亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        細(xì)胞溶素HlyE變體對禽致病性大腸桿菌致病力的影響

        2023-10-19 08:33:02文哲王忠星諸葛祥凱戴建君
        畜牧與獸醫(yī) 2023年4期

        文哲,王忠星,諸葛祥凱,戴建君

        (南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,江蘇 南京 210095)

        禽致病性大腸桿菌(avian pathogenicEscherichiacoli,APEC)是一種主要的禽細(xì)菌性病原,對養(yǎng)禽業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1]。APEC屬于腸道外致病性大腸桿菌(ExPEC),可以導(dǎo)致禽局部或多系統(tǒng)混合感染,如敗血癥、輸卵管炎、肺炎、關(guān)節(jié)炎、腹膜炎、卵黃囊感染和呼吸道感染等[2]。APEC可以通過被污染的家畜產(chǎn)品傳播給人,具有人畜共患的潛力[3]。人源ExPEC,如尿道致病性大腸桿菌(UPEC)和致新生兒腦膜炎大腸桿菌(NMEC),與APEC具有遺傳相似性和相同的毒力基因[4]。因此深入探究APEC的致病性、耐藥性和傳播機(jī)制,對全球公共衛(wèi)生安全具有至關(guān)重要的意義。

        溶血素是致病性細(xì)菌中的一種主要毒力因子,在許多細(xì)菌中都有發(fā)現(xiàn)[5]。這些分子因為具有溶解紅細(xì)胞的能力而被命名,但近年研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌溶血素還能損傷甚至致死多種有核細(xì)胞和血小板,如單核細(xì)胞、粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、心肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等,故又稱為細(xì)胞溶素(Cytolysin),其在參與細(xì)菌致病過程中發(fā)揮了重要作用[6]。HlyE(又稱ClyA或SheA)最早在大腸桿菌K12中發(fā)現(xiàn),屬于孔道形成毒素,不屬于RTX家族[5,7]。HlyE基因位于大腸桿菌染色體骨架上,因此在大腸桿菌中廣泛分布。然而,由于HlyE基因的表達(dá)受到組蛋白樣類核結(jié)構(gòu)蛋白(H-NS)的抑制,它的溶血活性不能在標(biāo)準(zhǔn)血平板上觀察得到[8]。但是,Murase等[9]發(fā)現(xiàn)在腸出血性大腸桿菌(EHEC)O55/O157菌株厭氧培養(yǎng)在含有5%脫纖維綿羊血平板上時HlyE具有溶血活性;Oscarsson等[5]發(fā)現(xiàn)HlyE能在紅細(xì)胞上形成3.0~3.5 nm的微孔,但是用膽固醇預(yù)處理后的HlyE抑制了微孔的形成,表明HlyE能與膽固醇結(jié)合;Wai等[10]發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的外膜囊泡(OMVs)中包含HlyE蛋白,HlyE在OMVs中形成低聚物孔集合體,通過OMVs轉(zhuǎn)運到細(xì)胞內(nèi),從而對細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用。Faucher等[11]在沙門菌中也發(fā)現(xiàn)了HlyE,它對上皮細(xì)胞具有毒性作用,感染腸道時能溶解上皮細(xì)胞,從而進(jìn)入深層組織,且這種毒性作用是由操縱子PhoP調(diào)控的。

        AlbrechtL等[12]發(fā)現(xiàn)僅部分致病性大腸桿菌攜帶功能性的HlyE基因,其余攜帶HlyE的突變體衍生物或非功能性HlyE片段。我們前期在APEC中發(fā)現(xiàn)有HlyE突變體(HlyE-V)基因,其突變體和本體相比氨基酸具有77%的同源性[13],功能未知。因此,本研究想探究在APEC中HlyE突變體的致病作用。

        1 材料與方法

        1.1 質(zhì)粒、菌株及細(xì)胞

        禽致病性大腸桿菌CBE59(血清型O145、序列型ST117、ECOR G群,對慶大霉素、氯霉素、氨芐西林等抗生素敏感)、質(zhì)粒pKD46(氨芐西林抗性,Ampr)、pKD3(氯霉素抗性,Chlr)、pCP20(Ampr,Chlr)、pSTV28、禽源巨噬細(xì)胞(HD11),均由本實驗室保存。

        1.2 主要試劑和儀器

        DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液(美國,BD公司),小鼠抗CBE59全菌多抗(自制),5-異硫氰酸酯(FITC)標(biāo)記山羊抗鼠二抗、鬼筆環(huán)肽(美國,AAT Bioquest公司),CCK8檢測試劑(南京奇博能生物科技有限公司),Green Tap Mix(南京諾唯贊生物科技股份有限公司),胎牛血清(FBS)(美國,Gibco公司)。NanoDrop紫外可見分光光度計(美國,Thermo Fisher公司),電穿孔儀(美國,Bio-Rad公司),倒置熒光顯微鏡(德國,蔡司集團(tuán))。

        1.3 HlyE缺失株、回補(bǔ)株的構(gòu)建

        參考Datsenko等[14]建立的Red兩步同源重組法構(gòu)建HlyE-V缺失株。首先將質(zhì)粒pKD46電轉(zhuǎn)入CBE59菌株中,通過氨芐平板篩選陽性菌株CBE59-pKD46,接著以氯霉素抗性pKD3質(zhì)粒為模板,利用表1中含有HlyE-V基因上下游50 bp同源臂序列和pKD3 FRT上下游20 bp序列的HlyE-V-que-F、HlyE-V-que-R引物通過PCR擴(kuò)增合成基因打靶片段,將PCR產(chǎn)物通過二次膠回收。在200 Ω、25 μF、1 800 V的條件下將打靶片段電轉(zhuǎn)化入CBE59-pKD46的感受態(tài)細(xì)胞中,在30 ℃搖床培養(yǎng)2~3 h后取出,6 000 r/min離心5 min,棄去大部分上清液,重懸菌體沉淀,均勻涂布在具有Chlr抗性的LB瓊脂平板,置于28 ℃培養(yǎng)箱過夜孵育,第2天挑取單菌落,用表2中引物HlyE-V-JD-F、HlyE-V-JD-R鑒定。再將篩選出來的陽性菌株以同樣的方法電轉(zhuǎn)化入pCP20質(zhì)粒,37 ℃培養(yǎng)去掉Chlr抗性片段,最后42 ℃培養(yǎng)去除pCP20質(zhì)粒。最后通過測序確認(rèn)HlyE-V基因是否敲除成功,缺失后的菌株命名為CBE59ΔHlyE-V。將pSTV28-HlyE-V電轉(zhuǎn)入CBE59ΔHlyE-V中構(gòu)建回補(bǔ)株CBE59CΔHlyE-V。

        表1 HlyE-V缺失及鑒定引物

        表2 菌株CBE59、CBE59ΔHlyE-V和CBE59CΔHlyE-V對雛雞的LD50測定

        1.4 生長曲線的測定

        對野生株CBE59、缺失株CBE59ΔHlyE-V和回補(bǔ)株CBE59CΔHlyE-V的生長曲線進(jìn)行測定。將上述3株菌在LB平板上劃線,挑取單菌落轉(zhuǎn)接于5 mL LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃搖床過夜培養(yǎng)后將菌液離心(4 ℃,5 000g)10 min,棄上清液,用1×PBS溶液洗滌2次后,將菌液OD600值調(diào)整為1.0,按照1∶100重新轉(zhuǎn)接于50 mL的錐形瓶中培養(yǎng)至平臺期。期間每隔1 h測定其OD600值,進(jìn)行3次平行試驗,整理數(shù)據(jù)并用GraphPad Prism 7.0繪制生長曲線。

        1.5 溶血活性測定

        配制含有5%脫纖維綿羊血平板,將CBE59、CBE59ΔHlyE-V和CBE59CΔHlyE-V按1∶100的比例接種到1 mL LB液體培養(yǎng)基中,于37 ℃搖床震蕩培養(yǎng)至對數(shù)期,用1×PBS洗滌2遍,將菌液OD600值稀釋至0.8,取1.0 μL細(xì)菌懸浮液到血平板上,將平板置于37 ℃厭氧培養(yǎng)箱中孵育24 h,最后觀察血平板上是否形成溶血環(huán)[15]。

        1.6 動物試驗

        1.6.1 半數(shù)致死劑量(LD50)的測定

        將7日齡雛雞隨機(jī)分為15組,每組10只。將CBE59、CBE59ΔHlyE-V和CBE59CΔHlyE-V于LB平板上劃線,37 ℃培養(yǎng)過夜,挑選單菌落轉(zhuǎn)接至LB液體培養(yǎng)基中,培養(yǎng)至對數(shù)期,將菌液離心,棄上清液收集菌體沉淀,用4 ℃預(yù)冷的1×PBS洗滌2遍,重懸沉淀,用1×PBS將菌株OD600值稀釋為1.0后,進(jìn)行10×倍比稀釋至濃度為105~109CFU/mL。將稀釋好的野生株CBE59攻毒雛雞,每只0.1 mL,攻毒劑量分別為104、105、106、107、108CFU/只,缺失株和回補(bǔ)株處理方法同上。用菌感染7日內(nèi)觀察雛雞的生長狀況并記錄死亡結(jié)果,采用軟件SPSS計算LD50[16]。

        1.6.2 組織切片制作與觀察

        采用頸椎脫臼法處死雛雞,取感染雛雞肺臟和肝臟,用10%的甲醛固定。常規(guī)制作病理切片,HE染色染色后封片觀察。

        1.7 胞內(nèi)存活試驗

        取HD11細(xì)胞1×105CFU/mL加至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。將CBE59、CBE59ΔHlyE-V和CBE59CΔHlyE-V培養(yǎng)至對數(shù)期,離心收集菌體沉淀并用PBS緩沖液洗3遍,用無血清DMEM重懸菌體沉淀,以感染比(MOI)為1∶100將菌液加入細(xì)胞培養(yǎng)孔,每株菌3組平行孔,1組對照(不加菌液)。300g離心5 min,沉淀細(xì)菌,將孔板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。在感染HD11細(xì)胞3 h后,將培養(yǎng)基吸去,用1×PBS緩沖液洗滌未黏附的細(xì)菌,在DMEM中按1∶1 000加入慶大霉素,并將抗性DMEM培養(yǎng)基用巴氏吸管均勻加入每孔中,放37 ℃的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1 h后,在不同時間點(2、4、6、8、10、12、14和16 h)取出24孔板,將DMEM培養(yǎng)基吸去,用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞3遍,然后每孔加入200 μL 0.1% Triton X-100裂解細(xì)胞,用PBS進(jìn)行倍比稀釋,取100 μL均勻涂布于LB平板上。37 ℃培養(yǎng)過夜后進(jìn)行細(xì)菌計數(shù)。

        1.8 免疫熒光標(biāo)記試驗

        為了直觀對比野生株CBE59、缺失株CBE59ΔHlyE-V和回補(bǔ)株CBE59CΔHlyE-V在HD11細(xì)胞內(nèi)的存活能力,進(jìn)行了免疫熒光標(biāo)記試驗。將HD11細(xì)胞均勻鋪在細(xì)胞Dish中,待細(xì)胞貼壁,在 HD11細(xì)胞dish中以10∶1感染比(MOI)加入總量 5×108CFU的CBE59、CBE59ΔHlyE-V和CBE59CΔHlyE-V,在37 ℃ CO2培養(yǎng)箱孵育3 h后,棄掉培養(yǎng)液,用PBS清洗3遍,在DMEM中按1∶1 000加入濃度為100 mg/mL慶大霉素,將抗性DMEM各加1 mL到Dish中,放入細(xì)胞培養(yǎng)箱1 h,以殺死未黏附細(xì)胞的細(xì)菌。拿出Dish后,用真空泵吸去培養(yǎng)基,用PBS洗滌Dish 3遍,每次5 min。用4 ℃預(yù)冷的4%多聚甲醛固定細(xì)胞10 min后,用PBS洗3遍,每次5 min,再加入0.5%的Triton X-100通透細(xì)胞15 min,PBS洗3遍,每次5 min。用含5% BSA的PBS室溫封閉30 min,棄液。用1%BSA按1∶500比例稀釋小鼠抗CBE59全菌多抗,加入到每個Dish中,室溫孵育 2 h,PBS洗滌3遍,1∶100的比例加入 2. 5% BSA 稀釋的異硫氰酸熒光素 (FITC)標(biāo)記的羊抗鼠二抗,同時1∶500加入鬼筆環(huán)肽,37 ℃避光孵育45 min后取出,按1∶100的比例加入DAPI,作用5 min后洗滌3遍。在熒光顯微鏡下觀察(嚴(yán)格避光)。

        1.9 CCK8細(xì)胞毒性試驗

        在96孔板中加入100 μL HD11細(xì)胞懸液,將培養(yǎng)板放入37 ℃ CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。然后向96孔板中加入10 μL野生株CBE59、缺失株CBE59ΔHlyE-V和回補(bǔ)株CBE59CΔHlyE-V菌液,每組3個平行,1個對照(不加菌液)。300 r/min水平離心5 min。將96孔板放入培養(yǎng)箱中孵育0.5、1.5、4、8、16、24后,向每孔加入10 μL CCK8,將培養(yǎng)板放在37 ℃ CO2培養(yǎng)箱孵育1~4 h,用酶標(biāo)儀測定在波長450 nm處的吸光值。細(xì)胞存活率計算方法為:[(樣品孔OD值-空白孔OD值)/(陰性孔OD值-空白孔OD值)]×100%。

        1.10 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

        所有試驗均重復(fù)進(jìn)行了3次,使用GraphPad Prism 7.00對數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖,數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示,利用t檢驗比較了各菌株胞內(nèi)存活、細(xì)胞毒性等試驗數(shù)據(jù)的差異。P<0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。*表示P<0.05;**表示P<0.01;***表示P<0.001;****表示P<0.000 1。

        2 結(jié)果

        2.1 生長曲線的測定

        為了驗證HlyE-V基因缺失后是否影響了CBE59的生長,對野生株CBE59、缺失株CBE59ΔHlyE-V和回補(bǔ)株CBE59CΔHlyE-V進(jìn)行了生長曲線測定,結(jié)果見圖1。野生株和缺失株在平臺期的OD600值相近,數(shù)值為2.5~3.0,回補(bǔ)株在平臺期OD600值稍高,數(shù)值為3.0~3.5,表明缺失HlyE-V基因不影響CBE59的生長。

        圖1 CBE59、CBE59ΔHlyE-V、CBE59CΔHlyE-V在LB培養(yǎng)基中的生長速度

        2.2 溶血活性

        在無氧情況下檢測了野生株CBE59、缺失株CBE59ΔHlyE-V和回補(bǔ)株CBE59CΔHlyE-V在脫纖維綿羊血平板上的溶血活性,3種菌株在血平板上都不能形成溶血環(huán),表明HlyE-V不能產(chǎn)生溶血活動。

        2.3 LD50測定和組織學(xué)觀察

        為了探究HlyE-V對APEC菌株CBE59毒力的影響,對野生株CBE59、缺失株CBE59ΔHlyE-V和回補(bǔ)株CBE59CΔHlyE-V的LD50進(jìn)行了測定,結(jié)果見表2。在雛雞模型中,野生株、缺失株、回補(bǔ)株的LD50值分別為8.2×105、4.9×106和4.2×105CFU/只,表明缺失HlyE-V后CBE59的毒力顯著下降。

        取野生株攻毒組、缺失株免疫組和PBS空白對照組雛雞肺臟和肝臟制作組織切片,結(jié)果見圖2。野生株和回補(bǔ)株感染組肺臟和肝臟存在明顯病變,肺泡有出血、炎性細(xì)胞浸潤,肺泡間隔變寬,肝細(xì)胞破碎、萎縮、消失;而缺失株感染組和PBS組無明顯病變。表明缺失HlyE-V 后APEC的毒力顯著下降。

        圖2 不同攻毒組雛雞肺臟和肝臟病理切片(標(biāo)尺=50 μm)

        2.4 胞內(nèi)存活試驗

        通過胞內(nèi)存活試驗鑒定缺失HlyE-V對CBE59在禽源巨噬細(xì)胞HD11內(nèi)存活的影響。如圖3所示,與野生株和回補(bǔ)株相比,感染后6~16 h,缺失株CBE59ΔHlyE-V的胞內(nèi)存活率顯著降低。免疫熒光試驗觀察如圖4所示,在野生株CBE59感染的HD11中有一半的細(xì)胞中含有6~8個細(xì)菌,且從56.7%的細(xì)胞中觀察到,含有超過6個細(xì)菌;而在觀察缺失株CBE59ΔHlyE-V時,菌量超過6個的僅為10.7%,相較野生株下降了46%。如圖5所示,在熒光顯微鏡下清楚觀察到缺失株CBE59ΔHlyE-V在細(xì)胞內(nèi)的數(shù)量普遍低于野生株CBE59;在回補(bǔ)株CBE59CΔHlyE-V中,細(xì)菌進(jìn)入細(xì)胞中的數(shù)量與野生株相近。這些結(jié)果均表明HlyE-V對 APEC 在吞噬細(xì)胞內(nèi)的存活起到十分重要的作用。

        圖3 細(xì)菌在巨噬細(xì)胞HD11內(nèi)的存活能力

        圖4 胞內(nèi)細(xì)菌數(shù)量統(tǒng)計

        圖5 免疫熒光標(biāo)記觀察細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌

        2.5 CCK8細(xì)胞毒性試驗

        通過Cell Counting Kit-8試劑檢測細(xì)胞毒性,測得在450 nm的OD值并計算存活率,結(jié)果如圖6所示。從圖中可見,野生株和回補(bǔ)株組的細(xì)胞存活率隨時間變化較明顯,而缺失組變化較小。在感染24 h后,野生株感染的細(xì)胞存活率為42%,回補(bǔ)株感染細(xì)胞的存活率為35%,而缺失組的為70%,由此可見,缺失HlyE-V后CBE59對細(xì)胞的毒性顯著下降。

        圖6 不同菌株對HD11細(xì)胞的毒性作用

        3 討論

        APEC是危害養(yǎng)禽業(yè)的重要細(xì)菌性病原,主要通過呼吸道感染家禽,導(dǎo)致家禽的多系統(tǒng)混合感染,甚至引起禽急性死亡[17]。APEC還具有人畜共患潛力,可以導(dǎo)致人尿路感染、腹膜炎、血流感染等。由于APEC具有不同的血清型和復(fù)雜的毒力因子,目前還缺乏有效的疫苗防控APEC引起的疾病[18]。此外,由于抗生素的濫用,使得APEC呈現(xiàn)多重耐藥的趨勢,甚至多黏菌素耐藥基因mcr-1在APEC分離株中被發(fā)現(xiàn),這給全球的養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的威脅[19]。因此探究APEC的致病機(jī)制有利于有效疫苗的研發(fā)和細(xì)菌疾病的防控。

        溶血素是致病性大腸桿菌中的一種主要毒力因子[20],HlyE屬于膜成孔毒素(pore-forming toxin,PFT),PFT能在靶細(xì)胞膜上形成穿膜孔道,破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)并使其滲透性增強(qiáng)而導(dǎo)致細(xì)胞滲透性溶解。除了損傷紅細(xì)胞外,PET還能損傷免疫細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞,特別是肝細(xì)胞和內(nèi)部組織器官[21]。根據(jù)蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)不同,PFT分為α-PFT和β-PFT,分別形成α-螺旋兩親性跨膜孔道和β-桶狀跨膜結(jié)構(gòu),α-PFT可以產(chǎn)生體外溶血活動,β-PFT產(chǎn)生的溶血活動與細(xì)胞相關(guān),HlyE屬于α-PFT。HlyE可以溶解哺乳動物紅細(xì)胞,對巨噬細(xì)胞具有細(xì)胞毒性和凋亡作用[22]。HlyE的表達(dá)也受到一些轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控,如H-NS可以抑制HlyE的轉(zhuǎn)錄,環(huán)腺苷酸受體蛋白(CRP)可以激活HlyE的表達(dá)。

        Enow等[23]研究表明,HlyE結(jié)構(gòu)上2個區(qū)域的突變,可以使HlyE的功能喪失,分別是啟動子區(qū)域和N末端部分區(qū)域,這些突變體對動物的毒力減弱,對抗生素更加敏感。Nyunt等[24]發(fā)現(xiàn)在C-末端丟失了氨基酸殘基的HlyE突變體的轉(zhuǎn)運能力受損,不能轉(zhuǎn)運到細(xì)胞外,只能留在胞內(nèi)。C-末端對HlyE的轉(zhuǎn)運、在膜上成孔很重要,因此HlyE突變體的溶血活動受到抑制。

        為了研究APEC中新發(fā)現(xiàn)的HlyE-V對APEC致病力的影響,通過Red兩步同源重組法構(gòu)建HlyE-V缺失株,在缺失株中導(dǎo)入pSTV28-HlyE-V質(zhì)粒構(gòu)建回補(bǔ)株,首先對其生長曲線進(jìn)行了測定,結(jié)果顯示野生株和缺失株的生長速度相近,回補(bǔ)株在平臺期的OD600值略高,這表明缺失HlyE-V基因?qū)PEC的影響較小。溶血試驗結(jié)果顯示,野生株也無溶血現(xiàn)象,這可能與HlyE-V的結(jié)構(gòu)有關(guān)。Ludwig等[25]通過定向位點突變研究了HlyE基因上不同結(jié)構(gòu)的功能,結(jié)果發(fā)現(xiàn)HlyE N末端的兩性分子螺旋αA1結(jié)構(gòu)對溶血活動十分重要,突變體影響了C末端螺旋αG,在頭部的β-tongue區(qū)域,或者在尾部的疏水區(qū)域,表明兩性分子C-末端對孔道形成十分重要。

        細(xì)胞試驗表明,HlyE-V缺失株的胞內(nèi)存活能力下降,對細(xì)胞毒性降低。在宿主體內(nèi) APEC 需要逃避宿主免疫系統(tǒng)的清除作用,只有在吞噬細(xì)胞內(nèi)存活下來的細(xì)菌才能發(fā)揮毒性作用。動物試驗結(jié)果表明,缺失HlyE-V基因?qū)PEC的毒力有較大影響,與野生株相比,缺失株雛雞的LD50降低了5倍左右,通過觀察組織病理切片,可見野生株和回補(bǔ)株的組織器官具有明顯病變,出現(xiàn)肝細(xì)胞核萎縮、慢性肝淤血、肝小葉中央靜脈及其周圍肝竇明顯擴(kuò)長,充滿大量紅細(xì)胞等,肺泡充血、有大量炎性細(xì)胞浸潤等。這表明缺失HlyE-V基因后可以顯著降低APEC菌株毒力。

        綜上,本研究證實HlyE-V是APEC的一個重要毒力因子,與HlyE不同的是,HlyE-V不能導(dǎo)致細(xì)胞溶血,但可以導(dǎo)致細(xì)胞毒性、 損傷、禽敗血癥等。至于HlyE-V蛋白在胞內(nèi)的分泌機(jī)制以及對巨噬細(xì)胞信號途徑的影響還需進(jìn)一步研究。

        男女男在线精品免费观看| 国产精品亚洲二区在线观看| 欧美怡春院一区二区三区| 无码人妻久久一区二区三区蜜桃| 老师脱了内裤让我进去| 无码人妻一区二区三区免费n鬼沢 人禽无码视频在线观看 | 日韩人妖干女同二区三区| 日本不卡的一区二区三区中文字幕| 天天躁夜夜躁狠狠躁婷婷| 国产成人av综合色| 中日av乱码一区二区三区乱码| 岛国成人在线| 人妻中文字幕不卡精品| 一本色道久久88加勒比综合| 国产大片黄在线观看| 日产无人区一线二线三线新版 | 男女爱爱好爽视频免费看| 国产女高清在线看免费观看| 久久婷婷国产综合精品| 伊人久久大香线蕉av最新午夜| 久久久中日ab精品综合| 国产精品欧美一区二区三区不卡| 在线视频你懂的国产福利| 国产大片在线观看三级| 亚洲av乱码一区二区三区人人| 免费看男女做羞羞的事网站| 97se在线| 免费女同毛片在线不卡| 中文av字幕一区二区三区| 精品亚洲成av人在线观看| 国产精品久久久| 亚洲VR永久无码一区| 亚洲国产综合精品中久| 国产又色又爽又黄刺激在线视频 | 国产97色在线 | 日韩| 日本久久久免费高清| 精品黄色国产一区二区| 久久久中文久久久无码| 免费啪啪视频一区| 欧美深夜福利视频| 综合亚洲二区三区四区在线|