張永浩，郭麗君，閆偉，王玉濤*

(1. 喀什大學(xué)生命與地理科學(xué)學(xué)院，新疆 喀什 844000；2. 江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院動物科技學(xué)院，江蘇 泰州 225300)

內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)(endogenous cannabinod system，ECS)是一個多功能的信號系統(tǒng)，由酰胺、酯類和長鏈不飽和酸組成的脂質(zhì)分子[1]。直接或間接參與多種生理過程，由內(nèi)源性大麻素、大麻素受體及與之相關(guān)的合成、水解酶共同構(gòu)成[2]。大麻素受體主要包括CB1和CB2，且兩者均屬于具有7次跨膜結(jié)構(gòu)的G蛋白偶聯(lián)受體家族。CB1分布廣泛，在大腦皮層、下丘腦、肝臟、脂肪組織、骨骼肌、胃腸道均有分布[3]，為7次跨膜G蛋白偶聯(lián)受體，能耦聯(lián)并活化Gi蛋白，抑制腺苷環(huán)化酶活性，進而降低cAMP水平；還能抑制鈣離子通道、活化鉀離子通道及絲裂原活化蛋白激酶[4]。CB2基因主要表達于外周免疫器官，參與免疫調(diào)節(jié)過程。CB1在結(jié)構(gòu)上一個重要特征是：激動劑與CB1結(jié)合比拮抗劑與CB1結(jié)合體積會發(fā)生變化，這種可塑性使CB1能夠?qū)Ω鞣N不同的配體做出反應(yīng)，這與CB1調(diào)節(jié)不同生理活動或心理狀態(tài)的功能是一致的[5]。CB1基因的高表達是對慢性循環(huán)的內(nèi)源性大麻素的反應(yīng)[7]，且CB1基因在治療肥胖[8]，減緩藥物成癮[9]，調(diào)節(jié)抑郁[10]，緩解帕金森綜合征[11]，乃至化妝品研發(fā)[12]和生殖方面[13]均有一定效果。

如今在羊肉產(chǎn)量滿足人們需求的同時，人們對羊肉口感的要求越來越高。肌內(nèi)脂肪含量(IMF)是評價羊肉性狀的一個重要指標，直接影響羊肉的風(fēng)味、嫩度、適口性、多汁性[14]。此外，因羊肉價格遠遠高于豬肉和雞肉[15]，這間接影響著人們需求，直接和間接因素均會影響羊肉商品特性和經(jīng)濟效益。多浪羊是新疆的一個優(yōu)良品種，是由新疆喀什市麥蓋提縣當?shù)亻L期培育而成的地方品種，具有生長迅速，肉質(zhì)鮮美的特點，深受南北疆牧民的喜愛，又稱“麥蓋提羊”。動物脂肪不僅作為人體重要的能源物質(zhì)，而且為人類供給了許多必需脂肪酸，協(xié)助脂溶性維生素的吸收。作為肉食品來講，脂肪組分和加工原材料均很重要，因此調(diào)節(jié)脂肪含量成為了研究熱點問題[16-17]。為了滿足消費者對高質(zhì)量羊肉制品的需求及挖掘其巨大的經(jīng)濟潛力，研究綿羊脂肪沉積的生物學(xué)機制已成為近年來研究熱點。本研究旨在分析綿羊CB1基因?qū)?nèi)脂肪沉積的影響，為進一步揭示動物肉質(zhì)調(diào)控的生物學(xué)機制提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持，具有重要的理論意義和應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及樣品

樣品取自喀什德吾苒屠宰場。采集不同月齡(3、6、12月齡)多浪羊各3只，每只采其背最長肌、皮下脂肪、腹部脂肪、腸系膜組織用于索氏抽提、脂肪代謝酶活測定、石蠟切片、RNA和DNA提取。

1.2 主要試劑

TRIzol提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒、2×TaqPCR Mix均購自中科瑞泰(北京)生物科技有限公司；A067總脂酶(脂蛋白脂肪酶/肝脂酶、LPL/HL)測試盒、綿羊激素敏感性甘油三酯脂肪酶(HSL)酶聯(lián)免疫檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.3 熒光定量PCR(RT-qPCR)

按照TRIzol試劑使用說明書方法進行操作。對不同月齡多浪羊胴體不同部位組織(背最長肌、皮下脂肪、腹部脂肪、腸系膜)的總RNA進行提取。提取方法為：取組織進行液氮研磨至粉狀，加入TRIzol搖勻，冰上靜置，棄去上層油脂，加入氯仿離心取上清液，加入預(yù)冷的異丙醇，離心使總RNA沉淀，并用75%酒精洗滌。使用瓊脂糖檢測和紫外分光光度計對符合要求的總RNA進行反轉(zhuǎn)錄[18]及熒光定量分析，具體操作步驟為：95 ℃初始變30 s；95 ℃變性50 s，60 ℃退火延伸60 s，共計40個循環(huán)，熔解曲線遵循7500 Real Time PCR System機器自帶程序繪制。

1.4 CB1擴增

由改進過的酚氯仿法[19]提取總DNA，并參考劉賢勛[30]設(shè)計引物，擴增片段1 400 bp左右的CB1編碼區(qū)，引物由金唯智生物技術(shù)有限公司合成，PCR擴增后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，產(chǎn)物送至艾康健武漢生物技術(shù)有限公司測序。

表1 CB1基因引物信息

1.5 脂肪測定

參照食品安全國家標準GB 5009.6—2016《食品中脂肪的測定》索氏抽提法進行操作。

1.6 脂肪代謝相關(guān)酶活測定

用比色法測定LPL和HL酶活性。用酶聯(lián)免疫吸附試驗測定HSL酶活性。

1.7 脂肪細胞面積測定

將采回的樣品立即放入4%中性甲醛溶液中浸泡10 h，將固定好的樣品切成2.5 cm×2.5 cm×1 cm的樣品在自來水下洗滌固定液10 h，用梯度酒精(70%、80%、90%、95%、100%)各40 min脫水；酒精二甲苯、二甲苯各透明30 min；在63 ℃條件下二甲苯石蠟、石蠟各浸蠟2 h；包埋切片，采用HE染色法染色，置于10×40倍鏡下進行切片圖像采集，將每個組織做2個載玻片的切片，每張切片隨機選4個視野，拍照導(dǎo)入Image Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)中，每個視野均勻選取9個細胞，共計72個細胞，進行平均面積的計算。在Image Pro Plus 6.0中進行空間校正并設(shè)置好標尺，用自動繪圖法并人工校正，對隨機選取的9個細胞進行面積的測量。

1.8 相關(guān)性分析

SPSS 22.0、Image Pro Plus 6.0、MEGA等軟件對細胞和測序數(shù)據(jù)進行整理分析，對各處理間的差異采用LSD法和鄧肯法進行0.05水平上的顯著性檢驗；并進行不同月齡差異性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 CB1基因分析

2.1.1 CB1基因表達量分析

提取不同月齡綿羊背最長肌、皮下脂肪、腹部脂肪、腸系膜組織的總RNA，對其完整性、純度進行檢測。通過綿羊CB1、GAPDH基因溶解曲線圖可知，得到的樣本mRNA表達量準確性高(圖略)。經(jīng)過2-ΔΔCt法測得CB1基因mRNA相對表達量，測定結(jié)果如圖1所示。CB1基因表達量隨著年齡的增長而逐步提高，且均表現(xiàn)為在6～12月齡的增長速率高于3～6月齡的增長速率。背最長肌3～6月齡CB1表達量增長了128.07%，6～12月齡CB1表達量增長了107.69%；腹部脂肪在3～6月齡CB1表達量增長了160%，在6～12月齡增長了143.65%；皮下脂肪3～6月齡CB1表達量增長了352.9%，6～12月齡CB1表達量增長了88.3%；腸系膜組織3～6月齡CB1表達量增長了135.69%，6～12月齡CB1表達量增長了74.29%。

圖1 CB1基因mRNA相對表達量

2.1.2 CB1基因CDS序列分析

將不同月齡的多浪羊CB1基因進行PCR擴增并測序。用MEGA軟件對多浪羊CB1基因與綿羊(XM 004011281.4)、山羊(XM 018053156.1)、大羚羊(XM 040238815.1)、加拿大盤羊(CP 011893.1)、野牦牛(XM 005889296.1)的CB1基因構(gòu)建NJ進化樹。由圖2可知，多浪羊與綿羊、加拿大盤羊聚為一支，與山羊的關(guān)系比大羚羊、野牦牛的近。

注：1A～1C為3只12月齡多浪羊，2A～2C為3只6月齡多浪羊，3A～3C為3只3月齡多浪羊

用DNASP軟件分析結(jié)果見表2。共發(fā)現(xiàn)了6個單倍型，4個變異位點，核苷酸差異系數(shù)(Pi)為0.001 16，單倍型多樣性(Hd)為0.778，核苷酸平均差異度(K)為1.4，同義替換率(ds)為0.003 24，非同義替換率(dn)為0.000 39，dn/ds=0.12，可知基因進化比較平緩穩(wěn)定，中性測試不顯著(P>0.1)，因此，根據(jù)中性進化模型受環(huán)境人為影響較少。A+T平均比例為42.87%，G+C平均比例為57.13%。G+C含量高于A+T含量，說明存在1定的堿基偏倚性。僅存在一個氨基酸替換，且經(jīng)過在線軟件分析(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)得出氨基酸替換對蛋白質(zhì)影響概率為0.188，可見氨基酸對蛋白質(zhì)的影響較為溫和(表3、圖3)。

圖3 CB1基因編碼區(qū)SNP預(yù)測

表2 CB1基因編碼區(qū)變異位點

表3 CB1氨基酸變異位點

由圖4可知，H_1(與NCBI中XM_004011281.4序列一致)為優(yōu)勢單倍型。

圖4 多浪羊CB1基因單倍型network網(wǎng)絡(luò)圖

2.2 脂肪含量測定

經(jīng)索氏抽提測得脂肪含量，測定結(jié)果見圖5。背部脂肪含量顯著低于其他部位的脂肪含量，且不同部位皆隨著月齡的增加，上升趨勢明顯。背最長肌3～6月齡提高了103.45%，6～12月齡提高了84.26%。腹部脂肪3～6月齡提高了314.47%，6～12月齡提升了1.21%。皮下脂肪3～6月齡提高了60.4%，6～12月齡提高了-2.19%。腸系膜組織3～6月齡提高了23.23%，6～12月齡提高了3.84%。由圖5可知，在1年內(nèi)背最長肌一直以比較均勻的速度增長；皮下脂肪、腹部脂肪、腸系膜組織的脂肪在3～6月份增長速度高于6～12月份的增長速度。

圖5 脂肪含量變化

2.3 脂肪代謝酶活測定

本試驗采取比色法、酶聯(lián)免疫吸附法對多浪羊背最長肌、皮下脂肪、腹部脂肪、腸系膜組織的酶活性進行測定，測定結(jié)果見圖6。用比色法對肝脂酶酶活性進行測定，測定背最長肌在3～6月齡肝脂酶的活性增長了289.38%，在6～12月齡肝脂酶的活性增長了-32.697%；腹部脂肪在3～6月齡肝脂酶的活性增長了501.523%，在6～12月齡肝脂酶的活性增長了52.15%；皮下脂肪在3～6月齡肝脂酶的活性增長了120.56%，在6～12月齡肝脂酶的活性增長了-8.22%；腸系膜組織在3～6月齡肝脂酶的活性增長了230.23%，在6～12月齡肝脂酶的活性增長了21.78%。

圖6 肝脂酶活性變化

不同月齡HSL活性變化見圖7。皮下脂肪、腹部脂肪、腸系膜組織中的HSC均在6月齡達到最高，背最長肌在6月齡達到最低。背最長肌在3～6月齡HSL酶活性增長了-11.84%，在6～12月齡HSL酶活性增長了29.1%；腹部脂肪在3～6月齡HSL酶活性增長了132.52%，在6～12月齡HSL酶活性增長了-12.87%；皮下脂肪在3～6月齡HSL酶活性增長了254.3%，在6～12月齡HSL酶活性增長了-18.99%；腸系膜組織在3～6月齡HSL酶活性增長了6.868%，6～12月齡HSL酶活性增長了-36.8%。

圖7 激素敏感性甘油三酯脂肪酶含量變化

不同月齡LPL酶活性變化見圖8。脂蛋白脂肪酶在整個生長階段，酶活隨著月齡的增加而提高，其中皮下脂肪、腹部脂肪、腸系膜組織中酶活在6～12月齡的增長速率高于3～6月齡的增長速率；背最長肌中酶活在3～6月齡的增長速率高于6～12月齡的增長速率。背最長肌在3～6月齡脂蛋白脂肪酶活性增長了127.69%，在6～12月齡脂蛋白脂肪酶活性增長了31.07%；腹部脂肪在3～6月齡脂蛋白脂肪酶活性增長了140.23%，在6～12月齡脂蛋白脂肪酶活性增長了143.9%。皮下脂肪在3～6月齡脂蛋白脂肪酶活性增長了-23.02%，在6～12月齡脂蛋白脂肪酶活性增長了330.1%。腸系膜組織在3～6月齡脂蛋白脂肪酶活性增長了13.94%，在6～12月齡脂蛋白脂肪酶活性增長了72.76%。

圖8 脂蛋白脂肪酶活性變化

2.4 組織學(xué)觀察

采取石蠟切片法對多浪羊背最長肌、皮下脂肪、腹部脂肪、腸系膜組織的脂肪細胞大小進行測定。由圖9、圖10可知，不同月齡4個部位的脂肪組織進行HE染色后，各個部位組織切片上幾乎都能觀察到大小均一的脂肪細胞，脂肪細胞飽滿，細胞形態(tài)呈圓形、橢圓形或多邊形，胞漿中存在大型脂滴，細胞核和細胞器被壓迫到邊緣、形態(tài)完整無破損。

圖9 不同月齡背最長肌、腹部脂肪形態(tài)(400×)

圖10 不同月齡皮下脂肪、腸系膜組織形態(tài)(400×)

由圖11可見，在整個生長階段背最長肌、皮下脂肪、腹部脂肪、腸系膜組織中脂肪細胞大小隨著月齡的增加而逐步變大，且均表現(xiàn)為在3～6月齡的增長速率高于6～12月齡的增長速率。背最長肌在3～6月齡脂肪細胞面積增長了158.06%，在6～12月齡脂肪細胞面積增長了22.4%；腹部脂肪在3～6月齡脂肪細胞面積增長了260.6%，在6～12月齡脂肪細胞面積增長了33.87%；皮下脂肪在3～6月齡脂肪細胞面積增長了128.7%，在6～12月齡脂肪細胞面積增長了19.28%；腸系膜組織在3～6月齡脂肪細胞面積增長了136.8%，在6～12月齡脂肪細胞增長了50.43%。

圖11 細胞面積變化

2.5 CB1基因與性狀的關(guān)聯(lián)性分析

如表4所示，CB1基因表達量與各組織的脂肪含量呈顯著正相關(guān)(背最長肌相關(guān)系數(shù)為0.989，P<0.01；皮下脂肪相關(guān)系數(shù)為0.813，P<0.01；腹部脂肪相關(guān)系數(shù)為0.736，P<0.05；腸系膜組織相關(guān)系數(shù)為0.889，P<0.01)。

表4 不同日齡CB1基因相對表達量與各項指標的相關(guān)性分析

CB1基因表達量與各組織中脂肪細胞大小呈顯著正相關(guān)(背最長肌相關(guān)系數(shù)為0.88，P<0.01；皮下脂肪相關(guān)系數(shù)為0.95，P<0.01；腹部脂肪相關(guān)系數(shù)為0.904，P<0.01；腸系膜組織相關(guān)系數(shù)為0.992，P<0.01)。

CB1基因表達量與HL酶活性相關(guān)性在不同部位呈現(xiàn)出不同的結(jié)果，在皮下脂肪，腹部脂肪，腸系膜組織中呈顯著正相關(guān)(皮下脂肪相關(guān)系數(shù)為0.759，P<0.05；腹部脂肪相關(guān)系數(shù)為0.932，P<0.01；腸系膜組織相關(guān)系數(shù)為0.928，P<0.01)，在背最長肌中無顯著相關(guān)性。

CB1基因與HSL酶活性相關(guān)性在不同部位呈現(xiàn)出不同的結(jié)果，在皮下脂肪和腸系膜組織中呈顯著正相關(guān)(皮下脂肪相關(guān)系數(shù)為0.676，P<0.05；腸系膜組織相關(guān)系數(shù)為-0.769，P<0.05)在背最長肌和腹部脂肪中無顯著相關(guān)性。

CB1基因表達量與各組織中LPL酶活性呈顯著正相關(guān)(背最長肌相關(guān)系數(shù)為0.861，P<0.01；皮下脂肪相關(guān)系數(shù)為0.837，P<0.01；腹部脂肪相關(guān)系數(shù)為0.998，P<0.01；腸系膜組織相關(guān)系數(shù)為0.915，P<0.01)。

2.6 月齡與脂肪沉積相關(guān)指標的差異性分析

如表5所示，背最長肌粗脂肪含量與年齡呈現(xiàn)出顯著的差異性，皮下脂肪、腹部脂肪和腸系膜組織粗脂肪含量與年齡相關(guān)性差異性不顯著。

表5 不同月齡各項指標的差異性分析

不同部位脂肪組織大小皆與年齡呈現(xiàn)出顯著的差異性(P<0.01)。不同部位CB1表達量皆與年齡呈現(xiàn)出顯著的差異性(P<0.05)，HL酶活性皆與年齡呈現(xiàn)出顯著的差異性(P<0.05)。

背最長肌、皮下脂肪和腹部脂肪部位HSL酶活性與年齡呈現(xiàn)出顯著性差異(P<0.05)，對于腸系膜組織中HSL酶活性3月齡與6月齡差異性不顯著(P>0.05)，二者與12月齡酶活性呈現(xiàn)出顯著性差異(P<0.05)。

背最長肌和腹部脂肪中LPL酶活性與年齡呈現(xiàn)出顯著性差異(P<0.05)，皮下脂肪和腸系膜組織中LPL酶活性3月齡與6月齡差異性不顯著(P>0.05)，但二者與12月齡酶活性呈現(xiàn)出顯著性差異(P<0.05)。

3 討論

魏宗友等[20]研究發(fā)現(xiàn)，隨著日糧的增加，腹脂率會隨HL活性增強呈現(xiàn)出不同程度的提高；涂瑋等[21]在羅非魚上也發(fā)現(xiàn)有這種趨勢，隨著飼料水平的升高，羅非魚的HL活性呈現(xiàn)出先升高后下降的趨勢；HL酶與LPL酶在功能上相似主要在中密度脂蛋白和高密度脂蛋白代謝中起作用是重要的參與者，但不是唯一主要因素[22]與本研究結(jié)論相一致。王剛等[23]、喬永等[24]研究發(fā)現(xiàn)，LPL表達與脂肪含量呈正相關(guān)關(guān)系，在發(fā)育早期哈薩克羊LPL酶活性隨著年齡的增加而增加，在后期保持在一個穩(wěn)定的水平，與本研究結(jié)果一致。徐小春等[25]研究結(jié)果顯示，灘羊尾部脂肪中HSL酶活性總體隨著月齡的增加呈現(xiàn)上升→下降→上升→下降的趨勢，且在尾部脂肪、皮下脂肪、背最長肌中差異明顯；Carole等[26]研究HSL基因表達水平在一定程度上與甘油三酯含量呈負相關(guān)的結(jié)果與本研究相一致。楊雪等[27]研究認為皮下脂肪、內(nèi)臟脂肪的形成速率比肌內(nèi)脂肪要高；羅鑫等[28]試驗中肉羊在8月齡之前生長速度比較快，尤其在5月齡左右生長最快，此結(jié)論與本研究結(jié)果相一致。本研究結(jié)果表明，腹部脂肪細胞面積>皮下脂肪細胞面積>腸系膜組織細胞面積>背最長肌細胞面積。王金泉等[29]研究發(fā)現(xiàn)阿勒泰大尾羊在3月齡期間腎周脂肪細胞面積為2 000 μm2，皮下脂肪含量較少。這一結(jié)論與本試驗多浪羊的研究結(jié)果一致，9月齡期間多浪羊脂肪細胞面積略高于阿勒泰羊脂肪細胞面積，可能由于阿勒泰羊生活在山地運動較多原因所致。本試驗CB1基因在各個組織中均有表達，在脂肪組織中表達量最高，極顯著高于其他組織，其次在肺臟、肝臟、腎臟、背最長肌中表達，在心臟和脾臟中表達量最低，與劉賢勛等[30]的研究結(jié)果相一致。CB1基因編碼區(qū)分析可知H1為多浪羊主要單倍型，且CB1基因進化較為保守，受環(huán)境影響較小。魏星燦等[31]發(fā)現(xiàn)豬的CB1基因同源性較高，且在進化中受到純化選擇的作用；劉賢勛等[30]發(fā)現(xiàn)，布萊凱特黑牛的CB1基因在生物進化過程中非常保守，顯示出高度保守的同源性。由CB1相關(guān)性分析可知，CB1基因表達量與腹部脂肪含量顯著相關(guān)，與背最長肌、皮下脂肪、腸系膜組織脂肪含量極顯著相關(guān)，與各部位脂肪細胞面積大小極顯著相關(guān)，與脂肪代謝酶相關(guān)性隨著部位不同表現(xiàn)出不同的相關(guān)性。

CB1基因編碼區(qū)相對保守，環(huán)境對其影響較小。且多浪羊CB1基因表達量與脂肪細胞面積呈極顯著正相關(guān)，與脂肪含量成顯著正相關(guān)。與脂肪代謝酶相關(guān)性在不同部位、不同月齡表現(xiàn)出了不同的相關(guān)性。整體表現(xiàn)為CB1基因?qū)PL的影響高于HL的影響，高于對HSL的影響。

綜上可知，多浪羊CB1基因可能不僅限于通過改變酶活性代謝的方式調(diào)控脂肪沉積，具體調(diào)控機制有待進一步研究。本研究為進一步揭示動物肉質(zhì)調(diào)控的生物學(xué)機制提供理論和技術(shù)支持。