卓瑪，錢炳旭，吳曉東，戴建君，薛峰*

(1. 教育部動物衛(wèi)生與食品安全國際聯(lián)合研究實驗室，江蘇 南京 210000；2. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)三亞學(xué)院，海南 三亞 572000；3. 中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東 青島 266000)

非洲豬瘟(African swine fever，ASF)是一種急性、高度傳染性的豬病，在世界范圍內(nèi)導(dǎo)致大量豬死亡，給全球養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失[1]。非洲豬瘟于1921年在肯尼亞被首次確診，1957至1972年傳入歐洲、美洲；2007年傳入歐亞接壤的格魯吉亞，隨后傳入俄羅斯并在高加索地區(qū)安家[2]；2012至2018年傳入烏克蘭、白俄羅斯、歐盟立陶宛、匈牙利等國家[3]；2018年8月以來在中國多地陸續(xù)發(fā)現(xiàn)疫情[4]。

由于目前尚無有效的非洲豬瘟疫苗[5-7]，因此非洲豬瘟的防控主要依靠嚴(yán)格的生物安全措施。已有研究顯示，CD2v和MGF是非洲豬瘟病毒(ASFV)2個毒力基因，敲除后ASFV的毒力顯著降低[8-10]，常用于作為ASFV減毒活疫苗缺失的靶點(diǎn)。目前，可鑒別檢測ASFV野毒株與基因缺失株的方法研究相對較少。為此，本研究選擇ASFV p72、CD2v、MGF110-14L基因，擬建立一種可鑒別ASFV野毒株與常見的疫苗候選缺失株的多重?zé)晒舛縋CR(qPCR)檢測方法，為ASFV的日常檢測提供便捷。當(dāng)前，我國針對ASFV的檢測依舊以O(shè)IE推薦的普通PCR和熒光定量PCR為主[11-14]。趙凱穎等[15]建立了ASFV實時熒光RAA檢測方法。但是，普通PCR或熒光定量PCR檢測方法存在一個明顯缺陷，即只能定性檢測病毒核酸，而不能有效鑒別樣品中是否具有感染性的活病毒。也就是說，只要樣品中存在一定量的病毒，不管是完整的具有感染性的活病毒還是通過加熱、紫外線等手段破外了遺傳物質(zhì)但保留了病毒核酸的滅活病毒，當(dāng)使用普通PCR或熒光定量PCR檢測時均會對其進(jìn)行擴(kuò)增。因此，迫切需要一種可以鑒別ASFV活/死病毒的鑒別檢測方法。準(zhǔn)確鑒別臨床樣品或飼料中是否存在具有感染性的活病毒，對非洲豬瘟的防控具有重要意義。隨著科技的不斷發(fā)展，出現(xiàn)了很多可鑒別檢測活/死微生物的檢測方法，其中包括流式細(xì)胞分選技術(shù)、拉曼光譜檢測方法、病毒分離培養(yǎng)等方法。董振華等[16]利用分離培養(yǎng)與拉曼光譜技術(shù)相結(jié)合，監(jiān)測區(qū)分沙門菌為死菌還是活菌；Schaad[17]利用Bio-PCR方法達(dá)到檢測活菌的目的；Lin等[18]通過脫氧膽酸鈉-單疊氮丙啶-qPCR快速準(zhǔn)確地檢測蝦中的活副溶血性弧菌。

疊氮溴化丙錠(PMA)是一種新型的核酸結(jié)合染料，能夠穿過細(xì)胞膜不完整的細(xì)胞，經(jīng)過暗孵育以及曝光處理后，PMA與DNA結(jié)合形成穩(wěn)定的共價鍵，從而修飾細(xì)胞死亡后暴露出來的DNA分子[19-21]。通常將PMA與qPCR結(jié)合，可同時達(dá)到定量和精確檢測感染性病毒與非感染性病毒(活/死病毒)核酸的目的。PMA在食品以及植物病原菌檢測活菌研究中已被廣泛應(yīng)用，如于璇等[22]利用PMA與qPCR技術(shù)相結(jié)合，建立了十字花科黑斑病菌(Pseudomonassyringaepv.maculicola)活菌的檢測方法。本研究將PMA與qPCR技術(shù)相結(jié)合，建立了一種ASFV多重PMA-qPCR檢測方法，既可實現(xiàn)單管鑒別ASFV野毒株與基因缺失株又可以同時鑒別檢測ASFV活/死病毒，為臨床檢測ASFV帶來更多的便捷。

1 材料與方法

1.1 病毒株、載體和樣本

豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAMs)、ASFV、豬細(xì)小病毒(PPV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、偽狂犬病毒(PRV)、豬流行腹瀉病毒(PEDV)、口蹄疫病毒(FMDV)、豬德爾塔冠狀病毒(PDCoV)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、塞內(nèi)卡病毒(SVA)、pET-28a載體和23份臨床陽性樣品，均由中國動物衛(wèi)生流行病學(xué)中心提供。

1.2 引物、探針的設(shè)計與合成

根據(jù)ASFV China/2018/Anhui毒株序列，利用Bio Edit軟件分析核酸序列，應(yīng)用Snape Gene針對ASFV p72、CD2v、MGF1110-14L基因的保守序列分別設(shè)計特異性引物與探針(表1)。引物和探針均由通用(安徽)生物技術(shù)有限公司合成并純化。

表1 引物與探針序列

表2 多重PMA-qPCR與普通qPCR方法檢測實際樣品

1.3 ASFV多重qPCR方法的建立

1.3.1 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建與鑒定

ASFV China/2018/Anhui毒株由中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心提供并保存，利用病毒核酸提取試劑盒提取ASFV基因組DNA并以其為模板，利用普通PCR擴(kuò)增目的基因片段。PCR反應(yīng)體系：Green Mix 12.5 μL；上下游引物各1 μL；ASFV DNA 2 μL；去離子水補(bǔ)充至25 μL總體積。反應(yīng)程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。

將ASFV(p72、CD2v、MGF110-14L)基因的PCR產(chǎn)物與pClone007載體連接、轉(zhuǎn)化至DH5ɑ感受態(tài)細(xì)胞，氨芐固體培養(yǎng)基上過夜培養(yǎng)，菌液PCR鑒定正確后送至擎科(南京)生物技術(shù)有限公司測序，命名為pClone007- p72、pClone007-CD2v、pClone007-MGF110-14L。提取質(zhì)粒，利用酶標(biāo)儀測定質(zhì)粒濃度，計算拷貝數(shù)。 去離子水將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍連續(xù)稀釋，稀釋至質(zhì)粒終濃度為1×1012～1×101copies/μL，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 多重qPCR引物、探針、退火溫度優(yōu)化

采用方陣法優(yōu)化引物、探針濃度，總體積為25 mL，其中2×PerfectStart Ⅱ Probe qPCR Super Mix 10 μL，引物F和R(10 μmol/L)各自加0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 μL，探針P(10 μmol/L)加0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 μL，Pclone007- p72、Pclone007-CD2v、Pclone007-MGF110-14L重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品各2 μL，混勻后作為模板，去離子水補(bǔ)充至25 μL。使用優(yōu)化好的引物和探針體系優(yōu)化退火溫度(56～64 ℃)。

1.3.3 特異性試驗

ASFV pClone007- p72、pClone007-CD2v、pClone007-MGF110-14L、PPV、PRRSV、PRV、CSFV、PEDV、FMDV、PDCoV、PCV-2、SVA病毒核酸為模板，去離子水為陰性對照，按優(yōu)化好的反應(yīng)體系進(jìn)行多重qPCR擴(kuò)增，以驗證該方法的特異性。

1.3.4 靈敏度試驗

分別以10倍連續(xù)稀釋的(102～108copies/μL)pClone007-p72、pClone007-CD2v、pClone007-MGF110-14L質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品混合液作為模板，去離子水為陰性對照，Ct值≥35判定為陰性，進(jìn)行多重qPCR擴(kuò)增，以質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品稀釋倍數(shù)為橫坐標(biāo)，Ct值為縱坐標(biāo)，驗證該方法的最低檢出限。

1.4 PMA處理條件的優(yōu)化

1.4.1 活/滅活病毒懸液制備

將ASFV感染PAMs細(xì)胞后，收集上清液，抽提病毒DNA，計算拷貝數(shù)。將病毒原液制備成1×106copies/μL，制得ASFV病毒懸液，另取1×106copies/μL ASFV病毒懸液在100 ℃下滅活15 min后制得ASFV滅活病毒懸液。

1.4.2 抑制滅活病毒擴(kuò)增不抑制活病毒擴(kuò)增的最適PMA濃度優(yōu)化

各取1×106copies/μL ASFV活/滅活病毒懸液，分別加入不同質(zhì)量PMA使其終質(zhì)量濃度為0、5、10、15、20、25 μg/mL，避光孵育15 min(后續(xù)進(jìn)行優(yōu)化)，利用鹵素?zé)羝毓?5 min(后續(xù)進(jìn)行優(yōu)化)，光照強(qiáng)度設(shè)為60 W(后續(xù)進(jìn)行優(yōu)化)，提取DNA后進(jìn)行多重PMA-qPCR反應(yīng)。

1.4.3 暗孵育時間優(yōu)化

選取1×106copies/μL ASFV滅活病毒懸液，取6份200 μL滅活病毒懸液加入PMA混勻使其終質(zhì)量濃度為10 μg/mL，避光孵育0、5、10、15、20、25 min，曝光15 min(后續(xù)繼續(xù)優(yōu)化)，光照強(qiáng)度60 W，提取DNA后進(jìn)行多重PMA-qPCR反應(yīng)。

1.4.4 光照時間優(yōu)化

選取1×106copies/μL ASFV滅活病毒懸液，取6份200 μL滅活病毒懸液，加入PMA混勻使其終質(zhì)量濃度為10 μg/mL，避光孵育10 min，光照0、5、10、15、20、25 min，光照強(qiáng)度60 W (后續(xù)優(yōu)化)，提取DNA后進(jìn)行多重PMA-qPCR反應(yīng)。

1.4.5 光照強(qiáng)度優(yōu)化

選取1×106copies/μL ASFV滅活病毒懸液，取6份200 μL滅活病毒懸液加入PMA混勻使其終濃度10 μg/mL，避光孵育10 min，曝光15 min，光照強(qiáng)度0、20、40、60、80、100 W，提取DNA后進(jìn)行多重PMA-qPCR反應(yīng)。

1.5 多重PMA-qPCR的靈敏度與普通qPCR對比

取10倍梯度連續(xù)稀釋的活病毒懸液(101～108copies/μL)各200 μL，按優(yōu)化好的PMA條件處理，提取DNA后進(jìn)行多重PMA-qPCR反應(yīng)，另設(shè)不加PMA對照組，即普通qPCR反應(yīng)，以病毒稀釋倍數(shù)為橫坐標(biāo)，Ct值為縱坐標(biāo)。Ct值小于35即可判定為陽性。

1.6 多重PMA-qPCR方法檢測人工感染樣品

為驗證PMA對ASFV非感染性病毒擴(kuò)增產(chǎn)生抑制效果，將1.4.1方法中制備的1×106copies/μL ASFV活/滅活病毒懸液，各取1 mL加入4份ASFVp72基因臨床陰性樣品(Ct值=42)中，經(jīng)PMA處理后進(jìn)行多重PMA-qPCR檢測，分別驗證人工感染的ASFV活/滅活病毒樣品中活病毒存活數(shù)量，同時采用普通qPCR反應(yīng)進(jìn)行對比。

1.7 多重PMA-qPCR方法檢測實際樣品

以中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心提供的23份陽性臨床樣本，各取200 μL制備病毒懸液，利用OIE推薦的普通qPCR方法與本研究建立的多重PMA-qPCR檢測方法，分別對23份臨床樣本進(jìn)行驗證。同時，將這23份樣品100 ℃滅活15 min后按照上述兩種方法分別檢測，并比較其檢測結(jié)果，計算多重PMA-qPCR方法檢測活病毒的準(zhǔn)確率。

2 結(jié)果與分析

2.1 多重qPCR檢測方法建立

2.1.1 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建與鑒定

使用ASFV DNA為模板，利用設(shè)計好的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，擴(kuò)增后獲得與預(yù)期大小一致的目的基因片段，依次為p72(158 bp)、CD2v(124 bp)、MGF110-14L(156 bp)。將目的片段回收純化后克隆于pClone007載體上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pClone007- p72、pClone007-CD2v、pClone007-MGF110-14L，重組質(zhì)粒經(jīng)菌落PCR鑒定和測序鑒定正確，測得重組質(zhì)粒濃度分別為193、172.4和200 ng/μL，換算成拷貝數(shù)分別為11.4×1011、13.2×1011和3×1011copies/mL，作為多重qPCR的標(biāo)準(zhǔn)品。

2.1.2 多重?zé)晒舛縋CR引物、探針、退火溫度優(yōu)化

經(jīng)優(yōu)化后，確定反應(yīng)體系為25 μL：2×PerfectStart II Probe qPCR Super Mix 10 μL；引物濃度分別為p72 F和R(10 μmol/L)各加0.4 μL，p72 P(10 μmol/L)加0.2 μL，CD2v F和R(10 μmol/L)各加0.4 μL，CD2v P(10 μmol/L)加0.3 μL，MGF110-14L F和R(10 μmol/L)各加0.3 μL，MGF110-14L P(10 μmol/L)加0.6 μL；3個基因的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品各3 μL混勻后作為模板；去離子水補(bǔ)充至25 μL總體積。擴(kuò)增溫度為60 ℃，整個擴(kuò)增包括45個循環(huán)時qPCR具有良好的擴(kuò)增曲線。

2.1.3 特異性試驗

按照1.3.3驗證該方法的特異性，結(jié)果顯示，該方法對ASFV- p72、ASFV-CD2v、ASFV-MGF110-14L重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增結(jié)果為陽性，其余結(jié)果均為陰性(圖1)。表明本研究建立的方法具有較強(qiáng)的特異性。

1. p72基因；2. CD2v基因；3. MGF110-14L基因；4. 陰性對照和PPV、PRRSV、PRV、CSFV、PEDV、FMDV、PDCoV、PCV-2、SVA病毒核酸

2.1.4 敏感性試驗

將pClone007- p72、pClone007-CD2v、pClone007-MGF110-14L3個重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品原液制備成3×108copies/mL，各取10 μL混勻后連續(xù)稀釋，Ct值≥35為陰性。結(jié)果顯示，多重qPCR方法的最低檢測線為102copies/mL(圖2)。表明本研究建立的多重qPCR檢測方法有較高的靈敏性。

A：1～8. 101～108copies/mL的Pclone007-p72重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品；N.陰性對照；B：1～8. 101～108copies/mL的Pclone007-CD2v重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品；N.陰性對照； C：1～8. 101～108copies/mL的Pclone007-MGF110-14L重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品；N.陰性對照

2.2 PMA處理條件的優(yōu)化

2.2.1 PMA處理濃度優(yōu)化結(jié)果

選取1.4.1方法中制備好的1×106copies/μL ASFV活/滅活病毒懸液，各取200 μL活/滅活病毒懸液分別加入PMA終濃度為0、5、10、15、20、25 μg/mL，提取DNA后進(jìn)行多重PMA-qPCR擴(kuò)增。圖3A結(jié)果所示，活病毒懸液中隨著PMA質(zhì)量濃度的增大Ct值稍有波動但不明顯，當(dāng)加入PMA終質(zhì)量濃度為10 μg/mL時，不抑制活病毒的擴(kuò)增。圖3B結(jié)果所示，滅活病毒懸液中隨著PMA質(zhì)量濃度的增大，Ct值也逐漸上升，抑制擴(kuò)增效果越明顯，當(dāng)加入PMA終質(zhì)量濃度為10 μg/mL時，Ct值趨于平衡，繼續(xù)增加PMA終質(zhì)量濃度對Ct值的影響不大。因此，選擇PMA終質(zhì)量濃度10 μg/mL為本研究最適PMA處理濃度。

A.活病毒懸液添加不同PMA濃度；B.死病毒懸液添加不同PMA濃度

A.PMA暗孵育時間優(yōu)化；B.PMA光照時間優(yōu)化；C.PMA曝光強(qiáng)度優(yōu)化

A. p72基因(PMA-qPCR)；B. CD2v基因(PMA-qPCR)；C. MGF110-14L基因(PMA-qPCR)；D. p72基因(普通qPCR)

A. 普通qPCR檢測4份人工感染的活病毒樣品；B. 多重PMA-qPCR 檢測4份人工感染的活病毒樣品；C. 普通qPCR檢測4份人工感染的滅活病毒樣品；D. 多重PMA-qPCR檢測4份人工感染的滅活病毒樣品

2.2.2 暗孵育時間優(yōu)化

取1×106copies/μL ASFV滅活病毒懸液200 μL，加入PMA混勻使其終質(zhì)量濃度為10 μg/mL，避光孵育0、5、10、15、20、25 min，光照強(qiáng)度60 W，光照15 min，進(jìn)行多重PMA-qPCR。結(jié)果顯示，當(dāng)避光孵育10 min時，Ct值達(dá)到37，繼續(xù)延長時間對Ct值的影響不大(圖4A)。因此，選擇最適的暗孵育時間為10 min。

2.2.3 光照時間優(yōu)化

取1×106copies/μL ASFV滅活病毒懸液200 μL，加入PMA混勻使其終質(zhì)量濃度為10 μg/mL，避光孵育10 min，光照時間0、5、10、15、20、25 min，光照強(qiáng)度60 W，進(jìn)行多重PMA-qPCR。結(jié)果顯示，當(dāng)光照15 min時，Ct值為37，隨著光照時間的延長Ct值并無明顯變化(圖4B)。為節(jié)省試驗時間不必繼續(xù)延長試驗時間，因此選擇最理想的曝光時間為15 min。

2.2.4 光照強(qiáng)度優(yōu)化

取6份1×106copies/μL ASFV滅活病毒懸液200 μL，加入PMA使其終質(zhì)量濃度為10 μg/mL，避光孵育10 min，曝光15 min，光照強(qiáng)度0、20、40、60、80、100 W，進(jìn)行多重PMA-qPCR。結(jié)果顯示，當(dāng)鹵素?zé)艄庹諒?qiáng)度為40 W時，達(dá)到抑制ASFV滅活病毒懸液擴(kuò)增的理想條件(圖4C)。

通過對PMA濃度、暗孵育時間、曝光時間以及曝光強(qiáng)度進(jìn)行優(yōu)化后，確定了PMA終質(zhì)量濃度10 μg/mL、暗孵育10 min、光照強(qiáng)度40 W、光照15 min時PMA實現(xiàn)對ASFV活病毒擴(kuò)增不受抑制，同時抑制滅活病毒擴(kuò)增的多重PMA-qPCR理想效果。

2.3 多重PMA-qPCR的靈敏度

為驗證該方法的靈敏性，本研究利用多重PMA-qPCR與普通qPCR方法進(jìn)行靈敏度對比。結(jié)果顯示，多重PMA-qPCR和普通qPCR方法的靈敏度均為102copies/μL。

多重PMA-qPCR。p72：y=3.158x+3.742 7，R2=0.999(圖5A)；CD2v：y=0.148x+3.71，R2=0.991(圖5B)；MGF110-14L：y=0.152 7x+3.764 3，R2=0.993(圖5C)。普通qPCR。p72：y=3.414x+1.461，R2=0.999(圖5D)。綜上所述，PMA對活病毒的擴(kuò)增幾乎無影響。

2.4 多重PMA-qPCR方法檢測人工感染樣品

利用多重PMA-qPCR方法與普通qPCR方法驗證4份人工感染的ASFV陽性樣品，結(jié)果如圖6所示。當(dāng)樣品中全為ASFV活病毒時，多重PMA-qPCR結(jié)果與普通qPCR中ASFVp72基因的Ct值幾乎一致，多重PMA-qPCR檢測p72基因Ct值分別為26.1、26.75、26.3、26.75；普通qPCR檢測p72基因Ct值分別為25.4、25.4、25.4、25.4。多重PMA-qPCR方法檢測CD2v、基因Ct值分別為26.3、26.7、26.3、26.1；檢測MGF110-14L基因的Ct值分別為26.3、26.5、26.3、26.3。統(tǒng)計學(xué)差異性分析顯示，多重PMA-qPCR檢測3個基因之間Ct值無顯著差別(圖6A，圖6B)。當(dāng)樣品中均為ASFV滅活病毒時，普通qPCR反應(yīng)仍能測得p72基因Ct值為28.0、28.0、28.0、28.0(圖6C)，而經(jīng)PMA處理的多重PMA-qPCR方法測得p72、CD2v、MGF110-14L 3個基因Ct值，p72基因Ct值為36.5、36.8、36.4、36.7；CD2V基因Ct值為35.5、36.1、36.3、36.5；MGF110-14L基因Ct值為36.3、36.5、36.2、36.3(圖6D)，符合臨床陰性樣品標(biāo)準(zhǔn)檢測線(Ct值≥35)，說明滅活病毒的DNA被PMA抑制，不能繼續(xù)擴(kuò)增。顯然，相比于普通qPCR方法本研究建立的多重PMA-qPCR方法更能有效區(qū)分樣品中的ASFV活/滅活病毒。

2.5 多重PMA-qPCR方法檢測實際樣品

利用多重PMA-qPCR與基于p72基因建立的普通qPCR方法對23份陽性樣本以及對應(yīng)23份滅活樣本進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，普通qPCR方法對感染性活病毒樣品與加熱滅活的非感染性死病毒樣品對p72基因的陽性檢出率均為100%；本研究建立的多重PMA-qPCR方法只能在感染性活病毒樣品檢出p72基因，不能在加熱滅活處理的非感染性死病毒樣品檢出p72基因。表明，本研究建立的多重PMA-qPCR方法能有效區(qū)分臨床樣品中的ASFV感染性與非感染性病毒(活/死病毒)。此外，對23份臨床樣品的多重PMA-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，CD2V和MGF110-14L基因也均為100%陽性(圖略)，說明臨床樣品中未發(fā)現(xiàn)這兩個基因的缺失株。

3 討論

非洲豬瘟是由ASFV感染引起的豬的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，具有跨國跨地區(qū)的傳播能力，是養(yǎng)豬業(yè)的頭號殺手[23]。中國是養(yǎng)豬大國，ASFV感染導(dǎo)致我國養(yǎng)豬業(yè)受到嚴(yán)重的影響[24]，當(dāng)務(wù)之急是建立完善的ASFV檢測體系，做到高速、高效、精準(zhǔn)地檢測ASFV，使其病毒扼殺在傳播初期。

目前，我國ASFV的檢測仍以普通PCR和熒光定量PCR為主[25]。然而，這兩種方法不能有效區(qū)分樣本中的感染性與非感染性病毒[26]。PMA-qPCR技術(shù)在植物病原菌檢測活菌的研究中被廣泛應(yīng)用[27-28]，研究發(fā)現(xiàn)PMA能實現(xiàn)在不干擾活菌擴(kuò)增的條件下實現(xiàn)對死菌擴(kuò)增的抑制，這一現(xiàn)象彌補(bǔ)了普通PCR和熒光定量PCR的不足，很大程度上提高了病毒檢測的準(zhǔn)確性。

本研究建立的多重PMA-qPCR方法，當(dāng)加入PMA濃度為10 μg/mL、暗孵育10 min、光照強(qiáng)度40 W、光照15 min時PMA能夠抑制滅活病毒核酸擴(kuò)增且對活病毒核酸擴(kuò)增無影響，表明該方法能有效區(qū)分非洲豬瘟感染性活病毒與非感染性死病毒。通過對比普通qPCR與PMA-qPCR的靈敏度可知，兩者的靈敏度均為102copies/μL；多重PMA-qPCR與普通qPCR方法驗證人工感染樣品，結(jié)果顯示，當(dāng)樣品中全為ASFV活病毒時，多重PMA-qPCR結(jié)果與普通qPCR中ASFVp72基因的Ct差別不大；當(dāng)樣品中均為ASFV滅活病毒時，普通qPCR反應(yīng)仍能測得p72基因，而經(jīng)PMA處理的多重PMA-qPCR方法測得p72、CD2v、MGF110-14L基因Ct值，符合臨床陰性樣品標(biāo)準(zhǔn)檢測線(Ct值≥35)，說明滅活病毒的DNA被PMA抑制，不能繼續(xù)擴(kuò)增；將PMA-qPCR方法用于23份實際非洲豬瘟陽性樣品的檢測，結(jié)果顯示，該方法檢測臨床樣品中帶有感染性活病毒的準(zhǔn)確率為100%，說明多重PMA-qPCR方法能有效區(qū)分臨床樣品中具有感染性的非洲豬瘟活病毒。由于本研究建立的多重PMA-PCR方法還能檢出CD2V和MGF110-14L基因，而這兩個基因是ASFV的毒力基因，常用于構(gòu)建ASFV疫苗缺失株的靶點(diǎn)；因此，多重PMA-qPCR方法有望用于野毒株與疫苗缺失株鑒別檢測。

綜上本研究建立的多重PMA-qPCR檢測方法，具有特異性強(qiáng)和靈敏度高的特點(diǎn)，可高效檢測ASFV活病毒，彌補(bǔ)了常規(guī)分子生物學(xué)檢測方法的缺陷，解決了目前臨床ASFV檢測方法的不足，給養(yǎng)豬業(yè)帶來更多的便捷，對ASFV早期診斷具有重大意義。