趙文宇，張 潔，鄭世祥，汪心雨，蘇小婷，范詠梅

（海南大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院/熱帶農(nóng)林生物災(zāi)害綠色防控教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海口 570228）

茚蟲(chóng)威是由美國(guó)杜邦公司開(kāi)發(fā)的含有手性分子的惡二嗪類殺蟲(chóng)劑，其中（+）-S-茚蟲(chóng)威具有殺蟲(chóng)活性，對(duì)鱗翅目害蟲(chóng)有較好的防效[1]。由于單一純異構(gòu)體開(kāi)發(fā)成本和技術(shù)工藝要求高、成本高，目前國(guó)內(nèi)外市面上銷售的茚蟲(chóng)威殺蟲(chóng)劑多數(shù)為（+）-S-茚蟲(chóng)威和（-）-R-茚蟲(chóng)威兩種對(duì)映體的混合劑型，其中杜邦公司生產(chǎn)的茚蟲(chóng)威產(chǎn)品主要有3種對(duì)映體混合劑型：DPX-JW062（S∶R =1∶1）、DPX-MP062（S∶R=3∶1）、DPX-KN128（S∶R=1∶0）[2]，中國(guó)市場(chǎng)上茚蟲(chóng)威產(chǎn)品主要是富含S異構(gòu)體的產(chǎn)品（S∶R =2.2∶1和3∶1）[3-4]。茚蟲(chóng)威廣泛應(yīng)用于對(duì)棉花、玉米、水稻和果樹(shù)等的害蟲(chóng)防治[5-8]。由于桑園往往與農(nóng)田、果園等呈交錯(cuò)分布，對(duì)桑園附近農(nóng)田及果園施藥時(shí)，殺蟲(chóng)劑會(huì)隨空氣漂移落在桑樹(shù)上對(duì)桑葉產(chǎn)生污染[9-10]。家蠶（Bombyx mori）進(jìn)食被殺蟲(chóng)劑污染的桑葉后后果嚴(yán)重，甚至可導(dǎo)致蠶繭絕收，不僅給養(yǎng)蠶業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，而且對(duì)絲綢產(chǎn)業(yè)產(chǎn)生影響[11-12]。目前對(duì)環(huán)境生物家蠶的毒性報(bào)道中使用的多為茚蟲(chóng)威商品藥，其中陳偉國(guó)等[13]測(cè)定30%茚蟲(chóng)威懸浮劑對(duì)3齡期蠶的24 h LC50為0.360 4 mg ·L-1，俞瑞鮮等[14]和陳麗萍等[15]測(cè)定15%茚蟲(chóng)威懸浮劑對(duì)家蠶96 h LC50分別為0.449 mg ·L-1和0.439 mg ·L-1，毒性為劇毒。（+）-S-茚蟲(chóng)威、（-）-R-茚蟲(chóng)威及茚蟲(chóng)威原藥對(duì)家蠶毒性研究較少，僅有石麗紅[16]采用浸葉法測(cè)定了（+）-S-茚蟲(chóng)威（>98%）、（-）-R-茚蟲(chóng)威（>98%）和S-茚蟲(chóng)威富集體（2.33S∶1R）對(duì)家蠶96 h的急性毒性報(bào)道，LC50分別為1.96、108和6.89 mg L-1。

有研究發(fā)現(xiàn)茚蟲(chóng)威手性異構(gòu)體對(duì)斑馬魚(yú)的毒性具有對(duì)映選擇性[17-18]，誘導(dǎo)斑馬魚(yú)產(chǎn)生氧化應(yīng)激毒性且表現(xiàn)出對(duì)映選擇性[19]。然而茚蟲(chóng)威原藥、（+）-S-茚蟲(chóng)威和（-）-R-茚蟲(chóng)威對(duì)家蠶的氧化應(yīng)激的影響尚未見(jiàn)報(bào)道，因此本研究以家蠶為生物模型，采用噴霧法測(cè)定茚蟲(chóng)威原藥（3S:1R）、（+）-S-茚蟲(chóng)威和（-）-R-茚蟲(chóng)威對(duì)家蠶的急性毒性，測(cè)定其抗氧化酶超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）和過(guò)氧化物酶（POD）的活性變化來(lái)評(píng)價(jià)茚蟲(chóng)威原藥（3S:1R）、（+）-S-茚蟲(chóng)威和（-）-R-茚蟲(chóng)威對(duì)家蠶的毒性效應(yīng)，為后續(xù)茚蟲(chóng)威的實(shí)際應(yīng)用及其對(duì)于環(huán)境生物的安全性評(píng)價(jià)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料 試驗(yàn)所用家蠶品種為‘秋風(fēng)’ב月白’，蠶卵購(gòu)于諸暨市鑒寶農(nóng)業(yè)開(kāi)發(fā)有限公司。實(shí)驗(yàn)室自行催青和飼養(yǎng)，在實(shí)驗(yàn)室經(jīng)2 d孵化，幼蟲(chóng)用新鮮嫩桑葉喂養(yǎng)，恒溫養(yǎng)蟲(chóng)室設(shè)置溫度條件為（27±1）℃，相對(duì)濕度為70%～85%，光照黑暗比為16 h:8 h，以二齡起蠶為供試生物，挑選活性良好、身體健康、體態(tài)大小一致、起蠶時(shí)間一致的二齡起蠶用作試驗(yàn)。桑葉品種選用‘云桑二號(hào)’，購(gòu)于諸暨市鑒寶農(nóng)業(yè)開(kāi)發(fā)有限公司。超氧化物歧化酶（SOD）測(cè)定試劑盒、過(guò)氧化氫酶（CAT）測(cè)定試劑盒和過(guò)氧化物酶（POD）測(cè)定試劑盒均購(gòu)于南京建成生物工程研究所有限公司。茚蟲(chóng)威原藥（3S:1R，98%）購(gòu)于南京樂(lè)邦化工有限公司，（+）-S-茚蟲(chóng)威（98%）和（-）-R-茚蟲(chóng)威（98%）由上海大賽路手性公司拆分所得。

1.2 急性毒性測(cè)定

1.2.1 急性毒性測(cè)定方法 參照《化學(xué)農(nóng)藥家蠶慢性毒性試驗(yàn)準(zhǔn)則》（NY/T 3087—2017）附錄B中農(nóng)藥家蠶急性毒性試驗(yàn)—噴霧法，使用溶劑DMF和助劑Tween-80將茚蟲(chóng)威原藥、（+）-S-茚蟲(chóng)威和（-）-R-茚蟲(chóng)威配制成100 mg ·L-1的茚蟲(chóng)威母液，將母液梯度稀釋，分別為14.600 、7.300 、3.650 、1.825 和0.915 mg ·L-1，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組CK和助溶劑對(duì)照組SC。選取桑樹(shù)頂端大小和質(zhì)量盡量一致的新鮮有光澤的嫩桑葉，每個(gè)處理的桑葉用量為（2.5±0.1）g。將桑葉用清水清洗干凈并晾干表面水漬，使用噴霧塔設(shè)備將試驗(yàn)藥液均勻噴灑到桑葉的背面，以初始噴霧體積為5 mL，噴霧壓力為0.048 MPa，沉降時(shí)間為20 s作為標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)。將桑葉自然風(fēng)干至其表面看不到藥液，再將染毒桑葉置于培養(yǎng)裝置中。選擇健康、大小一致的二齡起蠶轉(zhuǎn)到桑葉上。每處理20頭二齡起蠶，重復(fù)3次。每結(jié)束1個(gè)處理組的噴霧操作后均對(duì)噴霧塔內(nèi)壁進(jìn)行清洗擦拭，以防止內(nèi)壁形成水滴滴落。噴藥前用萬(wàn)分之一天平稱量桑葉的質(zhì)量，噴藥后再次立即稱量桑葉質(zhì)量，進(jìn)而可測(cè)定每片桑葉上噴施茚蟲(chóng)威的準(zhǔn)確含量。計(jì)算所得的試驗(yàn)濃度為2.920 、1.460 、0.730 、0.365和0.183 mg·kg-1，在藥劑處理后24、48、72及96 h觀察并記錄家蠶的中毒癥狀和死亡情況。用移蟲(chóng)筆輕觸家蠶，家蠶無(wú)反應(yīng)視作死亡。當(dāng)毒性測(cè)定試驗(yàn)中溶劑對(duì)照組和空白對(duì)照組的死亡率小于10%視為有效試驗(yàn)。

1.2.2 共毒系數(shù)計(jì)算 參照國(guó)家農(nóng)藥室內(nèi)生物測(cè)定試驗(yàn)準(zhǔn)則NY/T1154.7-2006進(jìn)行共毒系數(shù)（CTC）計(jì)算。若CTC≤80，表明2種藥劑混用為拮抗作用；若80＜CTC＜120，則為相加作用；若CTC≥120，則為增效作用。

1.3 酶活力測(cè)定

1.3.1 粗酶液制備 使用噴霧法按照急性毒性試驗(yàn)濃度處理24 h，其中各濃度處理組設(shè)置多組重復(fù)以滿足試驗(yàn)需求，從每個(gè)濃度的處理組中各取10頭活蠶分別裝入離心管中，用液氮處理后加入2 mL的1×PBS溶液進(jìn)行冰浴研磨，然后使用Z216MK冷凍離心機(jī)4 ℃ 3 500 r·min-1離心10 min后，取上清液作為粗酶液。

1.3.2 總蛋白含量的測(cè)定 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法進(jìn)行。首先用0.15 mol·L-1的NaCl配制出100 mL濃度為1 000 mg · L-1的牛血清白蛋白，備用。分別向編號(hào)0 ～8的離心管中加入0.01、0.02、0.06、0.08、0.1、0.12、0.14和0 mL牛血清白蛋白（1 000 mg · L-1），然后依次加入0.19、0.18、0.14、0.12、0.10、0.08、0.06和0.2 mL蒸餾水，每管中加入5 mL考馬斯亮藍(lán)G-250染劑后用離心機(jī)渦旋混勻后靜置5 min，再將其移到比色皿內(nèi)置于752紫外分光光度計(jì)中，波長(zhǎng)調(diào)至595 nm，測(cè)定吸光值繪制蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，8號(hào)管用于調(diào)零，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.3.3 酶源蛋白含量測(cè)定 向編號(hào)1～7號(hào)的離心管中分別加入0.2 mL上述步驟制備的粗酶液，在8號(hào)管中加入0.2 mL蒸餾水，向8個(gè)離心管中分別加入5 mL考馬斯亮藍(lán)G-250染劑，再將離心管中液體轉(zhuǎn)移至比色皿內(nèi)，將比色皿置于紫外分光光度計(jì)中，波長(zhǎng)調(diào)至595 nm，測(cè)定吸光值，8號(hào)管用于調(diào)零，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.3.4 SOD、CAT和POD酶活力測(cè)定 SOD、CAT和POD酶活力的測(cè)定使用752紫外分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定，具體試驗(yàn)步驟操作參照南京建成試劑盒進(jìn)行。

1.4 數(shù)據(jù)分析 使用軟件IBM SPSS statistics 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用GraphPad Prism 9進(jìn)行數(shù)據(jù)分析與繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 茚蟲(chóng)威對(duì)家蠶的毒性影響 參照《化學(xué)農(nóng)藥家蠶慢性毒性試驗(yàn)準(zhǔn)則》使用桑葉浸漬修正系數(shù)對(duì)農(nóng)藥對(duì)家蠶的急性毒性等級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn)的LC50進(jìn)行修正后可知，茚蟲(chóng)威原藥對(duì)家蠶96 h的毒性等級(jí)為高毒，（+）-S-茚蟲(chóng)威和（-）-R-茚蟲(chóng)威對(duì)家蠶96 h的毒性等級(jí)為劇毒，毒性大小依次為（-）-R-茚蟲(chóng)威> （+）-S-茚蟲(chóng)威>茚蟲(chóng)威原藥。主要中毒癥狀為吐黃水、蠶體發(fā)黑、蠶體縮短現(xiàn)象，隨著藥液濃度的升高，中毒家蠶越多。（+）-R-茚蟲(chóng)威對(duì)家蠶的LC50是（-）-S-茚蟲(chóng)威的2.75倍，茚蟲(chóng)威的2種手性對(duì)映體對(duì)家蠶表現(xiàn)出對(duì)映選擇性毒性。茚蟲(chóng)威原藥（3S:1R）的共毒系數(shù)為12.868≤80，（+）-S-茚蟲(chóng)威和（-）-R-茚蟲(chóng)威2種藥劑混合表現(xiàn)為拮抗作用（表1）。

表1 茚蟲(chóng)威原藥、（+）-S-茚蟲(chóng)威和（-）-R-茚蟲(chóng)威對(duì)家蠶的毒性測(cè)定結(jié)果

2.2 茚蟲(chóng)威對(duì)家蠶酶活性的影響 以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白繪制蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.044x+0.048，相關(guān)系數(shù)R2為0.971。

2.2.1 茚蟲(chóng)威對(duì)家蠶SOD活性的影響 從圖1-A可知茚蟲(chóng)威原藥誘導(dǎo)家蠶體內(nèi)的超氧化物歧化酶（SOD）活性上升，和對(duì)照組SC相比，5個(gè)處理組SOD活性均顯著上升。在圖1-B中（+）-S-茚蟲(chóng)威處理組中0.730、1.460和2.920 mg ·kg-13個(gè)濃度誘導(dǎo)SOD活性顯著上升，其余2個(gè)濃度SOD活性顯著下降。在圖1-C中（-）-R-茚蟲(chóng)威處理組中0.183和0.365 mg ·kg-1濃度下誘導(dǎo)SOD活性顯著降低，SOD活性在0.730、1.460和2.920 mg ·kg-1濃度下顯著上升。

圖1 茚蟲(chóng)威對(duì)家蠶SOD活性的影響

在0.183和0.365 mg ·kg-1濃度下，茚蟲(chóng)威原藥誘導(dǎo)SOD酶活性和對(duì)照相比上升8.577%和23.585%。（+）-S-茚蟲(chóng)威誘導(dǎo)SOD酶活性和對(duì)照相比下降28.536%和23.317%，（-）-R-茚蟲(chóng)威誘導(dǎo)SOD酶活性和對(duì)照相比下降14.735%和8.170%。在0.730、1.460和2.920 mg ·kg-1濃度下，茚蟲(chóng)威原藥誘導(dǎo)SOD酶活性和對(duì)照相比上升34.129%、20.626%和32.948%。（+）-S-茚蟲(chóng)威誘導(dǎo)SOD酶活性和對(duì)照相比上升66.079%、25.723%和38.650%，（-）-R-茚蟲(chóng)威誘導(dǎo)SOD酶活性和對(duì)照相比上升77.247%、32.006%和54.537%。0.183和0.365 mg ·kg-1（+）-S-茚蟲(chóng)威對(duì)SOD的抑制效果更好。

2.2.2 茚蟲(chóng)威對(duì)家蠶CAT活性的影響 由圖2-A可知茚蟲(chóng)威原藥誘導(dǎo)家蠶體內(nèi)的過(guò)氧化氫酶（CAT）活性整體呈上升趨勢(shì)，和對(duì)照相比，5個(gè)處理組CAT活性均顯著上升。由圖2-B可以看出（+）-S-茚蟲(chóng)威處理組中除0.183 mg ·kg-1濃度下CAT活性顯著下降，其余處理組CAT活性均顯著上升。由圖2-C可知（-）-R-茚蟲(chóng)威處理組中除0.183 mg ·kg-1濃度下CAT活性下降，其余4個(gè)濃度CAT活性均顯著上升。

圖2 茚蟲(chóng)威對(duì)家蠶CAT活性的影響

和對(duì)照相比，在0.183 mg ·kg-1濃度下茚蟲(chóng)威原藥誘導(dǎo)CAT活性上升39.054%，（+）-S-茚蟲(chóng)威和-）-R-茚蟲(chóng)威誘導(dǎo)CAT活性下降42.420%和13.169%。在0.365、0.730、1.460和2.920 mg ·kg-1濃度下，茚蟲(chóng)威原藥誘導(dǎo)CAT活性上升59.065%、84.756%、33.526%和95.957%，（+）-S-茚蟲(chóng)威誘導(dǎo)CAT活性上升76.001%、251.725%、34.229%和234.280%，（-）-R-茚蟲(chóng)威誘導(dǎo)CAT活性上升8.590%、173.678%、30.407%和125.553%。在0.183 mg ·kg-1（+）-S-茚蟲(chóng)威對(duì)CAT的活性抑制效果最好。

2.2.3 茚蟲(chóng)威對(duì)家蠶POD活性的影響 由圖3-A可知，茚蟲(chóng)威原藥處理組中5個(gè)濃度均誘導(dǎo)家蠶體內(nèi)POD活性下降。圖3-B結(jié)果表明，和對(duì)照相比，（+）-S-茚蟲(chóng)威誘導(dǎo)POD活性均顯著下降。由圖3-C可知，（-）-R-茚蟲(chóng)威誘導(dǎo)POD活性下降，和對(duì)照相比，5個(gè)濃度家蠶POD活性均顯著下降。

圖3 茚蟲(chóng)威對(duì)家蠶POD活性的影響

和對(duì)照相比，在0.183、0.365、0.730、1.460和2.920 mg ·kg-1濃度下茚蟲(chóng)威原藥誘導(dǎo)POD活性下降165.885%、93.751%、30.108%、52.268%和6.206%；（+）-S-茚蟲(chóng)威誘導(dǎo)POD活性下降266.722%、217.385%、151.490%、205.520%和378.033%；（-）-R-茚蟲(chóng)威誘導(dǎo)POD活性下降406.287%、314.239%、258.185%、119.468%和64.830%。（-）-R-茚蟲(chóng)威在0.183、0.365、0.730 mg·kg-1對(duì)POD活性的抑制效果最好，（+）-S-茚蟲(chóng)威在0.183和2.920 mg ·kg-12個(gè)濃度對(duì)POD的抑制效果最好。

3 討 論

對(duì)于大多數(shù)手性農(nóng)藥而言，其一種手性異構(gòu)體對(duì)同種生物的急性毒性往往高于其外消旋體，且2種手性異構(gòu)體可能在同種生物中表現(xiàn)出不同的毒性[20-21]。石麗紅[16]采用浸葉法測(cè)定的（+）-S-茚蟲(chóng)威和（-）-R-茚蟲(chóng)威96 h的LC50分別為1.96和108 mg·L-1，用桑葉浸漬修正系數(shù)修正后為0.901 6和49.680 0 mg·kg-1。本試驗(yàn)家蠶毒性測(cè)定方法中噴霧法可通過(guò)試驗(yàn)前后稱量桑葉重量對(duì)農(nóng)藥進(jìn)行定量，和浸葉法相比，該方法定量更精準(zhǔn)、噴霧更均勻[22-23]，本研究結(jié)果表明，（+）-S-茚蟲(chóng)威和（-）-R-茚蟲(chóng)威對(duì)家蠶96 h的LC50分別為0.041和0.113 mg·kg-1，茚蟲(chóng)威的2種手性異構(gòu)體對(duì)家蠶的毒性存在對(duì)映選擇性的差異。

據(jù)報(bào)道，斑馬魚(yú)成魚(yú)暴露于不同濃度的（-）-R-茚蟲(chóng)威和（+）-S-茚蟲(chóng)威96 h后，（+）-S-茚蟲(chóng)威在96 h對(duì)斑馬魚(yú)胚胎的毒性是（-）-R-茚蟲(chóng)威的5.637倍；斑馬魚(yú)幼魚(yú)暴露于不同濃度的（-）-R-茚蟲(chóng)威和（+）-S-茚蟲(chóng)威96 h后，（+）-S-茚蟲(chóng)威在96h對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)的毒性是（-）-R-茚蟲(chóng)威的3.352倍[24]。本研究結(jié)果表明，（-）-R-茚蟲(chóng)威對(duì)家蠶的毒性是（+）-S-茚蟲(chóng)威的2.75倍，茚蟲(chóng)威的2種手性異構(gòu)體對(duì)家蠶的毒性存在對(duì)映選擇性的差異。

生物體中存在多種抗氧化酶系包括過(guò)超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、過(guò)氧化物酶（POD）等，SOD、CAT和POD三者協(xié)調(diào)一致,處于動(dòng)態(tài)平衡，從而使自由基維持在一個(gè)較低水平，防止自由基產(chǎn)生毒害[25]。微量農(nóng)藥誘導(dǎo)昆蟲(chóng)體內(nèi)自由基（ROS）積累發(fā)生氧化應(yīng)激[26-27]，鉤蝦暴露于茚蟲(chóng)威24、48、96 h后，SOD和CAT活性隨暴露時(shí)間增加而增加[28]，低劑量的茚蟲(chóng)威誘導(dǎo)鯉魚(yú)腎臟中的SOD和CAT酶基因表達(dá)均發(fā)生上調(diào)[29]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，和對(duì)照相比，在（+）-S-茚蟲(chóng)威和（-）-R-茚蟲(chóng)威處理組中SOD和CAT活性在0.730、1.460和2.920 mg·kg-13個(gè)濃度時(shí)顯著上升，SOD和CAT活性上升可能參與了家蠶氧化應(yīng)激中自由基的清除過(guò)程[30]，以減輕茚蟲(chóng)威對(duì)家蠶造成的損害。在茚蟲(chóng)威原藥、（+）-S-茚蟲(chóng)威和（-）-R-茚蟲(chóng)威處理組中POD活性均下降，可能影響自由基清除過(guò)程中對(duì)H2O2的催化[31]。

殺蟲(chóng)劑混配后可能產(chǎn)生增效、相加或拮抗的聯(lián)合作用效果[32-33]。三唑磷和氯氟氰菊酯混合劑對(duì)蚯蚓的聯(lián)合毒性表現(xiàn)為協(xié)同作用，該混合劑對(duì)蚯蚓體內(nèi)POD酶活性的誘導(dǎo)作用大于單獨(dú)使用三唑磷或氯氟氰菊酯的效果[34]。阿維菌素和氟蟲(chóng)脲混合劑聯(lián)合毒性表現(xiàn)為協(xié)同作用，混合農(nóng)藥處理的舞毒蛾幼蟲(chóng)SOD、POD和CAT活性均高于單獨(dú)使用阿維菌素或氟蟲(chóng)脲處理組[35]。有研究表明，敵敵畏和溴氰菊酯及其混合劑均能抑制大鼠肝臟的SOD和CAT的活性，單獨(dú)使用時(shí)溴氰菊酯抑制效果更好，敵敵畏與溴氰菊酯混配劑對(duì)SOD和CAT的抑制效果低于二者單獨(dú)作用的效果總和，敵敵畏與溴氰菊酯混合使用對(duì)大鼠肝臟氧化應(yīng)激的誘導(dǎo)具有拮抗作用[36]。二嗪農(nóng)和溴氰菊酯混合對(duì)大鼠血液中MDA、GST、SOD的活性具有拮抗作用[37]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，（+）-S-茚蟲(chóng)威和（-）-R-茚蟲(chóng)威）之間的毒性效應(yīng)為拮抗作用，和二者聯(lián)合毒性作用效果一致。