董林朋，殷金瑤，趙文淵，林春花，劉文波，繆衛(wèi)國，李 瀟

（海南大學(xué) 植物保護學(xué)院/熱帶農(nóng)林生物災(zāi)害綠色防控教育部重點實驗室，?？?570228）

啟動子(Promoter)為DNA分子上與RNA聚合酶結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物并起始mRNA合成所必需的保守序列。啟動子有強、弱之分，其對轉(zhuǎn)錄水平的控制程度差異較大，按轉(zhuǎn)錄模式可將啟動子分為組成型、組織特異型、誘導(dǎo)型等多種形式。強啟動子對于基因工程的研究具有促進作用，為轉(zhuǎn)化體系的建立、互作機制的研究等提供有效的工具。例如小麥條銹菌效應(yīng)蛋白Pst14872靶標的鑒定及功能分析[1]中報道了利用大腸桿菌Tac啟動子探究專性寄生真菌小麥條銹菌中Pst14872效應(yīng)蛋白與靶標TaClpS1的互作機制；農(nóng)桿菌及PEG介導(dǎo)向日葵核盤菌遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究[2]中報道了利用大腸桿菌的Lac啟動子驅(qū)動mgfp5基因的表達以探究向日葵核盤菌轉(zhuǎn)化體系的建立；啟動子克隆概述[3]中報道了絲狀真菌啟動子可以高效表達內(nèi)源基因可能得益于其具有強大的啟動子工具。因此，利用從真菌內(nèi)分離的強啟動子驅(qū)動基因的轉(zhuǎn)錄表達，有望為絲狀真菌轉(zhuǎn)化體系的建立、侵染機制的研究等提供新的可能。

橡膠樹白粉菌是一類專性寄生真菌，目前尚不能離體培養(yǎng)[4-5]，又因其寄主橡膠樹的基因組過于龐大，因此橡膠樹白粉菌遺傳轉(zhuǎn)化體系仍是目前研究中的一個難點問題。本實驗室從橡膠樹白粉菌基因組中鑒定得到了WY172[6]與WY195[7]啟動子，但僅在外源寄主雙子葉植物內(nèi)驗證過這兩個啟動子功能，為進一步探究WY172與WY195是否有廣泛應(yīng)用于橡膠樹白粉菌轉(zhuǎn)化體系建立的可能性，筆者所在的實驗室通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法在與寄主相同的絲狀真菌—暹羅炭疽菌內(nèi)驗證了這兩個啟動子功能[8]。筆者擬構(gòu)建以啟動子WY172、WY195驅(qū)動綠色熒光蛋白（GFP）表達的載體，對GFP基因在暹羅炭疽菌內(nèi)的表達情況進行探究，同時對轉(zhuǎn)化子在不同環(huán)境條件下啟動子的活性進行驗證，旨在為WY172、WY195啟動子的應(yīng)用提供更多的可能，同時也為橡膠樹白粉菌轉(zhuǎn)化體系的建立提供優(yōu)良的啟動子工具。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒 供試菌株為筆者所在實驗室分離純化獲得并經(jīng)鑒定的橡膠樹暹羅炭疽菌（Colletotrichum siamense）HN08[9]。pJNARG質(zhì)粒來自西北農(nóng)林科技大學(xué)許金榮課題組，依據(jù)pFL2質(zhì)粒改造而來[10]。

1.2 培養(yǎng)基 TB3培養(yǎng)基：酵母提取物1 g，酸水解酪蛋白1 g，蔗糖5 g，加ddH2O定容至1 L，121℃高溫滅菌20 min，每200 mL加瓊脂1.5 g制成固體培養(yǎng)基。CM培養(yǎng)基：酵母提取物6 g，酸水解酪蛋白1 g，蔗糖10 g，加ddH2O定容至1 L，121℃高溫滅菌20 min，每200 mL加瓊脂3 g制成固體培養(yǎng)基。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 (PDA)：馬鈴薯200 g，葡萄糖 20 g，瓊脂粉 15 g，加ddH2O定容至1 L， 121℃高溫滅菌 20 min。 馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基 (PDB)：馬鈴薯 200 g，葡萄糖 20 g，加ddH2O定容至1 L，121℃高溫滅菌 20 min。

1.3 試劑 蝸牛酶（Snailase）購自北京索萊寶（Solarbio）科技有限公司，溶壁酶（lysing enzyme）購自美國Sigma Aldrich公司。1×STC緩沖液：蔗糖20 g，50 mmol·L-1Tris-HCl 0.785 g，50 mmol·L-1CaCl20.555 g，加ddH2O定容至100 mL，121℃高溫滅菌20 min。PTC緩沖液：稱取3 g PEG 4 000，溶解于1×STC緩沖液，定容至5mL，利用細菌過濾器（孔徑0.45 μm）過濾除菌。酶解液配制：細胞壁溶壁酶0.2 g，完全溶解于0.7 mol·L-1的NaCl溶液，利用細菌過濾器（孔徑0.45 μm）過濾除菌。

1.4 表達載體的構(gòu)建 利用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和EcoRⅠ對pJNARG載體進行雙酶切，切除載體上的RP27啟動子基因片段（圖1），并使用DNA回收試劑盒（Magen，R6840-01）回收載體片段。提取橡膠樹白粉菌基因組DNA，以WY172 F/R和WY195 F/R引物，從橡膠樹白粉菌基因組中擴增出WY172（GenBank：MK049254.1）與WY195（GenBank：MK049253.1）啟動子，連接pJNARG骨架片段，并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，涂布于Amp+抗性的LB固體培養(yǎng)基上，在37℃的環(huán)境中培養(yǎng)過夜，挑取單菌落進行PCR驗證并篩選出陽性克隆轉(zhuǎn)化子用于后續(xù)實驗研究。本研究所用的引物見表1。

表1 本研究所用引物

圖1 pJNARG載體圖譜

LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床振蕩過夜后并提取質(zhì)粒進行PCR驗證，驗證正確的質(zhì)粒送至華大生物公司測序。測序正確的菌株保存在甘油中并放置于-80℃保存。

1.5 原生質(zhì)體的制備 將野生型的暹羅炭疽菌接種至CM固體培養(yǎng)基上，5 d后切取菌落邊緣的菌塊，在250 mL三角瓶中加入150 mL CM液體培養(yǎng)基，接入切除的菌塊，28℃ 160 r·min-1培養(yǎng)48 h。收集菌絲，使用滅菌過濾紙過濾，用0.7 mol·L-1NaCl溶液反復(fù)沖洗，用濾紙吸干水分，將菌絲轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中（避免手直接觸碰菌絲）。稱取菌絲質(zhì)量，按照質(zhì)量比為1 : 1的比例向菌絲中加入溶壁酶，置于搖床（28℃， 100 r·min-1）上，酶解時長約3.5 h。使用4層滅菌過濾紙過濾酶解液，將酶解后的菌絲溶液進行冰浴后用0.7 mol·L-1NaCl溶液洗滌，然后收集原生質(zhì)體于50 mL離心管中，4℃ 4 600 r·min-1條件下離心15 min后棄上清。再用STC溶液將原生質(zhì)體重懸，4℃4 600 r·min-1條件下離心15 min，重復(fù)1次。最后利用STC溶液將原生質(zhì)體濃度調(diào)至1 ×108個·mL-1，分裝為每管200 μL，立即進行轉(zhuǎn)化使用。

1.6 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化 取60～100 μL 1.4中構(gòu)建的質(zhì)粒，與200 μL制備成功的原生質(zhì)體混合，冰浴20～30 min，每200 μL原生質(zhì)體中加入2 mL PTC溶液，在室溫下靜置30 min，最后加入TB3復(fù)蘇液體培養(yǎng)基，每200 μL的原生質(zhì)體加入3 mL的TB3培養(yǎng)基，輕輕顛倒混勻，室溫下振蕩培養(yǎng)2 h；隨后將原生質(zhì)體加入10 mL熔化并冷卻到約50℃的TB3固體培養(yǎng)基上，并加入Amp+與G418抗性藥劑，輕輕混勻后倒入培養(yǎng)皿中，靜置至下層板凝固；最后向培養(yǎng)基倒入10 mL含Amp+和G418抗性的TB3培養(yǎng)基。28℃下培養(yǎng)2～3 d，待培養(yǎng)基上長出菌落后，將菌絲挑取到新的CM固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)并進行后期驗證。

1.7 暹羅炭疽菌轉(zhuǎn)化子的驗證 分別取上述培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)化菌株與野生型的菌株的菌餅進行液體培養(yǎng)，26℃ 160 r·min-1條件下培養(yǎng)2～3 d，并提取轉(zhuǎn)化子與野生型的DNA作為模板，利用GFP F/R引物進行PCR驗證。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性5 min ，56℃退火35 s，72℃延伸25 s，45個循環(huán)，72℃延伸10 min，4℃保存。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)過1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測。并將轉(zhuǎn)化子以及野生型的菌絲、孢子制備成臨時玻片，利用熒光顯微鏡（奧林巴斯BX53顯微鏡，配備DP80CCD）觀察。

1.8GFP基因表達量分析 將暹羅炭疽菌轉(zhuǎn)化子在CM液體培養(yǎng)基中28℃培養(yǎng)2～3 d。利用真菌RNA提取試劑盒（Omega，R6840-01）提取轉(zhuǎn)化子的RNA，同時也提取野生型暹羅炭疽菌的RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Vazyme，R333-01）進行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。以RP27啟動子驅(qū)動GFP基因作為陽性對照，分別測定WY172與WY195驅(qū)動GFP基因的表達量。

1.9 啟動子在暹羅炭疽菌侵染階段驅(qū)動GFP基因表達 挑取轉(zhuǎn)化成功的暹羅炭疽菌絲放置于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)4～6 d，再利用打孔器打取5 mm直徑的暹羅炭疽菌的菌碟，在PDB培養(yǎng)基中28℃培養(yǎng)3 d，緊接著利用無菌過濾紙過濾，12 000 r·min-1離心，加入無菌水制備成分生孢子懸浮液，并利用血球計數(shù)板計數(shù)，制備成106個·mL-1懸浮液備用。

將上述制備好的孢子懸浮液噴灑在經(jīng)過無菌水沖洗過的離體橡膠樹葉片上。根據(jù)暹羅炭疽菌在橡膠樹葉片上的發(fā)育進程及侵染結(jié)構(gòu)變化，分別選擇在0 h （非接種狀態(tài)）、12 h （附著胞形成侵染釘）、24 h （分生孢子另一端的芽管產(chǎn)生附著胞）、48 h （附著胞分化產(chǎn)生次級附著胞）、72 h （菌絲網(wǎng)狀分布）這5個時間段，將葉片和菌絲利用錫箔紙密封[11]，液氮冷凍，-580℃保存。

利用真菌RNA試劑盒分別提取這5個時間段的暹羅炭疽菌RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以RP27、WY172、WY195分別在0 h驅(qū)動GPF基因的表達量作為參考值，探究不同啟動子驅(qū)動下GFP基因表達含量在暹羅炭疽菌侵染不同時間的變化。

1.10 啟動子WY172與WY195的誘導(dǎo)類型 將暹羅炭疽菌轉(zhuǎn)化子接種于普通CM固體培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)7 d。將上述轉(zhuǎn)化子分別接種于添加H2O2（20 mmol·L-1）、葡萄糖（1 mol·L-1）、0.01%的SDS、山梨醇（1 mol·L-1）、剛果紅(200 μg·mL-1)的CM固體培養(yǎng)基以及普通CM固體培養(yǎng)基在28℃培養(yǎng)5 d，再取上述轉(zhuǎn)化子接種于普通CM固體培養(yǎng)基，分別放置于長光照、黑暗和23℃低溫條件下培養(yǎng)5 d。切取上述不同條件下CM平板中培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化菌株進行液體培養(yǎng)，28℃ 160 r·min-1培養(yǎng)2～3 d。利用真菌RNA提取試劑盒（Omega，R6840-01）提取菌絲RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Vazyme，R333-01）將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，測定不同生長條件下GFP基因的相對表達量。

2 結(jié)果與分析

2.1 表達載體的構(gòu)建 對陽性菌株提取的質(zhì)粒進行PCR驗證，結(jié)果顯示出與目的條帶大小基本一致的條帶（WY172大小為250 bp左右，WY195大小為250 bp左右），進一步送至華大生物公司測序以及NCBI序列對比，結(jié)果顯示相似性為100%，表明表達載體構(gòu)建成功。

2.2 WY172與WY195啟動子活性的檢測 通過熒光顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)啟動子WY172與WY195驅(qū)動GFP基因表達出了類似于RP27驅(qū)動GFP基因的熒光強度，而野生菌株未出現(xiàn)熒光表達（圖2），表明構(gòu)建的3種載體已成功轉(zhuǎn)入，并且初步證明啟動子WY172與WY195均可在暹羅炭疽菌內(nèi)驅(qū)動GFP基因的表達。

圖2 WY172與WY195啟動子驅(qū)動GFP基因表達菌絲熒光圖

利用實時熒光定量PCR（RT-qPCR）測定3種啟動子（WY172、WY195和RP27）驅(qū)動GFP基因的表達量是否存在差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)WY172和WY195驅(qū)動GFP表達的能力分別約為RP27的87%和91%，表現(xiàn)出與RP27類似的驅(qū)動GFP表達的能力，而野生型未檢測到GFP基因的表達（圖3），這再次證明WY172與WY195啟動子均可在暹羅炭疽菌內(nèi)驅(qū)動GFP基因的表達，說明WY172與WY195在暹羅炭疽菌內(nèi)具有啟動子活性。

圖3 啟動子驅(qū)動GFP基因的表達

2.3 WY172與WY195在暹羅炭疽菌侵染寄主的不同侵染階段的啟動子活性 以3種轉(zhuǎn)化子（WY172、WY195和RP27）分別在0 h的GFP基因的表達量作為對照， RT-qPCR結(jié)果顯示啟動子驅(qū)動GFP基因在12 、24 、48 、72 h這4個時間段表現(xiàn)出的效率相差較?。▓D4），如在RP27啟動子驅(qū)動下，GFP基因的表達量在12、24、48、72 h分別為0 h的103%、127%、74%、131%，而在WY172啟動子驅(qū)動下，GFP基因的表達量在12、24、48、72 h分別為0 h的110%、88%、127%、129%，在WY195啟動子驅(qū)動下，GFP基因的表達量在12、24、48、72 h分別為0 h的101%、113%、134%、117%。這證明啟動子在暹羅炭疽菌侵染寄主的不同階段均可以驅(qū)動GFP基因的表達。

圖4 啟動子在暹羅炭疽菌侵染寄主階段驅(qū)動GFP基因表達

2.4 環(huán)境條件對 WY172 與 WY195 活性的影響提取不同生長條件處理下的暹羅炭疽菌RNA，利用RT-qPCR測定發(fā)現(xiàn)WY172在24 h光處理條件下GFP表達量升高，WY195在低溫培養(yǎng)與24 h光處理條件下GFP表達量升高（圖5）。

圖5 不同環(huán)境條件對啟動子驅(qū)動GFP基因表達的影響

3 討 論

啟動子作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控的中心一直是研究熱點，優(yōu)良啟動子的發(fā)現(xiàn)是研究基因表達調(diào)控的基礎(chǔ)，加深對啟動子的研究對基因工程具有很大的幫助。絲狀真菌具有豐富的啟動子資源[12]，目前應(yīng)用較多的絲狀真菌誘導(dǎo)型啟動子含有里氏木霉的cbhl啟動子[13]、曲霉屬的glaA啟動子[14]和構(gòu)巢曲霉的alcA啟動子[15]。本研究以實驗室前期結(jié)果為基礎(chǔ)，進一步加深對WY172與WY195啟動子應(yīng)用范圍的探索，旨在擴大橡膠樹白粉菌啟動子應(yīng)用，為橡膠樹白粉菌轉(zhuǎn)化體系建立和互作機制的研究提供可靠的啟動子工具。

目前已經(jīng)報道的啟動子大多僅能在某種生物中發(fā)揮啟動子作用，較少可以在多種不同的生物內(nèi)均可高效驅(qū)動基因的表達，例如目前使用較為廣泛的35S啟動子僅適用于雙子葉植物[16]，單子葉植物經(jīng)常使用水稻ACT1啟動子[17]和玉米Ubil啟動子[18]。在筆者所在的實驗室的前期研究中，通過GUS蛋白染色實驗和GUS酶活性檢測發(fā)現(xiàn)，來源于橡膠樹白粉菌的WY172與WY195啟動子在雙子葉植物和單子葉植物內(nèi)均具有較強的啟動子活性。這與來源于花椰菜花葉病毒的35S啟動子[16]相類似，雖然來源于病毒卻能在植物中穩(wěn)定高效表達。但此前研究中對WY172、WY195在絲狀真菌中是否具有啟動子活性尚未進行研究。由于橡膠樹白粉菌目前尚無有效轉(zhuǎn)化體系且具有無法離體培養(yǎng)的特點，本研究選擇絲狀真菌中的暹羅炭疽菌作為研究對象，對WY172、WY195的啟動子功能進行探究，研究結(jié)果表明WY172與WY195均具有可以驅(qū)動GFP表達的啟動子功能。這證明WY172與WY195啟動子不僅可以應(yīng)用于植物，更可以在絲狀真菌中發(fā)揮啟動子功能。筆者推測，WY172、WY195啟動子可能具有廣泛的啟動子功能，在多種生物體內(nèi)均可以發(fā)揮啟動子功能，這可能與其自身具有廣泛的表達調(diào)控元件有關(guān)。筆者實驗室也將在接下來的實驗中對WY172、WY195啟動子序列中的表達調(diào)控元件進行進一步的鑒定及功能分析，為基因工程提供更為有效的啟動子工具。

本實驗室前期的研究結(jié)果[7-8]表明，在植物體內(nèi)WY172為IAA誘導(dǎo)型啟動子，WY195為高溫、干旱、鹽誘導(dǎo)啟動子，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，這可能與WY172、WY195啟動子序列具有豐富的植物表達元件有關(guān)，其中，WY172不僅具有赤霉素響應(yīng)、生長素響應(yīng)等激素作用元件，此外還有低溫響應(yīng)、光響應(yīng)元件等非生物因素的作用元件[7]；WY195啟動子也具有高等植物常見的創(chuàng)傷應(yīng)答元件、厭氧誘導(dǎo)必須元件、干旱誘導(dǎo)元件、光應(yīng)答元件等[8]。此外，除這些已報道的植物誘導(dǎo)條件外，還發(fā)現(xiàn)WY172與WY195啟動子存在一些未經(jīng)報道的植物啟動子誘導(dǎo)元件。由于WY172、WY195啟動子在植物中的誘導(dǎo)條件會導(dǎo)致真菌的生長發(fā)育受到限制，因此植物體內(nèi)的啟動子誘導(dǎo)條件并不適用于真菌體內(nèi)，為了進一步探究WY172與WY195啟動子在真菌內(nèi)的表達調(diào)控方式，本研究將轉(zhuǎn)化子置于不同的生長環(huán)境條件下，測定啟動子驅(qū)動GFP基因表達量的變化，發(fā)現(xiàn)在光處理的條件下WY172驅(qū)動GFP基因的高效表達，在23℃低溫培養(yǎng)和長光照處理下WY195啟動子高效驅(qū)動GFP基因的表達。這些研究結(jié)果表明，WY172與WY195啟動子在真菌內(nèi)也屬于誘導(dǎo)型啟動子，但這些誘導(dǎo)條件與植物體內(nèi)的條件完全不同。這可能與真菌的生長環(huán)境有關(guān)，同時也可能與WY172與WY195啟動子豐富的誘導(dǎo)元件有關(guān)。由于目前專門針對絲狀真菌啟動子的研究數(shù)據(jù)庫及分析工具較少，主要依靠其他真核生物的數(shù)據(jù)庫進行預(yù)測，并通過實驗對預(yù)測結(jié)果加以驗證[12]。筆者實驗室將在接下來的實驗中對WY172與WY195啟動子在真菌體內(nèi)的誘導(dǎo)元件進行鑒定與分析，對以上2個啟動子是否具有更多誘導(dǎo)條件的可能性進行進一步鑒定。

目前使用的真菌啟動子多為組成型啟動子，雖然組成型啟動子不受外界影響，在菌株的不同生長階段均可高效表達[19]，但是組成型啟動子的使用也存在局限性，例如當驅(qū)動異源基因表達時，會導(dǎo)致宿主菌株內(nèi)產(chǎn)生大量異源蛋白，從而影響菌株正常生長甚至導(dǎo)致死亡。誘導(dǎo)型啟動子在未受到特定的誘導(dǎo)信號刺激時，驅(qū)動目的基因的表達量往往很低，只有施加可以響應(yīng)的誘導(dǎo)信號時，目的基因的轉(zhuǎn)錄水平才可以迅速提高，因此，使用誘導(dǎo)型啟動子可以滿足對目的基因的實時、定量表達的研究需求。但實驗時還應(yīng)根據(jù)合適的實驗條件選擇合適的誘導(dǎo)型啟動子，并非每個誘導(dǎo)型啟動子的誘導(dǎo)條件都能給所選的模型生物帶來最佳條件。例如，誘導(dǎo)型啟動子cbh1的天然誘導(dǎo)劑為纖維素，而真菌通過纖維素酶將纖維素降解，最后進入真菌體內(nèi)對啟動子cbh1進行直接調(diào)控，因此宿主菌株體內(nèi)必須有編碼纖維素酶的基因[20]。而WY172啟動子與WY195啟動子誘導(dǎo)條件為物理條件，不需要添加化學(xué)試劑來進行誘導(dǎo)，不僅避免化學(xué)試劑對寄主菌株正常生長產(chǎn)生影響，而且具有更廣泛的使用范圍。此外，WY172啟動子與WY195啟動子在植物和真菌內(nèi)均屬于誘導(dǎo)型啟動子，在植物和真菌內(nèi)均可運用。這不僅為功能基因的研究提供了更多的思路，也為啟動子的應(yīng)用提供了更多的可能。