宮洪杰，畢曉燕，崔凱，高惠，馬澤芳*

(1. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東 青島 266109；2. 山東省乳山市夏村鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站，山東 乳山 264500)

水貂是一種季節(jié)性繁殖動(dòng)物，其性腺的發(fā)育、衰退及生殖機(jī)能活動(dòng)都存在明顯的季節(jié)性變化規(guī)律，這主要受光照周期變化的調(diào)控[1-2]。而光照周期變化主要通過(guò)調(diào)節(jié)松果體中褪黑激素(melatonin，MLT)的合成與分泌，使體內(nèi)內(nèi)分泌系統(tǒng)發(fā)生改變，進(jìn)而調(diào)控體內(nèi)生殖激素的合成與分泌，從而通過(guò)調(diào)節(jié)生殖功能來(lái)實(shí)現(xiàn)季節(jié)性繁殖[3-4]。Allain等[5]研究表明，給不同生理階段水貂埋植MLT后，能明顯促進(jìn)公貂睪丸重量的增加、母貂各級(jí)卵泡的提前發(fā)育以及血清促性腺激素釋放激素(gonadotropin releasing hormone，GnRH)、孕酮(progesterone，P4)、促卵泡素(follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH)、促黃體生成素(luteinizing hormone，LH)和雌二醇(estradiol，E2)的提前分泌[5-7]。晏子越等[8]給配種準(zhǔn)備期母貂埋植172 d MLT后發(fā)現(xiàn)，能促使卵巢發(fā)育、可視卵泡、原始卵泡和初級(jí)卵泡數(shù)量的增多及有腔卵泡的發(fā)育。然而，有關(guān)MLT對(duì)發(fā)情期母貂卵巢發(fā)育和血清主要生殖激素影響的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)基于MLT埋植劑的埋植時(shí)間，埋植239 d后的水貂正處于配種階段，而此時(shí)也處于發(fā)情期，因此，通過(guò)對(duì)比埋植239 d MLT和未埋植MLT發(fā)情期水貂卵巢形態(tài)學(xué)、卵泡發(fā)育及血清主要生殖激素含量的差異性變化，探討MLT埋植劑對(duì)水貂卵巢形態(tài)學(xué)和卵泡發(fā)育的影響機(jī)制，為MLT埋植劑技術(shù)應(yīng)用于水貂生產(chǎn)實(shí)踐提供重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)地為山東省諸城市某水貂養(yǎng)殖場(chǎng)。隨機(jī)選取2～2.5月齡、健康、體重均勻(870±5)g的雌性紅眼白水貂200只，隨機(jī)平均分為對(duì)照組和試驗(yàn)組，每組100個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1只。試驗(yàn)組于試驗(yàn)開(kāi)始當(dāng)天使用MLT皮下埋植器在水貂頸部皮下埋植MLT埋植劑，1粒/只(每粒含MLT 18 mg)，對(duì)照組不做任何處理。試驗(yàn)共進(jìn)行239 d(2020年7月7日至2021年3月3日)。

1.2 飼養(yǎng)管理

水貂于南北走向的棚舍單籠飼養(yǎng)。試驗(yàn)期內(nèi)采用自然光照，每天由專(zhuān)人定時(shí)飼喂2次，使用飲水器自動(dòng)飲水，其日糧參照水貂養(yǎng)殖生產(chǎn)中的經(jīng)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行，基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(按干物質(zhì)計(jì)算)

1.3 測(cè)定指標(biāo)與方法

于試驗(yàn)結(jié)束當(dāng)天隨機(jī)選取對(duì)照組和試驗(yàn)組水貂各4只，先找到試驗(yàn)組水貂的MLT埋植劑顆粒后，再進(jìn)行心臟采血5 mL/只，4 ℃靜置30 min以上后，使用3 000 r/min的離心機(jī)(S1010E)離心5 min后分離血清，-20 ℃保存。

心臟采血處死水貂剝皮后，采集右側(cè)卵巢，測(cè)量形態(tài)學(xué)指標(biāo)后將卵巢放于有10%中性甲醛溶液中固定。

1.3.1 卵巢形態(tài)指標(biāo)及測(cè)量方法

用電子天平稱(chēng)量卵巢的重量。用游標(biāo)卡尺測(cè)量卵巢的長(zhǎng)徑、寬徑和厚徑，并計(jì)算體積。

1.3.2 卵泡發(fā)育指標(biāo)及測(cè)定方法

隨機(jī)選取固定于10%中性甲醛溶液中已固定48 h的右側(cè)卵巢每組各3枚，經(jīng)洗滌、脫水、透明處理后進(jìn)行石蠟包埋，并使用手搖式組織切片機(jī)(Leica RM2235)，以5 μm的厚度進(jìn)行連續(xù)切片，每隔6張切片選取1張，每枚卵巢共選取5張切片，共計(jì)30張，經(jīng)HE染色后封片，使用光學(xué)顯微鏡(BK系列生物顯微鏡)觀察各級(jí)卵泡的顯微結(jié)構(gòu)，記錄各級(jí)卵泡數(shù)量，用目鏡測(cè)微尺測(cè)量各級(jí)卵泡和卵母細(xì)胞的直徑及透明帶厚度，并用顯微照相機(jī)拍照。

卵泡的分類(lèi)方法借鑒李云龍等[9]對(duì)卵泡的分類(lèi)方法，即根據(jù)卵泡大小、透明帶的形成、卵泡腔出現(xiàn)的時(shí)間以及卵母細(xì)胞的發(fā)育程度，將卵泡分為原始卵泡、初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡、三級(jí)卵泡和成熟卵泡5種類(lèi)型。

1.3.3 血清主要生殖激素指標(biāo)及測(cè)定方法

從2個(gè)組水貂的待測(cè)血清樣本中各取血清10 μL，使用酶標(biāo)儀(Tecan Infinite F50)，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法進(jìn)行血清FSH、LH、E2、P4含量的測(cè)定。以上4種ELISA試劑盒(水貂專(zhuān)用)均購(gòu)自上海，試驗(yàn)操作按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，并根據(jù)各激素標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算FSH、LH、E2、P4在血清中的含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均用Miscrosoft Excel進(jìn)行處理，利用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所得的試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，P>0.05為差異不顯著，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 卵巢形態(tài)

由表2可知，試驗(yàn)組水貂的卵巢長(zhǎng)度、寬度、厚度及重量均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，體積極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，說(shuō)明MLT埋植劑埋植239 d對(duì)卵巢的形態(tài)發(fā)育有促進(jìn)作用。

表2 水貂卵巢形態(tài)統(tǒng)計(jì)結(jié)果(n=4)

2.2 各級(jí)卵泡顯微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果

由圖1可見(jiàn)，原始卵泡數(shù)量多、體積小，由中央一個(gè)初級(jí)卵母細(xì)胞及周?chē)粚油暾虿煌暾谋馄交蛄⒎铰雅菁?xì)胞構(gòu)成，沒(méi)有卵泡膜和透明帶。由圖2可見(jiàn)，初級(jí)卵泡的初級(jí)卵母細(xì)胞體積不斷增大，周?chē)蓡螌颖馄阶優(yōu)榱⒎交蛑鶢罴?xì)胞的卵泡顆粒細(xì)胞圍繞，層數(shù)增殖為1～3層，逐漸形成不完整的卵泡膜，但未出現(xiàn)卵泡腔，在初級(jí)卵母細(xì)胞和卵泡細(xì)胞之間開(kāi)始出現(xiàn)薄而不完整的透明帶。由圖3可見(jiàn)，次級(jí)卵泡的初級(jí)卵母細(xì)胞周?chē)w粒細(xì)胞變?yōu)閺?fù)層立方或柱狀細(xì)胞，增殖為3層以上，透明帶發(fā)育完整，在卵泡細(xì)胞間逐漸出現(xiàn)大小不等的腔隙。由圖4可見(jiàn)，三級(jí)卵泡的初級(jí)卵母細(xì)胞周?chē)w粒細(xì)胞層數(shù)進(jìn)一步增加，透明帶增厚，形成放射冠，卵泡中出現(xiàn)新月形的卵泡腔，卵母細(xì)胞及其周?chē)w粒細(xì)胞逐漸被擠至卵泡腔一側(cè)，并與卵泡細(xì)胞一起突出卵泡腔形成卵丘，卵泡膜明顯。由圖5可見(jiàn)，成熟卵泡的初級(jí)卵母細(xì)胞完成第一次成熟分裂，成為次級(jí)卵母細(xì)胞，卵泡體積顯著增大，卵泡壁變薄，卵母細(xì)胞與卵泡壁之間的顆粒細(xì)胞層變窄，僅為2～3層，此時(shí)透明帶達(dá)到最厚。由此得出，從原始卵泡、初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡、三級(jí)卵泡到成熟卵泡，各階段卵泡的顯微結(jié)構(gòu)均沒(méi)有顯著差異，說(shuō)明MLT埋植劑埋植239 d對(duì)各級(jí)卵泡的顯微結(jié)構(gòu)均沒(méi)有影響。

a. 對(duì)照組(未埋植MLT)；b. 試驗(yàn)組(埋植239 d MLT)；PO. 初級(jí)卵母細(xì)胞；FC. 卵泡細(xì)胞。下同

ZP. 透明帶；下同

GC. 顆粒細(xì)胞；下同

CO. 卵丘；GL. 顆粒層；FA. 卵泡腔。下同

SO. 次級(jí)卵母細(xì)胞；CR. 放射冠；C. 卵泡液

2.3 各級(jí)卵泡和卵母細(xì)胞數(shù)量、直徑及透明帶厚度

2個(gè)組均有45個(gè)原始卵泡、30個(gè)初級(jí)卵泡、12個(gè)次級(jí)卵泡、6個(gè)三級(jí)卵泡，其中試驗(yàn)組有3個(gè)成熟卵泡，而對(duì)照組僅有1個(gè)成熟卵泡。由表3可見(jiàn)各組測(cè)量的結(jié)果，試驗(yàn)組與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組水貂卵等的原始卵泡和卵母細(xì)胞的直徑、三級(jí)卵泡直徑顯著增大(P<0.05)，而初級(jí)卵泡和次級(jí)卵泡及其卵母細(xì)胞的直徑差異均不顯著(P>0.05)。2個(gè)組均在初級(jí)卵泡階段開(kāi)始出現(xiàn)透明帶，次級(jí)卵泡階段發(fā)育完整且隨卵泡成熟透明帶厚度逐漸增厚，但僅在三級(jí)卵泡階段透明帶厚度差異顯著(P<0.05)。

表3 水貂各級(jí)卵泡和卵母細(xì)胞數(shù)量、直徑及透明帶厚度比較

2.4 血清主要生殖激素含量

由表4可見(jiàn)，試驗(yàn)組與對(duì)照組相比，血清FSH、LH、E2和P4的含量差異均不顯著(P>0.05)。由此說(shuō)明，MLT埋植劑埋植239 d對(duì)血清FSH、LH、E2和P4含量均沒(méi)有影響。

表4 水貂血清主要生殖激素含量比較(n=4)

3 討論

3.1 MLT埋植劑對(duì)卵巢形態(tài)的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，MLT埋植劑埋植239 d對(duì)卵巢的形態(tài)發(fā)育有促進(jìn)作用。這可能與其繁殖活性和光照時(shí)間縮短調(diào)控MLT的分泌量有關(guān)，光照信號(hào)通過(guò)作用于視網(wǎng)膜，經(jīng)下丘腦視交叉上核(suprachiasmatic nucleus，SCN)的中樞生物鐘調(diào)控，感知環(huán)境晝夜節(jié)律的變化，即在夜間促進(jìn)MLT分泌，在日間抑制MLT分泌[10]。另?yè)?jù)Viguie等[11]報(bào)道，季節(jié)性繁殖動(dòng)物切除松果體并長(zhǎng)期注射MLT，能促使GnRH和LH等激素脈沖釋放并激活其生殖活性。因此，本試驗(yàn)埋植MLT埋植劑239 d相當(dāng)于模擬短日照時(shí)MLT的分泌模式，直接促使體內(nèi)MLT的分泌量持續(xù)增加，通過(guò)下丘腦-垂體-性腺軸(hypothalamus-pituitary-gonadal axis，HPGA)調(diào)節(jié)下丘腦分泌GnRH，進(jìn)而影響生殖系統(tǒng)功能，促進(jìn)卵巢發(fā)育[12]。這與MLT能促進(jìn)山羊[13]、梅花鹿[14]等動(dòng)物卵巢卵泡發(fā)育的試驗(yàn)結(jié)果相一致。

3.2 MLT埋植劑對(duì)各級(jí)卵泡顯微結(jié)構(gòu)的影響

卵泡是由卵母細(xì)胞和其周?chē)念w粒細(xì)胞及卵泡膜細(xì)胞組成，是卵巢皮質(zhì)內(nèi)的基本結(jié)構(gòu)單元等[15]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，MLT埋植劑埋植239 d對(duì)各級(jí)卵泡的顯微結(jié)構(gòu)均沒(méi)有影響。這與趙英等[16]報(bào)道MLT對(duì)休情期銀黑狐各級(jí)卵泡的顯微結(jié)構(gòu)沒(méi)有影響的結(jié)果一致。這可能與樣品的采集時(shí)間有關(guān)，樣品采集時(shí)水貂正處于發(fā)情階段，試驗(yàn)組水貂卵巢的發(fā)育程度可能剛好達(dá)到了與對(duì)照組水貂發(fā)情期相一致的狀態(tài)和水平。另?yè)?jù)李德河[17]報(bào)道，母貂于7月初埋植18 mg/只MLT后，第1個(gè)月內(nèi)MLT釋放量平均為9.840 mg，第2個(gè)月內(nèi)釋放量平均為2.448 mg，第3個(gè)月內(nèi)釋放量平均為0.861 mg，第4個(gè)月直至第8個(gè)月平均月釋放量為0.269 mg。由此說(shuō)明，試驗(yàn)結(jié)果可能與MLT的埋植時(shí)間、釋放量和分泌量有關(guān)。從MLT埋植劑埋植在水貂體內(nèi)后，MLT的釋放量隨埋植時(shí)間的增加而逐漸減少，MLT分泌量也逐漸減少，以致于不能引起2個(gè)組各級(jí)卵泡顯微結(jié)構(gòu)明顯的變化，具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

3.3 MLT埋植劑對(duì)卵泡發(fā)育的影響

MLT埋植劑顯著增加了原始卵泡和卵母細(xì)胞的直徑、三級(jí)卵泡直徑及其透明帶厚度，表明MLT埋植劑埋植239 d對(duì)原始卵泡和三級(jí)卵泡的發(fā)育有一定促進(jìn)作用，這與趙英等[16]給休情期銀黑狐埋植MLT后能促進(jìn)有腔卵泡發(fā)育的結(jié)果一致。本試驗(yàn)2個(gè)組均在初級(jí)卵泡階段開(kāi)始出現(xiàn)較薄且不完整的透明帶，次級(jí)卵泡階段發(fā)育完整且隨卵泡成熟透明帶逐漸增厚，這與川金絲猴[18]、牦牛[19]、藍(lán)狐[20]、天府黑兔[21]等相似，與牛和山羊[22]、東北梅花鹿[23]等透明帶出現(xiàn)在次級(jí)卵泡階段不同，這可能與動(dòng)物種屬差異有關(guān)。本試驗(yàn)中試驗(yàn)組與對(duì)照組相比，初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡、成熟卵泡及其卵母細(xì)胞的直徑和其透明帶厚度差異均不顯著，說(shuō)明此時(shí)試驗(yàn)組水貂的卵泡發(fā)育程度也達(dá)到了正常發(fā)情時(shí)的相同狀態(tài)，可能與MLT在卵泡不同發(fā)育階段對(duì)FSH、LH、E2、P4等性腺激素的調(diào)節(jié)有關(guān)[24]。另?yè)?jù)Tamura等[25]和堵吉等[26]報(bào)道，排卵前卵泡液中MLT含量比血清中高，且卵巢顆粒細(xì)胞中有褪黑激素受體(melatonin receptor，MR)存在。而在卵泡成熟的各個(gè)階段，MLT均能通過(guò)HPGA的MR直接調(diào)節(jié)卵泡內(nèi)FSH、LH、E2、P4等性腺激素的合成與分泌，從而影響卵泡的發(fā)育[27]。因此，MLT的埋植時(shí)間、分泌量及其調(diào)控性腺激素的分泌作用均有可能影響卵巢形態(tài)學(xué)和內(nèi)部卵泡的發(fā)育。

3.4 MLT埋植劑對(duì)血清主要生殖激素的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，MLT埋植劑埋植239 d對(duì)血清FSH、LH、E2和P4含量沒(méi)有影響。馬友記等[28-29]分別給體外培養(yǎng)的綿羊垂體細(xì)胞和卵泡顆粒細(xì)胞添加不同劑量MLT進(jìn)行刺激，發(fā)現(xiàn)各組FSH、LH和P4含量差異均不顯著，與本試驗(yàn)的結(jié)果一致。這可能與MLT的釋放量和分泌量有關(guān)，MLT是調(diào)節(jié)光照與生殖系統(tǒng)關(guān)系中重要的激素信號(hào)且光照變化能引起MLT分泌模式的改變[30-31]。據(jù)李德河[17]報(bào)道，母貂于7月初埋植18 mg/只MLT后，第4個(gè)月直至第8個(gè)月平均月釋放量為0.269 mg。MLT長(zhǎng)期處理增加了腦絡(luò)氨酸羥化酶mRNA的表達(dá)，使視前區(qū)多巴胺能系統(tǒng)激活，抑制FSH和LH的合成和釋放，而在HPGA和GnRH釋放細(xì)胞中，MLT抑制了GnRH mRNA的表達(dá)，使FSHβ和LHβ mRNA的表達(dá)降低，進(jìn)而減少了血漿中性腺激素水平[32-33]。因此，F(xiàn)SH、LH、E2和P4的合成和分泌與MLT的釋放量密切相關(guān)。一方面可能由于埋植劑中的MLT枯竭所致，MLT埋植劑長(zhǎng)期作用于機(jī)體，在體內(nèi)緩慢釋放，使血清MLT含量升高，隨著釋放量逐漸減少直至枯竭，同時(shí)受體內(nèi)內(nèi)源性MLT負(fù)反饋調(diào)節(jié)的影響，致使血清MLT含量降低，從而間接影響水貂血清FSH和LH等生殖激素的含量；另一方面可能由于MLT迅速的外周代謝所致，使血清MLT含量降低，進(jìn)而減少性腺激素水平[34]。

4 結(jié)論

水貂于7月初埋植MLT埋植劑(18 mg/只)239 d后，對(duì)發(fā)情期水貂卵巢的重量和體積及原始卵泡和三級(jí)卵泡的提前發(fā)育均有促進(jìn)作用，但對(duì)初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡、成熟卵泡及其卵母細(xì)胞的直徑和其透明帶厚度均沒(méi)有影響；對(duì)血清FSH、LH、E2和P4含量沒(méi)有影響。