣溫等氣候因子的影響較大； 而在相對(duì)封閉的設(shè)施條件下， 受自然條件的影響較小， 因此消解較慢。 總之， 農(nóng)藥在作物中的消解與農(nóng)藥本身理化性質(zhì)、 初始沉積量、 作物種類、 生長(zhǎng)趨勢(shì)和氣候等因素相關(guān)[18，28～31]。

圖2 蟲酰肼在菠菜 （A） 和芹菜 （B） 上的消解曲線和半衰期

（四） 最終殘留施藥后5、 7 d， 8 地菠菜和芹菜中蟲酰肼的最終殘留量結(jié)果見(jiàn)表3。 由表3 可知， 施藥后5 d， 蟲酰肼在菠菜中的殘留量為1.00～7.40 mg/kg， 最大殘留量為7.40 mg/kg， 殘留中值為4.15 mg/kg； 在芹菜中的殘留量為0.70～8.94 mg/kg， 最大殘留量為8.94 mg/kg， 殘留中值為3.20 mg/kg。 施藥后7 d， 蟲酰肼在菠菜中的殘留量為0.76～6.18 mg/kg， 最大殘留量為6.18 mg/kg， 殘留中值為3.26 mg/kg； 在芹菜中的殘留量為0.67～7.68 mg/kg， 最大殘留量為7.68 mg/kg， 殘留中值為2.40 mg/kg。 在相同劑量、 施藥次數(shù)和采收間隔的情況下， 隨著采收間隔延長(zhǎng)， 殘留量下降。 我國(guó)GB 2763-2021 《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》規(guī)定蟲酰肼在葉菜類蔬菜上的最大殘留限量 （MRL） 為10 mg/kg， 本研究中菠菜和芹菜中蟲酰肼在采收間隔期為5、 7 d 時(shí)的殘留量均低于我國(guó)MRL 規(guī)定， 表明在推薦劑量下， 采收間隔期5 d 收獲的菠菜和芹菜符合我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。

表3 蟲酰肼在菠菜和芹菜中的最終殘留量 （mg/kg）

（五） 膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

1.急性膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。 蟲酰肼的ARfD 值為0.9 mg/kg bw[19]。 施藥后5 d 時(shí)蟲酰肼在菠菜、芹菜中的HR 分別為7.40 mg/kg 和8.94 mg/kg。 本研究評(píng)估了菠菜和芹菜中蟲酰肼殘留對(duì)兒童與一般人群的急性膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)， 結(jié)果見(jiàn)表4。 結(jié)果顯示， 蟲酰肼對(duì)兒童的RQa為24.3%～37.8%， 對(duì)一般人群為10.7%～14.5%。 蟲酰肼對(duì)兒童的急性膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)高于一般人群， 但風(fēng)險(xiǎn)商均未超過(guò)100%， 表明菠菜和芹菜中蟲酰肼殘留對(duì)一般人群與兒童的急性膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)均處于可接受水平。

表4 菠菜和芹菜中蟲酰肼殘留對(duì)兒童和一般人群的急性膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)

2.慢性膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。 GB 2763-2021 中規(guī)定蟲酰肼的ADI 值為0.02 mg/kg bw。 施藥后5 d時(shí)蟲酰肼在菠菜、 芹菜中的殘留中值 （STMR） 分別為4.15、 3.20 mg/kg。 考慮到不同年齡的人群，食物攝入量與體重的比例存在顯著差異， 因此， 根據(jù)不同年齡段人群對(duì)菠菜和芹菜的消費(fèi)量數(shù)據(jù)[24]進(jìn)行了蟲酰肼在菠菜和芹菜中的慢性膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估， 結(jié)果見(jiàn)表5。 如表5 所示， 對(duì)不同年齡階段的人群， 菠菜和芹菜中蟲酰肼殘留的RQc在12.5%～39.0%之間， 均小于100%， 屬于安全暴露水平。

表5 菠菜和芹菜中蟲酰肼殘留對(duì)不同年齡段人群的慢性膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)

三、 結(jié)論

本研究采用乙腈提取， GCB 凈化， UPLC-MS/MS 檢測(cè)， 建立了蟲酰肼在菠菜和芹菜中的殘留檢測(cè)方法， 方法的準(zhǔn)確度、 精確度、 靈敏度均符合農(nóng)藥殘留分析的要求。 利用所建立的殘留檢測(cè)方法，開(kāi)展了蟲酰肼在菠菜和芹菜中的殘留行為研究， 并進(jìn)行了膳食風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。 結(jié)果顯示， 蟲酰肼在菠菜和芹菜中的半衰期分別為2.9～4.5 d、 2.4～13.1 d，屬于易降解農(nóng)藥。 施藥后5 d， 蟲酰肼在菠菜和芹菜中的殘留量分別為1.00 ～7.40 mg/kg 和0.70～8.94 mg/kg， 均低于我國(guó)規(guī)定的葉菜類蔬菜中蟲酰肼的最大殘留限量。 菠菜和芹菜中蟲酰肼殘留對(duì)兒童與一般人群的RQa為10.7%～37.8%， 對(duì)不同年齡段人群的RQc為12.5%～39.0% ， 均小于100%， 說(shuō)明蟲酰肼的殘留量不會(huì)對(duì)人群健康造成不可接受的風(fēng)險(xiǎn)。

本文引用格式： 李艷紅， 陸澄瀅， 盛桂林， 等.蟲酰肼在菠菜和芹菜上的殘留行為及膳食風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估［J］.農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量與安全， 2023 （5）： 37-42.

LI Yanhong， LU Chengying， SHENG Guilin，et al.Residual behavior and dietary risk assessment of tebufenozide in spinach and celery ［J］.Quality and Safety of Agro-products， 2023 （5）： 37-42.