朱嘉樂，王梓行，郭嘉，朱德馨，魏春燕，史超，張偉，孫志華，張輝

(新疆石河子大學動物科技學院，新疆 石河子 832003)

豬流行性腹瀉(porcien epidemic diarrhea，PED)是由豬流行性腹瀉病毒(porcien epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的一種接觸性腸道傳染病，嚴重危害畜牧業(yè)的健康發(fā)展[1]。PEDV屬于冠狀病毒科α冠狀病毒屬成員，是一種有囊膜包被的單股正鏈RNA病毒[2]。仔豬感染后其臨床表現(xiàn)為嚴重嘔吐、腹瀉、精神抑郁及食欲下降等，最后因消瘦、嚴重脫水而死亡[3]。

自噬是細胞內的一種降解機制，細胞通過這種機制將有毒的聚集體、受損的細胞器和感染物從細胞質中移除，或者通過將其降解達到代謝的目的。同時自噬也可作為一種促進細胞生存的機制發(fā)揮作用，負責溶酶體的降解和細胞質再循環(huán)[4]。病毒感染細胞可引起細胞自噬，自噬同樣會影響病毒復制[5]。如豬瘟病毒感染可誘導細胞自噬并促進完整的自噬過程，自噬過程有利于豬瘟病毒的復制[6]，同時也有研究表明，自噬可以抑制PEDV的復制[19]。

三結構域蛋白5α(tripartite motif protein 5α，TRIM5α)是TRIM蛋白家族重要成員，由RING、B-box、Coiled-coil和PRYSPRY 4個結構域組成[7]，TRIM5α對豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)存在抑制作用[7]，TRIM21通過核衣殼蛋白的蛋白酶體降解抑制PEDV增殖[8]，但TRIM5α對PEDV的調控作用鮮有報道。

本研究利用PEDV感染Vero-E6細胞誘導細胞自噬，通過實時熒光定量技術檢測TRIM5α在PEDV感染Vero-E6細胞過程中的表達量，進而通過RNA干擾技術合成TRIM5α干擾片段檢測其是否會對Vero-E6細胞自噬和PEDV復制產(chǎn)生影響，初步證明TRIM5α通過促進Vero-E6細胞自噬并抑制PEDV在Vero-E6細胞中的復制，為揭示TRIM5α在PEDV感染Vero-E6細胞過程中發(fā)揮調控作用提供理論依據(jù)，為PED的防控和藥物新靶點的開發(fā)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 細胞與毒株

非洲綠猴腎細胞(Vero-E6)和PEDV毒株均由新疆石河子大學動物疾病防控兵團重點實驗室保存。

1.2 主要試劑及儀器

DMEM basic(1×)、胰酶和胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司；UltraSYBR Mixture(Low ROX)熒光定量染料，Ultrapure RNA Kit超純RNA提取試劑盒均購自康為世紀生物科技有限公司；cDNA反轉錄試劑盒購自北京天根生化科技(北京)有限公司；轉染試劑購自上海碧云天生物技術公司；LC3A/B Rabbit mAb購自Cell Signaling Technology(CST)公司；HRP AffiniPURE Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)購自Earthox公司；高敏性ECL化學發(fā)光檢測試劑盒購自南京諾維贊生物科技股份有限公司。

1.3 引物序列設計及siRNA

根據(jù)GenBank中公布的PEDV N基因序列(MT787025.1，MW560716.1)、PEDV ORF3基因序列(MZ342899.1)、TRIM5α基因序列(AY625003.1)、GAPDH基因序列(XM_028828781.1)設計相應引物，引物由生工生物工程公司合成。TRIM5α的3條siRNA由安徽通用生物公司設計并合成(表1)。

表1 引物及干擾片段

1.4 半數(shù)組織細胞感染量(TCID50)測定

取處于對數(shù)生長期的Vero-E6細胞平鋪于96孔板，將待測病毒液經(jīng)10倍依次稀釋，分別感染細胞。每孔感染100 μL病毒稀釋液，對照孔感染100 μL稀釋緩沖液。置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 d，觀察并記錄96孔板中發(fā)生病變的孔數(shù)，采用Reed-Muench法測定TCID50。

1.5 PEDV感染Vero-E6細胞N基因的鑒定

取對數(shù)生長期的Vero-E6細胞，以MOI=1 PEDV接種至Vero-E6細胞，感染3～4 d后，利用RNA提取試劑盒提取總RNA。按照反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄，以反轉錄cDNA作為模板，使用PEDV-N(MT787025.1)的特異性引物進行N基因的擴增。取20 mL PCR擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，通過凝膠成像儀觀察目的條帶。

1.6 Western blot檢測LC3Ⅱ表達水平

以MOI=1的PEDV感染Vero-E6細胞，分別在0、6、12、24、36和48 h收集被感染細胞，裂解液裂解后，12 000 r/min，離心10 min，收取上清液制備蛋白樣品，用BCA法檢測蛋白濃度并定量。經(jīng)SDS-PAGE電泳，90 V恒壓6 h，將蛋白轉至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，以兔抗LC3A/B單抗為一抗，以HRP 標記的山羊抗兔為二抗，ECL顯色，化學發(fā)光成像儀拍照保存。

1.7 熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測TRIM5α的表達水平

以PBS為對照，分別在0、6、12、24、36和48 h后收集細胞并提取總RNA，反轉錄合成的cDNA。以GAPDH(XM_028828781.1)為內參基因，熒光定量PCR定量檢測TRIM5α基因的mRNA表達水平(每組各3個重復)。程序設定采用三步法熒光定量PCR，熒光定量PCR反應條件：95 ℃預變形10 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共50個循環(huán)。使用2-ΔΔCt計算TRIM5α的相對表達量。

1.8 利用RT-qPCR檢測siRNA干擾效率

將siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3分別轉染Vero-E6細胞，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，利用RNA提取試劑盒提取干擾后細胞總RNA并將其反轉錄為cDNA。以其為模板，采用TRIM5α(AY625003.1)的定量引物對其進行相對定量檢測，計算siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3的干擾效率。

1.9 干擾TRIM5α對細胞自噬和病毒復制的影響

根據(jù)1.8結果將siRNA-2轉染Vero-E6細胞并設立對照組。細胞生長至70%～80%時接種MOI=1的病毒。按照1.6方法收集被病毒感染48 h的細胞，檢測LC3Ⅱ蛋白的表達水平。同時提取被病毒感染48 h細胞的總RNA，利用1.7的方法，以PEDV-N和PEDV-ORF3的定量引物檢測N和ORF3基因的mRNA表達水平。通過Reed-Muench法測定干擾TRIM5α組和對照組病毒TCID50。

1.10 統(tǒng)計學分析

每個試驗均重復3次。數(shù)據(jù)處理采用SPSS 17.0軟件進行分析，采用單因素方差分析比較兩組間均數(shù)差異，結果用“平均值±標準差”表示。P<0.05，差異顯著，P<0.01，差異極顯著。

2 結果

2.1 病毒TCID50測定

PEDV感染Vero-E6細胞后，觀察并記錄96孔板中發(fā)生病變的孔數(shù)，采用Reed-Muench法測定TCID50，結果見表2。

表2 PEDV TCID50的測定

距離比=(61.5-50)/(61.5-21.4)=0.3，lgTCID50=(-1)×0.3+(-6)=-6.3，所以病毒液的TCID50為10-6.3/mL。

2.2 PEDV 感染Vero細胞N基因鑒定

以MOI=1的PEDV感染Vero-E6細胞48 h后觀察到明顯的細胞病變，與對照組相比，接毒組的細胞呈現(xiàn)出表面粗糙、明顯皺縮、細胞膜融合、細胞聚集成團形成合胞體及大量脫落的現(xiàn)象。提取細胞總RNA并將其反轉錄為cDNA，以其為模板，使用PEDV-N的特異性引物擴增。瓊脂糖凝膠電泳結果顯示在1 326 bp處出現(xiàn)目的條帶，與預期大小一致(圖1)。說明PEDV成功感染Vero-E6細胞，可用于后續(xù)試驗。

M. DL2000 DNA Marker；1，2，3. N基因產(chǎn)物；4. 陰性對照

2.3 PEDV感染Vero-E6細胞誘導細胞自噬

PEDV感染Vero-E6細胞0、6、12、24、36、48 h后，收集總蛋白，利用Western blot檢測自噬相關蛋白LC3 Ⅱ的表達情況。結果顯示，LC3Ⅱ蛋白的表達量隨著感染時間的增加而增多(圖2A)；進一步利用Image J對蛋白進行定量分析并繪制柱狀圖，結果顯示LC3Ⅱ蛋白相對表達量在48 h最高，且與對照組相比差異顯著(P<0.01)，見圖2B。

2.4 RT-qPCR檢測TRIM5α相對表達量

用RT-qPCR檢測PEDV感染Vero-E6細胞0、6、12、24、36、48 h時TRIM5α的表達情況，結果見圖3。在PEDV感染Vero-E6細胞0、12、24、48 h時，TRIM5α的相對表達量逐漸升高且在48 h時表達量最高，且與PBS對照組相比差異極顯著(P<0.01)。

與PBS組相比，**表示P<0.01，***表示P<0.001

2.5 干擾片段篩選及干擾后LC3Ⅱ蛋白的表達水平

轉染siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3后，RT-qPCR檢測TRIM5α表達情況的結果見圖4。圖4A顯示siRNA-2的干擾效率最高，干擾效率為 85%。Vero-E6細胞轉染siRNA-2后，待細胞匯合度達到80%接種病毒時，Western blot結果顯示，接毒48 h后自噬標志蛋白LC3Ⅱ的表達明顯降低，自噬受到抑制(圖4B)。

A. 未轉染siRNA-2的PEDV感染Vero-E6細胞試驗組；B. 轉染siRNA-2的PEDV感染Vero-E6細胞試驗組；C. PEDV N、ORF3 mRNA表達水平；D. 干擾組與對照組病毒滴度變化

2.6 干擾TRIM5α細胞病變觀察和N、ORF3基因表達檢測

Vero-E6細胞轉染siRNA-2后，待細胞匯合度達到80%后接毒，并在接毒后48 h觀察細胞病變，與未干擾組相比(圖5A)，干擾組細胞呈現(xiàn)出更加明顯的細胞皺縮、細胞膜融合、細胞聚集成團形成合胞體且存在大量脫落的現(xiàn)象(圖5B)。干擾TRIM5α后，通過RT-qPCR檢測N、ORF3基因的表達。結果顯示，2個基因的表達量均升高(圖5C)，且干擾組病毒滴度明顯高于對照組(圖5D)，表明PEDV感染Vero-E6細胞過程中干擾TRIM5α會促進PEDV復制。

3 討論

PEDV能使各個年齡段的豬只感染發(fā)病，尤其是對10日齡以內仔豬的感染最為嚴重，豬只發(fā)病率和死亡率可達100%[9]。我國從1973年開始出現(xiàn)有關PED的報道，1984年研究人員利用熒光標記的抗原和血清中和試驗鑒定了該病的抗原，從而確定了PED在我國出現(xiàn)[10]。由于PEDV的S基因的高突變率和跨國傳播極大地促進了該病毒突變與流行[11]。高毒力PEDV毒株傳播速度快、仔豬致死率高。亞洲經(jīng)典PEDV弱毒疫苗針對變異毒株的保護效果并不理想，所以新型PEDV毒株的高效疫苗的研發(fā)、新藥物靶點的尋找迫在眉睫。本試驗從蛋白水平出發(fā)，探究TRIM5α通過細胞自噬對PEDV復制的影響。

TRIM家族存在于所有動物體內，是包含了較多蛋白的一個相當大的家族，參與細胞周期、增殖、凋亡、分化、轉移、基因表達、轉錄調節(jié)、信號傳遞、損傷修復、炎癥免疫等幾乎一切生命活動的調控[12]。多項研究證明，TRIM家族分子可通過多種途徑調節(jié)自噬，包括調控自噬相關信號通路、調節(jié)自噬核心分子、作為自噬底物識別受體等[13]。TRIM5α 具有E3泛素連接酶活性[14]，存在于細胞質中，能夠抑制包括HIV-1在內的一些逆轉錄病毒的感染。TRIM蛋白參與了細胞的眾多生命進程，在細胞自噬和病毒感染中發(fā)揮重要作用。TRIM蛋白參與了病毒和非病毒誘導的自噬過程，其中TRIM5α在自噬過程中起關鍵作用[15]。TRIM5α發(fā)揮其限制活性是通過識別包裹病毒基因組RNA的衣殼蛋白，從而準確靶向病毒核心。自噬因子和TRIM5α、TRIM6、TRIM16、TRIM17、TRIM20、TRIM22、TRIM49和TRIM55之間的相互作用是緊密且廣泛的，并且涉及調節(jié)劑和效應物(ULK1、Beclin1、mAtg8s和p62/sequestosome1)。TRIM5α可以通過依賴于與mAtg8s相互作用的方式直接識別靶標的氨基酸序列來靶向逆轉錄病蛋白衣殼用于自噬降解[16]。在本試驗中干擾TRIM5α的內源性表達，可導致LC3Ⅱ的表達量降低，說明TRIM5α促進自噬發(fā)生。

自噬與病毒感染的關系錯綜復雜，既可促進一些正鏈RNA病毒的復制，也可抑制單純皰疹病毒和人類免疫缺陷病毒等病毒的復制，這與病毒的類型或宿主密切相關[17]。研究報道豬細小病毒感染ST細胞可誘發(fā)自噬并促進病毒的復制[18]。研究者用PEDV感染自噬誘導劑Rapamycin處理細胞，發(fā)現(xiàn)降低了PEDV滴度，而自噬抑制劑3-MA處理細胞后，提高了PEDV的滴度，表明自噬可以抑制PEDV的復制[19]。本研究證實PEDV感染Vero-E6過程中TRIM5α的干擾導致細胞自噬受到抑制，與此同時，當細胞自噬受到抑制時，PEDV的N、ORF3 2個基因的表達量上調且出現(xiàn)典型的細胞皺縮、細胞膜融合、細胞大量脫落等情況，初步證實了TRIM家族的抗病毒作用，同時為防控PED提供了實驗基礎。

綜上，本研究證實TRIM5α在PEDV感染Vero-E6細胞誘導細胞自噬中發(fā)揮促進作用，干擾TRIM5α后，LC3Ⅱ蛋白的表達量明顯降低，細胞自噬受到抑制，其主要機制是TRIM5α抑制PEDV在Vero-E6細胞中的復制。這一結果不僅從蛋白和mRNA水平上印證細胞自噬和PEDV感染的關系，同時也將TRIM家族和病毒復制建立聯(lián)系，為抗PEDV新型藥物靶點的開發(fā)奠定基礎。