文哲，王忠星，諸葛祥凱，戴建君

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210095)

禽致病性大腸桿菌(avian pathogenicEscherichiacoli，APEC)是一種主要的禽細(xì)菌性病原，對養(yǎng)禽業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1]。APEC屬于腸道外致病性大腸桿菌(ExPEC)，可以導(dǎo)致禽局部或多系統(tǒng)混合感染，如敗血癥、輸卵管炎、肺炎、關(guān)節(jié)炎、腹膜炎、卵黃囊感染和呼吸道感染等[2]。APEC可以通過被污染的家畜產(chǎn)品傳播給人，具有人畜共患的潛力[3]。人源ExPEC，如尿道致病性大腸桿菌(UPEC)和致新生兒腦膜炎大腸桿菌(NMEC)，與APEC具有遺傳相似性和相同的毒力基因[4]。因此深入探究APEC的致病性、耐藥性和傳播機(jī)制，對全球公共衛(wèi)生安全具有至關(guān)重要的意義。

溶血素是致病性細(xì)菌中的一種主要毒力因子，在許多細(xì)菌中都有發(fā)現(xiàn)[5]。這些分子因為具有溶解紅細(xì)胞的能力而被命名，但近年研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌溶血素還能損傷甚至致死多種有核細(xì)胞和血小板，如單核細(xì)胞、粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、心肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等，故又稱為細(xì)胞溶素(Cytolysin)，其在參與細(xì)菌致病過程中發(fā)揮了重要作用[6]。HlyE(又稱ClyA或SheA)最早在大腸桿菌K12中發(fā)現(xiàn)，屬于孔道形成毒素，不屬于RTX家族[5，7]。HlyE基因位于大腸桿菌染色體骨架上，因此在大腸桿菌中廣泛分布。然而，由于HlyE基因的表達(dá)受到組蛋白樣類核結(jié)構(gòu)蛋白(H-NS)的抑制，它的溶血活性不能在標(biāo)準(zhǔn)血平板上觀察得到[8]。但是，Murase等[9]發(fā)現(xiàn)在腸出血性大腸桿菌(EHEC)O55/O157菌株厭氧培養(yǎng)在含有5%脫纖維綿羊血平板上時HlyE具有溶血活性；Oscarsson等[5]發(fā)現(xiàn)HlyE能在紅細(xì)胞上形成3.0～3.5 nm的微孔，但是用膽固醇預(yù)處理后的HlyE抑制了微孔的形成，表明HlyE能與膽固醇結(jié)合；Wai等[10]發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的外膜囊泡(OMVs)中包含HlyE蛋白，HlyE在OMVs中形成低聚物孔集合體，通過OMVs轉(zhuǎn)運到細(xì)胞內(nèi)，從而對細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用。Faucher等[11]在沙門菌中也發(fā)現(xiàn)了HlyE，它對上皮細(xì)胞具有毒性作用，感染腸道時能溶解上皮細(xì)胞，從而進(jìn)入深層組織，且這種毒性作用是由操縱子PhoP調(diào)控的。

AlbrechtL等[12]發(fā)現(xiàn)僅部分致病性大腸桿菌攜帶功能性的HlyE基因，其余攜帶HlyE的突變體衍生物或非功能性HlyE片段。我們前期在APEC中發(fā)現(xiàn)有HlyE突變體(HlyE-V)基因，其突變體和本體相比氨基酸具有77%的同源性[13]，功能未知。因此，本研究想探究在APEC中HlyE突變體的致病作用。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌株及細(xì)胞

禽致病性大腸桿菌CBE59(血清型O145、序列型ST117、ECOR G群，對慶大霉素、氯霉素、氨芐西林等抗生素敏感)、質(zhì)粒pKD46(氨芐西林抗性，Ampr)、pKD3(氯霉素抗性，Chlr)、pCP20(Ampr，Chlr)、pSTV28、禽源巨噬細(xì)胞(HD11)，均由本實驗室保存。

1.2 主要試劑和儀器

DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液(美國，BD公司)，小鼠抗CBE59全菌多抗(自制)，5-異硫氰酸酯(FITC)標(biāo)記山羊抗鼠二抗、鬼筆環(huán)肽(美國，AAT Bioquest公司)，CCK8檢測試劑(南京奇博能生物科技有限公司)，Green Tap Mix(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)，胎牛血清(FBS)(美國，Gibco公司)。NanoDrop紫外可見分光光度計(美國，Thermo Fisher公司)，電穿孔儀(美國，Bio-Rad公司)，倒置熒光顯微鏡(德國，蔡司集團(tuán))。

1.3 HlyE缺失株、回補(bǔ)株的構(gòu)建

參考Datsenko等[14]建立的Red兩步同源重組法構(gòu)建HlyE-V缺失株。首先將質(zhì)粒pKD46電轉(zhuǎn)入CBE59菌株中，通過氨芐平板篩選陽性菌株CBE59-pKD46，接著以氯霉素抗性pKD3質(zhì)粒為模板，利用表1中含有HlyE-V基因上下游50 bp同源臂序列和pKD3 FRT上下游20 bp序列的HlyE-V-que-F、HlyE-V-que-R引物通過PCR擴(kuò)增合成基因打靶片段，將PCR產(chǎn)物通過二次膠回收。在200 Ω、25 μF、1 800 V的條件下將打靶片段電轉(zhuǎn)化入CBE59-pKD46的感受態(tài)細(xì)胞中，在30 ℃搖床培養(yǎng)2～3 h后取出，6 000 r/min離心5 min，棄去大部分上清液，重懸菌體沉淀，均勻涂布在具有Chlr抗性的LB瓊脂平板，置于28 ℃培養(yǎng)箱過夜孵育，第2天挑取單菌落，用表2中引物HlyE-V-JD-F、HlyE-V-JD-R鑒定。再將篩選出來的陽性菌株以同樣的方法電轉(zhuǎn)化入pCP20質(zhì)粒，37 ℃培養(yǎng)去掉Chlr抗性片段，最后42 ℃培養(yǎng)去除pCP20質(zhì)粒。最后通過測序確認(rèn)HlyE-V基因是否敲除成功，缺失后的菌株命名為CBE59ΔHlyE-V。將pSTV28-HlyE-V電轉(zhuǎn)入CBE59ΔHlyE-V中構(gòu)建回補(bǔ)株CBE59CΔHlyE-V。

表1 HlyE-V缺失及鑒定引物

表2 菌株CBE59、CBE59ΔHlyE-V和CBE59CΔHlyE-V對雛雞的LD50測定

1.4 生長曲線的測定

對野生株CBE59、缺失株CBE59ΔHlyE-V和回補(bǔ)株CBE59CΔHlyE-V的生長曲線進(jìn)行測定。將上述3株菌在LB平板上劃線，挑取單菌落轉(zhuǎn)接于5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床過夜培養(yǎng)后將菌液離心(4 ℃，5 000g)10 min，棄上清液，用1×PBS溶液洗滌2次后，將菌液OD600值調(diào)整為1.0，按照1∶100重新轉(zhuǎn)接于50 mL的錐形瓶中培養(yǎng)至平臺期。期間每隔1 h測定其OD600值，進(jìn)行3次平行試驗，整理數(shù)據(jù)并用GraphPad Prism 7.0繪制生長曲線。

1.5 溶血活性測定

配制含有5%脫纖維綿羊血平板，將CBE59、CBE59ΔHlyE-V和CBE59CΔHlyE-V按1∶100的比例接種到1 mL LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃搖床震蕩培養(yǎng)至對數(shù)期，用1×PBS洗滌2遍，將菌液OD600值稀釋至0.8，取1.0 μL細(xì)菌懸浮液到血平板上，將平板置于37 ℃厭氧培養(yǎng)箱中孵育24 h，最后觀察血平板上是否形成溶血環(huán)[15]。

1.6 動物試驗

1.6.1 半數(shù)致死劑量(LD50)的測定

將7日齡雛雞隨機(jī)分為15組，每組10只。將CBE59、CBE59ΔHlyE-V和CBE59CΔHlyE-V于LB平板上劃線，37 ℃培養(yǎng)過夜，挑選單菌落轉(zhuǎn)接至LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對數(shù)期，將菌液離心，棄上清液收集菌體沉淀，用4 ℃預(yù)冷的1×PBS洗滌2遍，重懸沉淀，用1×PBS將菌株OD600值稀釋為1.0后，進(jìn)行10×倍比稀釋至濃度為105～109CFU/mL。將稀釋好的野生株CBE59攻毒雛雞，每只0.1 mL，攻毒劑量分別為104、105、106、107、108CFU/只，缺失株和回補(bǔ)株處理方法同上。用菌感染7日內(nèi)觀察雛雞的生長狀況并記錄死亡結(jié)果，采用軟件SPSS計算LD50[16]。

1.6.2 組織切片制作與觀察

采用頸椎脫臼法處死雛雞，取感染雛雞肺臟和肝臟，用10%的甲醛固定。常規(guī)制作病理切片，HE染色染色后封片觀察。

1.7 胞內(nèi)存活試驗

取HD11細(xì)胞1×105CFU/mL加至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。將CBE59、CBE59ΔHlyE-V和CBE59CΔHlyE-V培養(yǎng)至對數(shù)期，離心收集菌體沉淀并用PBS緩沖液洗3遍，用無血清DMEM重懸菌體沉淀，以感染比(MOI)為1∶100將菌液加入細(xì)胞培養(yǎng)孔，每株菌3組平行孔，1組對照(不加菌液)。300g離心5 min，沉淀細(xì)菌，將孔板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。在感染HD11細(xì)胞3 h后，將培養(yǎng)基吸去，用1×PBS緩沖液洗滌未黏附的細(xì)菌，在DMEM中按1∶1 000加入慶大霉素，并將抗性DMEM培養(yǎng)基用巴氏吸管均勻加入每孔中，放37 ℃的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1 h后，在不同時間點(2、4、6、8、10、12、14和16 h)取出24孔板，將DMEM培養(yǎng)基吸去，用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞3遍，然后每孔加入200 μL 0.1% Triton X-100裂解細(xì)胞，用PBS進(jìn)行倍比稀釋，取100 μL均勻涂布于LB平板上。37 ℃培養(yǎng)過夜后進(jìn)行細(xì)菌計數(shù)。

1.8 免疫熒光標(biāo)記試驗

為了直觀對比野生株CBE59、缺失株CBE59ΔHlyE-V和回補(bǔ)株CBE59CΔHlyE-V在HD11細(xì)胞內(nèi)的存活能力，進(jìn)行了免疫熒光標(biāo)記試驗。將HD11細(xì)胞均勻鋪在細(xì)胞Dish中，待細(xì)胞貼壁，在 HD11細(xì)胞dish中以10∶1感染比(MOI)加入總量 5×108CFU的CBE59、CBE59ΔHlyE-V和CBE59CΔHlyE-V，在37 ℃ CO2培養(yǎng)箱孵育3 h后，棄掉培養(yǎng)液，用PBS清洗3遍，在DMEM中按1∶1 000加入濃度為100 mg/mL慶大霉素，將抗性DMEM各加1 mL到Dish中，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱1 h，以殺死未黏附細(xì)胞的細(xì)菌。拿出Dish后，用真空泵吸去培養(yǎng)基，用PBS洗滌Dish 3遍，每次5 min。用4 ℃預(yù)冷的4%多聚甲醛固定細(xì)胞10 min后，用PBS洗3遍，每次5 min，再加入0.5%的Triton X-100通透細(xì)胞15 min，PBS洗3遍，每次5 min。用含5% BSA的PBS室溫封閉30 min，棄液。用1%BSA按1∶500比例稀釋小鼠抗CBE59全菌多抗，加入到每個Dish中，室溫孵育 2 h，PBS洗滌3遍，1∶100的比例加入 2. 5% BSA 稀釋的異硫氰酸熒光素 (FITC)標(biāo)記的羊抗鼠二抗，同時1∶500加入鬼筆環(huán)肽，37 ℃避光孵育45 min后取出，按1∶100的比例加入DAPI，作用5 min后洗滌3遍。在熒光顯微鏡下觀察(嚴(yán)格避光)。

1.9 CCK8細(xì)胞毒性試驗

在96孔板中加入100 μL HD11細(xì)胞懸液，將培養(yǎng)板放入37 ℃ CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。然后向96孔板中加入10 μL野生株CBE59、缺失株CBE59ΔHlyE-V和回補(bǔ)株CBE59CΔHlyE-V菌液，每組3個平行，1個對照(不加菌液)。300 r/min水平離心5 min。將96孔板放入培養(yǎng)箱中孵育0.5、1.5、4、8、16、24后，向每孔加入10 μL CCK8，將培養(yǎng)板放在37 ℃ CO2培養(yǎng)箱孵育1～4 h，用酶標(biāo)儀測定在波長450 nm處的吸光值。細(xì)胞存活率計算方法為：[(樣品孔OD值-空白孔OD值)/(陰性孔OD值-空白孔OD值)]×100%。

1.10 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

所有試驗均重復(fù)進(jìn)行了3次，使用GraphPad Prism 7.00對數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖，數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，利用t檢驗比較了各菌株胞內(nèi)存活、細(xì)胞毒性等試驗數(shù)據(jù)的差異。P<0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。*表示P<0.05；**表示P<0.01；***表示P<0.001；****表示P<0.000 1。

2 結(jié)果

2.1 生長曲線的測定

為了驗證HlyE-V基因缺失后是否影響了CBE59的生長，對野生株CBE59、缺失株CBE59ΔHlyE-V和回補(bǔ)株CBE59CΔHlyE-V進(jìn)行了生長曲線測定，結(jié)果見圖1。野生株和缺失株在平臺期的OD600值相近，數(shù)值為2.5～3.0，回補(bǔ)株在平臺期OD600值稍高，數(shù)值為3.0～3.5，表明缺失HlyE-V基因不影響CBE59的生長。

圖1 CBE59、CBE59ΔHlyE-V、CBE59CΔHlyE-V在LB培養(yǎng)基中的生長速度

2.2 溶血活性

在無氧情況下檢測了野生株CBE59、缺失株CBE59ΔHlyE-V和回補(bǔ)株CBE59CΔHlyE-V在脫纖維綿羊血平板上的溶血活性，3種菌株在血平板上都不能形成溶血環(huán)，表明HlyE-V不能產(chǎn)生溶血活動。

2.3 LD50測定和組織學(xué)觀察

為了探究HlyE-V對APEC菌株CBE59毒力的影響，對野生株CBE59、缺失株CBE59ΔHlyE-V和回補(bǔ)株CBE59CΔHlyE-V的LD50進(jìn)行了測定，結(jié)果見表2。在雛雞模型中，野生株、缺失株、回補(bǔ)株的LD50值分別為8.2×105、4.9×106和4.2×105CFU/只，表明缺失HlyE-V后CBE59的毒力顯著下降。

取野生株攻毒組、缺失株免疫組和PBS空白對照組雛雞肺臟和肝臟制作組織切片，結(jié)果見圖2。野生株和回補(bǔ)株感染組肺臟和肝臟存在明顯病變，肺泡有出血、炎性細(xì)胞浸潤，肺泡間隔變寬，肝細(xì)胞破碎、萎縮、消失；而缺失株感染組和PBS組無明顯病變。表明缺失HlyE-V 后APEC的毒力顯著下降。

圖2 不同攻毒組雛雞肺臟和肝臟病理切片(標(biāo)尺=50 μm)

2.4 胞內(nèi)存活試驗

通過胞內(nèi)存活試驗鑒定缺失HlyE-V對CBE59在禽源巨噬細(xì)胞HD11內(nèi)存活的影響。如圖3所示，與野生株和回補(bǔ)株相比，感染后6～16 h，缺失株CBE59ΔHlyE-V的胞內(nèi)存活率顯著降低。免疫熒光試驗觀察如圖4所示，在野生株CBE59感染的HD11中有一半的細(xì)胞中含有6～8個細(xì)菌，且從56.7%的細(xì)胞中觀察到，含有超過6個細(xì)菌；而在觀察缺失株CBE59ΔHlyE-V時，菌量超過6個的僅為10.7%，相較野生株下降了46%。如圖5所示，在熒光顯微鏡下清楚觀察到缺失株CBE59ΔHlyE-V在細(xì)胞內(nèi)的數(shù)量普遍低于野生株CBE59；在回補(bǔ)株CBE59CΔHlyE-V中，細(xì)菌進(jìn)入細(xì)胞中的數(shù)量與野生株相近。這些結(jié)果均表明HlyE-V對 APEC 在吞噬細(xì)胞內(nèi)的存活起到十分重要的作用。

圖3 細(xì)菌在巨噬細(xì)胞HD11內(nèi)的存活能力

圖4 胞內(nèi)細(xì)菌數(shù)量統(tǒng)計

圖5 免疫熒光標(biāo)記觀察細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌

2.5 CCK8細(xì)胞毒性試驗

通過Cell Counting Kit-8試劑檢測細(xì)胞毒性，測得在450 nm的OD值并計算存活率，結(jié)果如圖6所示。從圖中可見，野生株和回補(bǔ)株組的細(xì)胞存活率隨時間變化較明顯，而缺失組變化較小。在感染24 h后，野生株感染的細(xì)胞存活率為42%，回補(bǔ)株感染細(xì)胞的存活率為35%，而缺失組的為70%，由此可見，缺失HlyE-V后CBE59對細(xì)胞的毒性顯著下降。

圖6 不同菌株對HD11細(xì)胞的毒性作用

3 討論

APEC是危害養(yǎng)禽業(yè)的重要細(xì)菌性病原，主要通過呼吸道感染家禽，導(dǎo)致家禽的多系統(tǒng)混合感染，甚至引起禽急性死亡[17]。APEC還具有人畜共患潛力，可以導(dǎo)致人尿路感染、腹膜炎、血流感染等。由于APEC具有不同的血清型和復(fù)雜的毒力因子，目前還缺乏有效的疫苗防控APEC引起的疾病[18]。此外，由于抗生素的濫用，使得APEC呈現(xiàn)多重耐藥的趨勢，甚至多黏菌素耐藥基因mcr-1在APEC分離株中被發(fā)現(xiàn)，這給全球的養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的威脅[19]。因此探究APEC的致病機(jī)制有利于有效疫苗的研發(fā)和細(xì)菌疾病的防控。

溶血素是致病性大腸桿菌中的一種主要毒力因子[20]，HlyE屬于膜成孔毒素(pore-forming toxin，PFT)，PFT能在靶細(xì)胞膜上形成穿膜孔道，破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)并使其滲透性增強(qiáng)而導(dǎo)致細(xì)胞滲透性溶解。除了損傷紅細(xì)胞外，PET還能損傷免疫細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞，特別是肝細(xì)胞和內(nèi)部組織器官[21]。根據(jù)蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)不同，PFT分為α-PFT和β-PFT，分別形成α-螺旋兩親性跨膜孔道和β-桶狀跨膜結(jié)構(gòu)，α-PFT可以產(chǎn)生體外溶血活動，β-PFT產(chǎn)生的溶血活動與細(xì)胞相關(guān)，HlyE屬于α-PFT。HlyE可以溶解哺乳動物紅細(xì)胞，對巨噬細(xì)胞具有細(xì)胞毒性和凋亡作用[22]。HlyE的表達(dá)也受到一些轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，如H-NS可以抑制HlyE的轉(zhuǎn)錄，環(huán)腺苷酸受體蛋白(CRP)可以激活HlyE的表達(dá)。

Enow等[23]研究表明，HlyE結(jié)構(gòu)上2個區(qū)域的突變，可以使HlyE的功能喪失，分別是啟動子區(qū)域和N末端部分區(qū)域，這些突變體對動物的毒力減弱，對抗生素更加敏感。Nyunt等[24]發(fā)現(xiàn)在C-末端丟失了氨基酸殘基的HlyE突變體的轉(zhuǎn)運能力受損，不能轉(zhuǎn)運到細(xì)胞外，只能留在胞內(nèi)。C-末端對HlyE的轉(zhuǎn)運、在膜上成孔很重要，因此HlyE突變體的溶血活動受到抑制。

為了研究APEC中新發(fā)現(xiàn)的HlyE-V對APEC致病力的影響，通過Red兩步同源重組法構(gòu)建HlyE-V缺失株，在缺失株中導(dǎo)入pSTV28-HlyE-V質(zhì)粒構(gòu)建回補(bǔ)株，首先對其生長曲線進(jìn)行了測定，結(jié)果顯示野生株和缺失株的生長速度相近，回補(bǔ)株在平臺期的OD600值略高，這表明缺失HlyE-V基因?qū)PEC的影響較小。溶血試驗結(jié)果顯示，野生株也無溶血現(xiàn)象，這可能與HlyE-V的結(jié)構(gòu)有關(guān)。Ludwig等[25]通過定向位點突變研究了HlyE基因上不同結(jié)構(gòu)的功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HlyE N末端的兩性分子螺旋αA1結(jié)構(gòu)對溶血活動十分重要，突變體影響了C末端螺旋αG，在頭部的β-tongue區(qū)域，或者在尾部的疏水區(qū)域，表明兩性分子C-末端對孔道形成十分重要。

細(xì)胞試驗表明，HlyE-V缺失株的胞內(nèi)存活能力下降，對細(xì)胞毒性降低。在宿主體內(nèi) APEC 需要逃避宿主免疫系統(tǒng)的清除作用，只有在吞噬細(xì)胞內(nèi)存活下來的細(xì)菌才能發(fā)揮毒性作用。動物試驗結(jié)果表明，缺失HlyE-V基因?qū)PEC的毒力有較大影響，與野生株相比，缺失株雛雞的LD50降低了5倍左右，通過觀察組織病理切片，可見野生株和回補(bǔ)株的組織器官具有明顯病變，出現(xiàn)肝細(xì)胞核萎縮、慢性肝淤血、肝小葉中央靜脈及其周圍肝竇明顯擴(kuò)長，充滿大量紅細(xì)胞等，肺泡充血、有大量炎性細(xì)胞浸潤等。這表明缺失HlyE-V基因后可以顯著降低APEC菌株毒力。

綜上，本研究證實HlyE-V是APEC的一個重要毒力因子，與HlyE不同的是，HlyE-V不能導(dǎo)致細(xì)胞溶血，但可以導(dǎo)致細(xì)胞毒性、 損傷、禽敗血癥等。至于HlyE-V蛋白在胞內(nèi)的分泌機(jī)制以及對巨噬細(xì)胞信號途徑的影響還需進(jìn)一步研究。