徐蒙，李首綱，董雨豪，劉永杰

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210095)

嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)廣泛分布于水體環(huán)境，是引起魚類出血性敗血癥的主要病原，同時(shí)也是危害兩棲類、爬行類以及哺乳類動(dòng)物的重要病原。隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)集約化和規(guī)?；潭鹊脑黾樱摬『Φ某掷m(xù)發(fā)生，給我國(guó)的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1- 2]。近年來(lái)，由嗜水氣單胞菌引起的食物中毒、感染性腹瀉以及繼發(fā)感染等頻繁發(fā)生，世界衛(wèi)生組織將其列入飲用水病原體的檢測(cè)范圍，其致病作用已成為公共衛(wèi)生所關(guān)注的重要問(wèn)題[3-4]。

碳代謝是細(xì)菌最基礎(chǔ)的代謝之一。碳源的獲取對(duì)于病原菌在體內(nèi)外環(huán)境中的生存尤為重要，不僅能為病原菌的生命活動(dòng)提供能量，而且能為其生長(zhǎng)提供物質(zhì)基礎(chǔ)[5-7]。病原菌可利用宿主內(nèi)多種碳源，但由于特定棲居位點(diǎn)共存的其他微生物競(jìng)爭(zhēng)，迫使入侵的病原菌通過(guò)基因水平轉(zhuǎn)移獲得新的代謝能力，最大限度地獲取一切可利用的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，以積極適應(yīng)宿主體內(nèi)的環(huán)境條件 (如低pH值、強(qiáng)氧化等)，并提高其在宿主體內(nèi)的生存能力。前期研究證實(shí)，在嗜水氣單胞菌ST251型菌株中均存在一個(gè)特有的肌醇代謝基因簇，位于由基因水平轉(zhuǎn)移所獲得的基因島上，由12個(gè)基因組成[8]。李首綱等[9]已證實(shí)，肌醇代謝途徑的阻斷會(huì)嚴(yán)重降低嗜水氣單胞菌NJ-35在鯽魚體內(nèi)的定殖能力以及對(duì)斑馬魚的致病力，推測(cè)肌醇代謝可能是決定嗜水氣單胞菌毒力增強(qiáng)的關(guān)鍵因素。

IolR是調(diào)控肌醇代謝通路的一個(gè)重要的負(fù)調(diào)控因子。前期研究發(fā)現(xiàn)IolR不僅參與肌醇的代謝，還參與葡萄糖對(duì)肌醇代謝基因簇的轉(zhuǎn)錄抑制作用[10]，推測(cè)IolR在不同碳源代謝方面發(fā)揮重要作用。本研究在前期工作的基礎(chǔ)上，測(cè)定ΔiolR缺失株對(duì)不同碳源的代謝能力，并且對(duì)ΔiolR缺失株的耐酸、耐氧化、耐高滲、抗吞噬以及耐藥能力進(jìn)行測(cè)定，探究IolR對(duì)嗜水氣單胞菌碳源代謝以及環(huán)境適應(yīng)性的影響，為進(jìn)一步揭示IolR對(duì)嗜水氣單胞菌環(huán)境適應(yīng)性的調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株與細(xì)胞

嗜水氣單胞菌NJ-35(氨芐青霉素抗性，Ampr)(GenBank登錄號(hào)：CP006870)、缺失株ΔiolR(Ampr)、互補(bǔ)株CΔiolR(Ampr)由本實(shí)驗(yàn)室鑒定保存。小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)(ATCC)。

1.2 主要試劑和儀器

DMEM限制性培養(yǎng)基購(gòu)自Meilunbio公司，葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖過(guò)氧化氫酶、藥敏片、Triton X-100、CytoTox 96?Non-Radioactive Cytotoxicity Assay 均購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司，氨芐青霉素購(gòu)自Invitrogen公司，DMEM購(gòu)自Gibco公司。

恒溫?fù)u床和恒溫培養(yǎng)箱均為Thermo公司產(chǎn)品，微型離心機(jī)為Eppendorf公司產(chǎn)品，紫外分光光度計(jì)為Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.3 生長(zhǎng)曲線測(cè)定

將野生株、ΔiolR和CΔiolR培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，調(diào)整各菌株濃度至OD600=1.0，按1∶100(體積比)轉(zhuǎn)接至含不同碳源(終濃度為1%的葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖)的DMEM限制性培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min 震蕩培養(yǎng)，每間隔1 h用分光光度計(jì)測(cè)量OD600值，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.4 抗氧化應(yīng)激能力檢測(cè)

分別挑取野生株、ΔiolR和CΔiolR單菌落于Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基中28 ℃、180 r/min 培養(yǎng)，待液體渾濁后轉(zhuǎn)接至新鮮LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，5 000g離心5 min，棄上清液，用無(wú)菌PBS緩沖液3次，調(diào)節(jié)細(xì)菌濃度至OD600=0.1。加入H2O2至終濃度為2 mmol/L，吹打混勻，在28 ℃孵育1 h，加入2 000 U過(guò)氧化氫酶作用10 min終止氧化。用PBS進(jìn)行10倍比稀釋，取100 μL稀釋液涂布含Amp (100 μg/mL)抗性的LB平板上，28 ℃培養(yǎng)16 h，選取菌落數(shù)在30～300個(gè)之間的平板進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.5 耐酸能力檢測(cè)

將野生株、ΔiolR和CΔiolR培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，5 000g離心5 min，棄上清液，用pH值 5.0 的LB培養(yǎng)液重懸菌體，調(diào)節(jié)OD600=0.1，置于28 ℃ 搖床孵育30 min。PBS進(jìn)行10×倍比稀釋，取100 μL作用的稀釋液涂布含Amp抗性的LB平板上，28 ℃溫箱過(guò)夜培養(yǎng)，選取菌落數(shù)在30～300個(gè)之間的平板進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，并計(jì)算存活率。

1.6 抗高滲透壓能力檢測(cè)

將野生株、ΔiolR和CΔiolR培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，5 000g離心后棄上清液，用氯化鈉終濃度為0.2 mol/L的LB培養(yǎng)基重懸菌體并調(diào)整OD600=1[11]。向24孔細(xì)胞板每孔中加入1 mL上述培養(yǎng)液，按照1∶100(體積比)加入菌液，每株菌設(shè)置3個(gè)樣品重復(fù)，每間隔1 h測(cè)量1次OD600值，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.7 抗吞噬能力檢測(cè)

將野生株、ΔiolR和 CΔiolR培養(yǎng)至生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，用PBS緩沖液洗滌3次，重懸于DMEM培養(yǎng)基中，以感染比(multiplicity of infection，MOI)為1∶1接種至形成單層的 RAW264.7細(xì)胞中，800g離心細(xì)胞板10 min。將細(xì)胞板置于28 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，用無(wú)菌PBS緩沖液洗滌5次，加入含有100 μg/mL慶大霉素的DMEM，置于28 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，用無(wú)菌PBS緩沖液洗滌5次，然后加入1 mL Triton X-100(濃度為0.1%)，室溫裂解細(xì)胞10 min，吹打混勻，10倍比梯度稀釋后涂LB固體平板，28 ℃培養(yǎng)18 h后，取菌落數(shù)在30～300個(gè)之間的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.8 細(xì)胞毒性檢測(cè)

采用乳酸脫氫酶(LDH)釋放法測(cè)定細(xì)菌對(duì) RAW264.7的細(xì)胞毒性。試驗(yàn)參考CytoTox 96?Non-Radioactive Cytotoxicity Assay (Promega)試劑盒說(shuō)明書，并根據(jù)Erova等[12]的方法進(jìn)行適當(dāng)修改。細(xì)胞培養(yǎng)如前所述，試驗(yàn)在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中進(jìn)行，共設(shè)置以下6個(gè)試驗(yàn)組：①細(xì)菌感染細(xì)胞后LDH釋放組：以MOI=1∶1的比例加入制備的細(xì)菌懸液，每孔50 μL；②細(xì)胞LDH最大釋放組：每個(gè)細(xì)胞孔中加入50 μL DMEM培養(yǎng)基；③細(xì)胞LDH自發(fā)釋放組：每個(gè)細(xì)胞孔中加入50 μL DMEM培養(yǎng)基；④細(xì)菌LDH自發(fā)釋放組：每個(gè)空白孔加入中50 μL DMEM培養(yǎng)基以及50 μL細(xì)菌懸液；⑤體積校正組：每個(gè)空白孔中加入100 μL DMEM培養(yǎng)基；⑥培養(yǎng)基背景對(duì)照組：每個(gè)空白孔中加入100 μL DMEM培養(yǎng)基。將所有試驗(yàn)組處理完后，25 ℃、800g離心細(xì)胞培養(yǎng)板10 min，將細(xì)胞培養(yǎng)板置于28 ℃，5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)3 h，在培養(yǎng)結(jié)束前45 min，將10 μL裂解液加入到細(xì)胞LDH最大釋放組和體積校正組中。800g離心10 min，每孔取出50 μL培養(yǎng)上清液至新的96孔細(xì)胞板中，每孔加入50 μL配制好的底物，室溫避光孵育30 min。每孔中加入50 μL終止液，測(cè)定每孔液體的OD490值。按照公示計(jì)算細(xì)胞毒性：

細(xì)胞毒性=[(細(xì)菌感染組-細(xì)菌自發(fā)釋放組-細(xì)胞自發(fā)釋放組)OD值/(細(xì)胞最大釋放組-細(xì)胞自發(fā)釋放組)OD值]×100。

1.9 藥敏試驗(yàn)

將細(xì)菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，調(diào)節(jié)至OD600=0.1。取200 μL菌液均勻涂布于LB瓊脂平板，用無(wú)菌鑷子夾取藥敏紙片貼在平皿表面并輕輕按壓。28 ℃溫箱培養(yǎng)24 h后測(cè)量抑菌圈直徑。質(zhì)控菌株為嗜水氣單胞菌ATCC 7966。

1.10 統(tǒng)計(jì)分析

GraphPad Prism 8.3.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，使用t檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析。當(dāng)P<0.05時(shí)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 在不同碳源限制性培養(yǎng)基中生長(zhǎng)能力檢測(cè)

通過(guò)測(cè)定ΔiolR缺失株在不同碳源限制性培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況來(lái)評(píng)估IolR對(duì)不同碳源的代謝能力的影響。如圖1所示，ΔiolR缺失株在以葡萄糖(圖1A)、果糖(圖1B)、甘露糖(圖1C)和半乳糖(圖1D)為單一碳源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速度均顯著降低，表明IolR有利于葡萄糖、果糖、甘露糖和半乳糖的代謝。

A. 葡萄糖為碳源；B. 果糖為碳源；C. 甘露糖為碳源；D. 半乳糖為碳源

2.2 iolR缺失對(duì)細(xì)菌環(huán)境適應(yīng)性的影響

2.2.1 耐氧化應(yīng)激能力

在LB培養(yǎng)基中添加終濃度為2 mmol/L的 H2O2，模擬強(qiáng)氧化條件進(jìn)行測(cè)定。 結(jié)果如圖2A所示，與野生株相比，ΔiolR缺失株的存活率降低58.98%(P<0.001)，且CΔiolR互補(bǔ)株的存活率恢復(fù)至野生株水平。表明IolR有利于嗜水氣單胞菌的耐氧化應(yīng)激能力。

A. 耐氧化應(yīng)激能力；B. 耐酸能力；C. 耐高滲透壓能力；

2.2.2 耐酸能力

采用LB培養(yǎng)基(pH=5)，模擬酸性環(huán)境進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果如圖2B所示，ΔiolR缺失株的存活率顯著低于野生株(P<0.05)，且CΔiolR互補(bǔ)株的耐酸能力恢復(fù)至野生株水平，說(shuō)明IolR有利于嗜水氣單胞菌的耐酸能力。

2.2.3 耐高滲透壓能力

采用高滲透壓條件(0.2 mol/L NaCl)培養(yǎng)野生株、ΔiolR和CΔiolR，觀察生長(zhǎng)情況。如圖2C所示，在正常滲透壓條件下，野生株和ΔiolR的生長(zhǎng)速度基本一致；在高滲環(huán)境下，ΔiolR缺失株的生長(zhǎng)速度略快于野生株(P<0.05)。說(shuō)明IolR負(fù)向調(diào)控嗜水氣單胞菌的耐高滲透壓能力。

2.3 iolR缺失對(duì)細(xì)菌抗吞噬能力的影響

如圖3所示，RAW264.7巨噬細(xì)胞對(duì)ΔiolR缺失株的吞噬率顯著高于野生株，并且ΔiolR缺失株對(duì)巨噬細(xì)胞的毒性顯著降低，表明IolR不僅有助于細(xì)菌抵抗巨噬細(xì)胞的吞噬作用，還可以增強(qiáng)嗜水氣單胞菌對(duì)巨噬細(xì)胞的毒性作用。

圖3 野生株、ΔiolR和CΔiolR的抗吞噬能力(A)及細(xì)胞毒性(B)

2.4 藥物敏感性檢測(cè)

藥敏試驗(yàn)結(jié)果見圖4。由圖4可以看出，ΔiolR缺失株對(duì)慶大霉素、妥布霉素、頭孢曲松、頭孢噻肟的敏感性顯著強(qiáng)于野生株(P<0.001，圖4A、圖4B、圖4C、圖4D)，而對(duì)青霉素、恩諾沙星、復(fù)方新諾明、羅紅霉素、諾氟沙星、萬(wàn)古霉素6種抗生素的敏感性均未改變(P<0.05)，見圖4E、圖4F、圖4G、圖4H、圖4I、圖4J，CΔiolR互補(bǔ)株的抗性均能恢復(fù)至野生水平，表明IolR的存在有助于嗜水氣單胞菌抵抗慶大霉素、妥布霉素、頭孢曲松、頭孢噻肟4種抗生素的殺傷作用。

圖4 野生株、ΔiolR和CΔiolR的藥物敏感性

3 討論

由于環(huán)境中的營(yíng)養(yǎng)限制以及在宿主體內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)壓力，迫使病原菌獲得特定的代謝能力，進(jìn)而克服營(yíng)養(yǎng)限制。越來(lái)越多的證據(jù)表明，病原體已經(jīng)開發(fā)出特定的肌醇代謝策略來(lái)克服這些限制，從而增強(qiáng)其在不同環(huán)境中的適應(yīng)能力[13-14]。

前期研究發(fā)現(xiàn)在嗜水氣單胞菌ST251型菌株中鑒定到一個(gè)特有的肌醇代謝基因簇，可用于肌醇的代謝[8]。肌醇是一種多元醇，廣泛存在于機(jī)體的各種組織中，是維持機(jī)體正常生理功能必不可少的低分子有機(jī)物[15]。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，肌醇常作為營(yíng)養(yǎng)促生長(zhǎng)劑添加在飼料中，以提高飼料的利用率，降低魚類的餌料系數(shù)，加快其生長(zhǎng)速度[16]。IolR是調(diào)控肌醇代謝通路的一種重要的負(fù)調(diào)控因子，廣泛存在于谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacteriumglutamicum)[17]、沙門菌(Salmonella)[18]、產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)[19]、嗜肺軍團(tuán)菌(Legionellapneumophila)[14]、白色念珠菌(Candidaalbicans)[13]以及豬肺炎支原體(Mycoplasmahyopneumoniae)[20]中。IolR屬于RpiR家族成員，該家族轉(zhuǎn)錄因子通常參與多種碳源的代謝。碳代謝是細(xì)菌最基本的代謝之一，碳源獲取對(duì)于病原菌適應(yīng)宿主體內(nèi)的環(huán)境條件 (如pH值、滲透壓等)，提高其在宿主體內(nèi)的生存能力尤為重要。本研究結(jié)果顯示，IolR有利于嗜水氣單胞菌對(duì)葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖等宿主體內(nèi)常見碳源的利用。然而，Zhou等[17]研究表明，IolR的缺失可上調(diào)谷氨酸棒桿菌的葡萄糖激酶ppgk基因和glk基因表達(dá)，從而促進(jìn)葡萄糖的利用。有研究表明IolR可以通過(guò)激活劑或抑制劑雙重身份參與靶基因的調(diào)控。例如，在谷氨酸棒狀桿菌中，IolR既可作為肌醇代謝基因的抑制因子參與肌醇的利用，也可作為pck基因的激活因子參與糖酵解過(guò)程[21]。因此，推測(cè)IolR可能通過(guò)直接調(diào)控糖代謝相關(guān)基因的表達(dá)，從而參與嗜水氣單胞菌對(duì)葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖的利用。

除了獲取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)外，病原菌在感染過(guò)程中還要應(yīng)對(duì)宿主體內(nèi)高滲透壓、強(qiáng)酸等不利環(huán)境的刺激。Zhu等[22]研究發(fā)現(xiàn)，RpiR家族調(diào)控因子RpiRc的缺失可降低金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)對(duì)過(guò)氧化氫的敏感性。本研究對(duì)嗜水氣單胞菌在高滲透壓、強(qiáng)氧化以及強(qiáng)酸等環(huán)境的生存能力進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示iolR缺失后，嗜水氣單胞菌的耐酸能力和抗氧化能力均顯著下降，而耐滲透壓能力略有增強(qiáng)，表明IolR在調(diào)控嗜水氣單胞菌對(duì)不同脅迫環(huán)境的適應(yīng)能力方面發(fā)揮重要作用。嗜水氣單胞菌對(duì)酸性應(yīng)激和氧化應(yīng)激的耐受能力，對(duì)于其抵抗巨噬細(xì)胞的吞噬具有重要意義。Ma等[23]研究發(fā)現(xiàn)，RpiR家族調(diào)控因子AsiR的缺失可導(dǎo)致鼠傷寒沙門菌(Salmonellatyphimurium)在巨噬細(xì)胞中的存活能力增強(qiáng)。本試驗(yàn)檢測(cè)了野生株、ΔiolR缺失株和互補(bǔ)株的抗巨噬細(xì)胞吞噬能力以及對(duì)巨噬細(xì)胞的毒性作用，結(jié)果顯示，巨噬細(xì)胞對(duì)ΔiolR缺失株的吞噬能力顯著增強(qiáng)，且其對(duì)巨噬細(xì)胞的毒力顯著降低，表明IolR不僅有助于嗜水氣單胞菌抵抗巨噬細(xì)胞的吞噬作用，還可增強(qiáng)其對(duì)巨噬細(xì)胞的毒性作用。另外，通過(guò)差異轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，與野生株相比，ΔiolR缺失株的耐酸、耐氧化以及抗吞噬相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平均顯著下調(diào)(待發(fā)表)，推測(cè)IolR可能直接參與耐酸、耐氧化以及抗吞噬相關(guān)基因的表達(dá)，但其具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

由于抗生素的濫用，水體環(huán)境已經(jīng)成為自然環(huán)境中抗生素殘留的主要載體之一，這就導(dǎo)致細(xì)菌長(zhǎng)期暴露在低濃度的抗生素環(huán)境中，對(duì)細(xì)菌在水體環(huán)境中的生存造成極大威脅。本研究對(duì)水體環(huán)境中殘留量較多的10種抗生素進(jìn)行藥敏分析，結(jié)果表明IolR有助于嗜水氣單胞菌抵抗頭孢噻肟、頭孢曲松、妥布霉素、慶大霉素等4種抗生素的殺傷。細(xì)菌常見的耐藥機(jī)制主要包括藥物結(jié)合靶點(diǎn)突變、外排泵系統(tǒng)以及質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥基因水平轉(zhuǎn)移等。差異轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，IolR的缺失可導(dǎo)致嗜水氣單胞菌耐藥相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄下調(diào)，并且凝膠遷移試驗(yàn)(EMSA)結(jié)果證實(shí)，IolR可以直接結(jié)合外排泵基因的啟動(dòng)子區(qū)域(待發(fā)表)，推測(cè)IolR可能直接調(diào)控外排泵基因的表達(dá)，從而降低藥物的外排。

目前，對(duì)于IolR功能的研究主要集中在其作為負(fù)調(diào)控因子參與肌醇代謝。然而，本研究結(jié)果證實(shí)，IolR轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子參與嗜水氣單胞菌的耐酸、耐氧化、耐藥、抗巨噬細(xì)胞吞噬以及碳源利用等重要生物學(xué)過(guò)程，表明該調(diào)控因子在嗜水氣單胞菌的生存及環(huán)境適應(yīng)性方面發(fā)揮重要作用。