李科茫，周金柱，周俊明，牛貝貝，武琦，郭容利，張雪寒，朱雪蛟，李彬*，粟碩

(1. 南京農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，江蘇 南京 210095；2. 江蘇省農(nóng)業(yè)科學院獸醫(yī)研究所，江蘇 南京 210014)

輪狀病毒(rotavirus，RV)是一類無囊膜的雙鏈RNA病毒，因病毒粒子獨特的“車輪狀”外觀形態(tài)而得名，其結構包括三層同心衣殼及其包裹著的11個分節(jié)段的雙股RNA；這些RNA節(jié)段分別編碼6種病毒結構蛋白(VP1，VP2，VP3，VP4，VP6和VP7)及6種非結構蛋白(NSP1，NSP2，NSP3，NSP4，NSP5和NSP6)[1]。根據(jù)VP6的序列及抗原性差異，RV被分為A至J共10個群[2-4]。此外，根據(jù)VP7和VP4的序列差異，通過G/P雙命名系統(tǒng)又可將A群輪狀病毒(group A rotavirus，RVA)進一步分為不同的G基因型和P基因型[5]。

RV能夠引起人類，鳥類及多種哺乳動物的急性腹瀉[6]。歷年來的統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，全球每年預估至少有215 000名5歲以下兒童死于RV感染[7]。豬作為一種與人密切相關的家畜，已被證實能夠感染A、B、C、E、H血清群RV，同時，A、B、C血清群RV也被證實與仔豬腹瀉具有相關性[8]。由于豬RVA相對其他血清群擁有更高的患病率及更強的致病性，以及其較易通過細胞培養(yǎng)分離的特點[9]，受到更多的關注。此外，日前全球新發(fā)的人RVA，諸如G9和G12基因型，被認為很有可能通過豬源的RVA基因重配產(chǎn)生，與此同時，部分感染人和豬的RVA有著相同的G/P基因型組合，也說明人和豬之間RV直接傳播的可能，這些都提示豬RVA的人獸共患潛力，具有重要的公共衛(wèi)生學意義[9]?；谏鲜鲈?，豬RVA的常態(tài)化流行病學監(jiān)測不可或缺。

目前使用最廣泛的RV檢測方法為基于糞便樣本中RV病毒顆粒上蛋白質(zhì)抗原的檢測，在這之中，RV特異性抗體相關的ELISA檢測方法更是RV大規(guī)模監(jiān)測的不二之選[10]。為了開發(fā)特異性強、靈敏性高、可重復性佳的ELISA檢測方法，針對某一特定抗原表位、高度均一、易于標準化大批量生產(chǎn)的單克隆抗體自然不可或缺。RV的VP6蛋白是一類大小約為45 kDa且高度保守的病毒蛋白，其含量豐富，約占病毒粒子質(zhì)量的50%～60%[11-12]。由于其豐度和抗原交叉反應性，VP6蛋白常被作為RV檢測的各類相關免疫學試驗的首要目標[13]。此外，VP6蛋白組成了RV的中間衣殼層，大量證據(jù)表明靶向該蛋白的特異性抗體在防止輪狀病毒感染過程中起到了重要作用。機體在感染輪狀病毒或接種其疫苗后，往往產(chǎn)生高滴度的VP6特異性抗體[14-15]。針對VP6的抗體或納米抗體，在感染輪狀病毒的小鼠和仔豬上，也顯示了其被動保護力[16-19]。然而，目前VP6抗體介導的保護機制尚未得到完全表征。本研究以原核表達的VP6重組蛋白為抗原免疫小鼠，取其脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞SP2/0融合，間接ELISA方法篩選獲得一株穩(wěn)定分泌抗VP6蛋白特異性單克隆抗體的雜交瘤細胞株5G9，為豬RVA的生物學特性、免疫機制、流行病學調(diào)查、診斷、治療等方面的研究奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 病毒、細胞與試驗動物

豬RVA毒株NJ2012、豬RVA毒株寧86，由本實驗室分離保存；牛RVA毒株NCDV、猴RVA毒株SA11、豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(transmissible gastroenteritis virus，TGEV)、豬德爾塔冠狀病毒(porcine deltacoronavirus，PDCoV)，由本實驗室保存。SP2/0細胞、Vero細胞、LLC-PK1細胞、ST細胞，由本實驗室保存；6～8周齡雌性BALB/c小鼠，購自揚州大學比較醫(yī)學中心。

1.2 質(zhì)粒與菌株

原核表達載體pET28a-SUMO由本實驗室保存；DH5α，BL21(DE3)化學感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術公司。

1.3 主要試劑

RNA柱式提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、高保真DNA聚合酶和DNA聚合酶，購自諾唯贊生物科技公司；限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶，購自Thermo Scientific公司；凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒，購自Omega Bio-tek公司；誘導劑IPTG購自Biosharp公司；蛋白質(zhì)純化層析柱購自Cytiva公司；HRP標記羊抗鼠IgG購自Proteintech公司；GEL 01佐劑購自SEPPIC公司；胎牛血清購自Gibco和Biological Industries公司；RPMI 1640培養(yǎng)基和DMEM培養(yǎng)基購自源培生物科技公司；PEG溶液、HAT和HT培養(yǎng)基補充物，購自Sigma-Aldrich公司；FITC標記羊抗鼠IgG、DAPI、RIPA裂解液，購自碧云天生物公司；小鼠單抗Ig類亞類鑒定用酶標二抗即用試劑盒購自博特龍免疫技術公司

1.4 VP6基因的擴增

使用RNA柱式提取試劑盒FastPure Cell/Tissue Total RNA Isolation Kit，按說明書操作提取豬RVA毒株NJ2012感染細胞上清病毒基因組RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒HiScript Ⅱ Q RT SuperMix，按說明書操作進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以合成的cDNA為模板，PCR引物設計參考上傳GenBank的豬RVA毒株NJ2012 VP6基因節(jié)段(GenBank登陸號MT874988)編碼區(qū)序列，上下游引物5′端分別引入保護堿基及酶切位點BamHⅠ和HindⅢ，交由南京金斯瑞生物科技公司合成，引物相關信息見表1，參考高保真DNA聚合酶Phanta Max Master Mix說明書配制。PCR反應體系：95 ℃ 3 min；循環(huán)步驟95 ℃ 15 s，56 ℃ 15 s，72 ℃ 90 s，共循環(huán)35次；72 ℃ 5 min。以此反應程序進行PCR擴增VP6基因。

表1 PCR引物相關信息

1.5 原核表達載體pET28a-SUMO-VP6的構建

VP6基因PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ限制性內(nèi)切酶雙酶切并切膠回收后，與同樣經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切并回收后的pET28a-SUMO載體連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α化學感受態(tài)細胞，挑取菌落PCR鑒定為陽性的菌落，擴大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒進行酶切鑒定，鑒定正確的質(zhì)粒送至擎科生物科技公司進行測序驗證。

1.6 重組蛋白SUMO-VP6的表達與純化

將測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)化學感受態(tài)細胞，挑取PCR鑒定為陽性的菌落接種于含卡那霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，將過夜培養(yǎng)物1∶100轉(zhuǎn)接至含卡那霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基37 ℃震蕩培養(yǎng)至對數(shù)期，加入終濃度為0.8 mmol/L IPTG誘導表達6 h，利用SDS-PAGE對重組蛋白表達情況進行分析。小量誘導表達試驗確定目的重組蛋白表達形式為包涵體后，以相同條件大量誘導表達重組蛋白，使用蛋白質(zhì)純化層析柱HisTrap HP，按說明書操作以含8 mol/L尿素的結合緩沖液溶解包涵體，離心取上清液，過柱純化重組蛋白SUMO-VP6，Western blot驗證該重組蛋白與小鼠抗輪狀病毒血清的免疫反應性。

1.7 小鼠免疫

GEL 01佐劑與等體積重組蛋白SUMO-VP6渦旋混勻后，對6～8周齡雌性BALB/c小鼠，按每只小鼠每次50 μg重組蛋白的劑量行后肢肌肉注射，每隔2周加強免疫1次，第3次免疫結束后10 d測定其血清抗體水平，取血清抗體水平高的小鼠，在融合前3 d腹腔注射50 μg不含佐劑的重組蛋白進行沖擊免疫。

1.8 細胞融合及陽性雜交瘤細胞的篩選與亞克隆

小鼠沖擊免疫5 d后脫頸處死，無菌操作取脾研磨并通過40 μm細胞濾器制備脾細胞懸液，后續(xù)脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞融合主要參考Yokoyama等[20]的方法。融合細胞鋪板5 d后使用含HAT的培養(yǎng)基半量換液，后續(xù)隔天使用含HT的培養(yǎng)基半量換液，鋪板14 d后間接ELISA篩選，包被抗原使用純化的重組蛋白SUMO-VP6，以及參考Arnold等[21]的方法純化的豬RVA毒株NJ2012，將陽性雜交瘤細胞擴大培養(yǎng)，并參考Fuller等[22]的方法，通過有限稀釋法將雜交瘤細胞稀釋至每毫升細胞懸液含8個細胞，每孔100 μL加入已鋪有飼養(yǎng)層細胞的96孔細胞板內(nèi)，后續(xù)對其進行至少3輪亞克隆，得到能夠穩(wěn)定分泌針對VP6蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞株。

1.9 單克隆抗體5G9與豬RVA毒株NJ2012反應性的驗證

1.9.1 Western blot驗證

將純化后的豬RVA毒株NJ2012加入含硫基還原劑的蛋白上樣緩沖液，100 ℃水浴加熱10 min完全變性后進行SDS-PAGE，電泳結束后產(chǎn)物轉(zhuǎn)印至醋酸纖維素膜，分別以雜交瘤細胞上清液，小鼠抗VP6血清，SP2/0細胞上清液作一抗，HRP標記羊抗鼠IgG作二抗進行Western blot。

1.9.2 間接免疫熒光驗證

將豬RVA毒株NJ2012以3 MOI的量接種Vero細胞，感染6 h后冷甲醇固定，分別以雜交瘤細胞上清液，小鼠抗VP6血清，SP2/0細胞上清液作一抗，F(xiàn)ITC標記羊抗鼠IgG作二抗，DAPI作細胞核染色，熒光顯微鏡下觀察并成像。

1.10 小鼠腹水制備單克隆抗體

小鼠腹水制備單克隆抗體主要參考Hendriksen等及Yokoyama等[23-24]的方法，老齡雌性BALB/c小鼠腹腔注射0.5 mL滅菌后的液體石蠟致敏，10～14 d后，小鼠腹腔注射0.5 mL含3×106個雜交瘤細胞的PBS；同時，設置SP2/0細胞陰性對照小鼠，約7～10 d后，待小鼠腹部鼓脹明顯，穿刺取腹水，腹水離心取上清液分裝并保存于-20 ℃冰箱備用。

1.11 單克隆抗體效價測定及亞類鑒定

通過間接ELISA對小鼠腹水及雜交瘤細胞上清液單抗效價進行測定，重組蛋白SUMO-VP6以終濃度1.25 μg/mL稀釋于碳酸鹽緩沖液，每孔50 μL進行抗原包被，以含5%脫脂乳的PBST二倍比稀釋小鼠腹水及雜交瘤細胞上清液，小鼠腹水起始稀釋度為1∶6 000，雜交瘤細胞上清液起始稀釋度為1∶5，同時設置陰性小鼠腹水及SP2/0細胞上清液對照，將大于陰性對照吸光度2.1倍的最高稀釋度視作單克隆抗體效價。根據(jù)小鼠單抗Ig類亞類鑒定試劑盒說明書，對小鼠單克隆抗體的類別，亞類及輕鏈類型進行鑒定。

1.12 單克隆抗體5G9與不同RVA的反應性

將猴RVA毒株SA11、牛RVA毒株NCDV、豬RVA毒株寧86和NJ2012，以3 MOI的量接種Vero細胞，感染6 h后加入RIPA裂解液裂解，充分裂解后離心取上清液加入含硫基還原劑的蛋白上樣緩沖液，100 ℃水浴加熱10 min完全變性后進行SDS-PAGE，電泳結束后產(chǎn)物轉(zhuǎn)印至醋酸纖維素膜，以小鼠腹水單抗5G9作一抗，HRP標記羊抗鼠IgG作二抗進行Western blot。

1.13 單克隆抗體5G9與常見豬腹瀉相關病毒的反應性

將PEDV以0.03 MOI的量接種Vero細胞，感染18 h后收樣；TGEV以1 MOI的量接種ST細胞，感染18 h后收樣；PDCoV以0.6 MOI的量接種LLC-PK1細胞，感染20 h后收樣；豬RVA毒株NJ2012以3 MOI的量接種Vero細胞，感染6 h后收樣。蛋白樣品處理同1.12，以小鼠腹水單抗5G9作一抗，HRP標記羊抗鼠IgG作二抗，進行Western blot。

2 結果

2.1 VP6基因的擴增及原核表達載體pET28a-SUMO-VP6的構建

病毒基因組RNA經(jīng)RT-PCR擴增得到大小約為1 200 bp的目的片段(圖1A)。將該片段克隆至pET28a-SUMO載體，并轉(zhuǎn)化至DH5α化學感受態(tài)細胞，挑取PCR鑒定為陽性的菌落，擴大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒并進行酶切鑒定，重組質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ單酶切線性化后，得到1條大小約為6 800 bp的片段。經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切后，得到2個條帶，大小約為 5 600 bp和1 200 bp的片段，上述片段大小均符合預期(圖1B)，后續(xù)將酶切鑒定正確的質(zhì)粒送測序，測序結果中重組質(zhì)粒的VP6基因序列與讀碼框均正確，未出現(xiàn)突變或移碼，表明成功構建原核表達載體pET28a-SUMO-VP6。

M. DNA分子量標準；1. VP6基因RT-PCR產(chǎn)物；2. ddH2O對照；3. 重組質(zhì)粒pET28a-SUMO-VP6單酶切產(chǎn)物；4. 重組質(zhì)粒pET28a-SUMO-VP6雙酶切產(chǎn)物

2.2 重組蛋白SUMO-VP6的表達與純化

將測序正確的原核表達載體pET28a-SUMO-VP6轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)化學感受態(tài)細胞，小量誘導表達試驗對重組蛋白表達情況進行SDS-PAGE分析(圖2A)，結果表明重組BL21(DE3)大腸桿菌37 ℃誘導6 h后，在約60 kDa處出現(xiàn)1條特異性蛋白條帶，大小與目的蛋白預期值相符，而未經(jīng)誘導的重組菌則未見該條帶；誘導后的重組菌經(jīng)超聲破碎后的上清和沉淀組分顯示該重組蛋白在宿主菌內(nèi)以包涵體形式表達，后續(xù)大量誘導表達重組蛋白，并以含8 mol/L尿素的結合緩沖液溶解包涵體，鎳柱親和層析純化得到條帶相對單一的重組蛋白SUMO-VP6，后續(xù)Western blot分析結果顯示，在約60 kDa處出現(xiàn)一特異性條帶，表明該重組蛋白能夠與小鼠抗輪狀病毒血清反應(圖2B)。

M.蛋白質(zhì)分子量標準；1. 未經(jīng)誘導的重組大腸桿菌BL21(DE3)全菌；2. 經(jīng)誘導的重組大腸桿菌BL21(DE3)全菌；3. 經(jīng)誘導的重組大腸桿菌BL21(DE3)裂解產(chǎn)物可溶性組分；4. 經(jīng)誘導的重組大腸桿菌BL21(DE3)裂解產(chǎn)物不可溶性組分；5. 純化后的重組蛋白SUMO-VP6；6. 未經(jīng)誘導的重組大腸桿菌BL21(DE3)全菌；7. 經(jīng)誘導的重組大腸桿菌BL21(DE3)全菌；8. 純化后的重組蛋白SUMO-VP6；

2.3 陽性雜交瘤細胞株的獲得

細胞融合后，各孔雜交瘤細胞上清經(jīng)多次重組蛋白及全病毒間接ELISA篩選，陽性雜交瘤細胞后續(xù)進行至少3輪亞克隆，最終獲得一株能夠穩(wěn)定分泌針對RV VP6蛋白特異性單克隆抗體的雜交瘤細胞株5G9。

2.4 單克隆抗體5G9與豬RVA毒株NJ2012反應性的驗證

純化后的豬RVA毒株NJ2012經(jīng)SDS-PAGE后轉(zhuǎn)印至醋酸纖維素膜，分別以陽性雜交瘤細胞上清液5G9、小鼠抗VP6血清、SP2/0細胞上清液作一抗，HRP標記羊抗鼠IgG作二抗，Western blot分析結果顯示，雜交瘤細胞上清液試驗組及抗VP6血清陽性對照組在約40 kDa處均出現(xiàn)一特異性條帶，大小與輪狀病毒VP6蛋白大小基本相符，而SP2/0細胞上清液陰性對照組未見特異性條帶(圖3)。

感染豬RVA毒株NJ2012的Vero細胞固定后，分別以陽性雜交瘤細胞上清液5G9、小鼠抗VP6血清、SP2/0細胞上清液作一抗，F(xiàn)ITC標記羊抗鼠IgG作二抗(綠色)，DAPI作細胞核染色(藍色)，間接免疫熒光試驗結果顯示，雜交瘤細胞上清液試驗組及抗VP6血清陽性對照組鏡下可見綠色熒光，而SP2/0細胞上清液陰性對照組則未見綠色熒光，僅可觀察到經(jīng)DPAI染色的藍色細胞核(圖4)。上述結果均表明，單克隆抗體5G9能夠與豬RVA毒株NJ2012的VP6蛋白特異性結合。

2.5 單克隆抗體效價測定及亞類鑒定

間接ELISA結果顯示，小鼠腹水單抗效價可達1∶4 096 000，雜交瘤細胞上清液單抗效價可達1∶10 240，小鼠單抗Ig類亞類鑒定結果顯示為IgG1，輕鏈類型為Kappa。

2.6 單克隆抗體5G9與不同RVA的反應性

感染不同RVA的Vero細胞裂解后收取的蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE，以小鼠腹水單抗5G9作一抗，并按照1∶1 000進行稀釋，HRP標記羊抗鼠IgG作二抗，Western blot分析結果表明，單克隆抗體5G9能夠與不同RVA的VP6蛋白特異性結合(圖5)。

M.蛋白質(zhì)分子量標準；1. 猴輪狀病毒SA11；2. 牛輪狀病毒NCDV；3. 豬輪狀病毒寧86；4. 豬輪狀病毒NJ2012；5. 不感染的Vero細胞對照樣品

2.7 單克隆抗體5G9與常見豬腹瀉相關病毒的反應性

感染常見豬腹瀉相關病毒的細胞裂解后收取的蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE，以小鼠腹水單抗5G9作一抗，并按照1∶1 000進行稀釋，HRP標記羊抗鼠IgG作二抗，Western blot分析結果表明，單克隆抗體5G9不與其他常見豬腹瀉相關病毒發(fā)生特異性反應(圖6)。

M.蛋白質(zhì)分子量標準；1. 豬流行性腹瀉病毒；2. 豬德爾塔冠狀病毒；3.豬傳染性胃腸炎病毒；4. 豬輪狀病毒NJ2012；5. 不感染病毒的Vero細胞對照樣品

3 討論

豬RVA能夠引起仔豬腹瀉、脫水甚至死亡，常與其他腸道病原體混合感染導致其臨床癥狀加重[9]，給國內(nèi)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的損失。然而，目前國內(nèi)上市的豬輪狀病毒疫苗相關產(chǎn)品還較少，防控手段的缺乏，輪狀病毒無處不在的特性及人畜共患的潛力，都提示我們針對豬RVA的常態(tài)化流行病學監(jiān)測不可或缺。豬RVA感染臨床癥狀與其他腸道病原體類似，因此必須采取實驗室檢測才能明確診斷。RT-PCR和熒光定量PCR由于其較高的靈敏度和特異性，常常被用于輪狀病毒的檢測，但是，此類型的檢測需要昂貴的儀器設備和試劑耗材以及受過專業(yè)培訓的研究人員，往往只能在專業(yè)診斷實驗室開展，增加了養(yǎng)殖從業(yè)人員的生產(chǎn)成本[25]。免疫測定(以ELISA為代表),檢測成本相對較低,易于使用,且檢出結果速度較快,已成為檢測輪狀病毒抗原的首選診斷方法[26]。

本研究根據(jù)上述臨床需求，利用大腸桿菌原核表達系統(tǒng)表達并純化豬RVA群抗原VP6蛋白，以此為免疫原免疫小鼠，取其脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞融合制備雜交瘤細胞，通過篩選、驗證及亞克隆進而獲得一株能穩(wěn)定分泌針對VP6蛋白單克隆抗體的陽性雜交瘤細胞株5G9，反應性良好，該單抗不與常見的豬腹瀉相關病毒反應，具備良好的特異性，同時，能夠與不同基因型，感染不同物種的RVA反應，為未來豬RVA臨床相關免疫測定方法的開發(fā)，豬RVA的流行監(jiān)測，乃至調(diào)查RVA跨物種流行事件的發(fā)生，以及豬RVA生物學特性、免疫機制等相關基礎研究奠定基礎。