徐春華，李超萍，時(shí) 濤，王國芬，蔡吉苗，李博勛，黃貴修

（1. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 環(huán)境與植物保護(hù)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部 熱帶作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/海南省熱帶農(nóng)業(yè)有害生物監(jiān)測(cè)與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，?？?571101; 2. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 熱帶生物技術(shù)研究所，?？?571101）

木薯（Manihot esculentaCrantz）為大戟科木薯屬灌木狀多年生作物，是和馬鈴薯、甘薯并稱的世界三大薯類作物之一，有近五千年的栽培史[1]，廣泛栽種于熱帶和亞熱帶地區(qū)的100多個(gè)國家和地區(qū)[2]。1820年前后，木薯首次傳入我國廣東地區(qū)，目前種植范圍已遍及華南地區(qū)。木薯在我國主要用作工業(yè)原料，可生產(chǎn)2 000多種產(chǎn)品[3]，相關(guān)產(chǎn)業(yè)在當(dāng)?shù)剞r(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)中占有重要地位。自2005年以來，我國一直是世界上最大的木薯進(jìn)口國[4]。由地毯草黃單胞木薯萎蔫致病變種（Xanthomonas axonopodispv.manihotis，簡(jiǎn)稱Xam）侵染引起的細(xì)菌性萎蔫病，也稱細(xì)菌性枯萎病或細(xì)菌性疫病，是世界木薯種植中的重要病害。病原菌從氣孔或傷口侵入并在附近細(xì)胞的間隙內(nèi)增殖，通過維管束進(jìn)行系統(tǒng)性擴(kuò)散。病原菌主要危害葉片和莖稈，能夠產(chǎn)生葉片角斑、萎蔫、枯萎、提前脫落及幼苗萎蔫、枝條回枯、莖干潰瘍、維管束壞死等癥狀。植株受害后長(zhǎng)勢(shì)變?nèi)?、?yán)重時(shí)死亡，重病田塊產(chǎn)量損失可達(dá)一半以上。1963年，該病首次在我國臺(tái)灣地區(qū)發(fā)生[5]，1980年在我國海南省發(fā)生，隨后擴(kuò)散到廣東、廣西等地區(qū)[6]。李超萍等[7]的調(diào)查表明，該病已在國內(nèi)木薯主栽區(qū)普遍發(fā)生，是當(dāng)前危害我國木薯最嚴(yán)重的病害。

銅基殺菌劑是作物細(xì)菌性病害防控中的常用藥劑，也是我國木薯細(xì)菌性萎蔫病防控中常見的推薦藥劑[8]。前期研究發(fā)現(xiàn)國內(nèi)外代表性菌株對(duì)銅離子和氫氧化銅、噻菌銅等銅基殺菌劑均具有較高水平的抗性，而國外部分已測(cè)序的菌株中均編碼有copTAB和XmeRSA兩個(gè)候選的抗銅基因簇[9]，但國內(nèi)及其他地區(qū)的Xam菌株是否具有抗銅性并攜帶這2個(gè)抗銅基因簇尚缺少研究。因此，本研究在繼續(xù)收集相關(guān)菌株并進(jìn)行抗銅性評(píng)價(jià)的基礎(chǔ)上，根據(jù)基因序列特征設(shè)計(jì)引物，通過 PCR 擴(kuò)增進(jìn)行這2個(gè)基因簇的克隆和序列分析研究，為進(jìn)一步開展相關(guān)基因的功能驗(yàn)證和病原菌抗銅機(jī)理分析提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）菌株：供試的39個(gè)Xam菌株均由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所提供，菌株編號(hào)、分離所用樣品采集時(shí)間和地點(diǎn)見表1。（2）培養(yǎng)基和試劑：Xam菌株的活化和培養(yǎng)均采用YGP 培養(yǎng)基；大腸桿菌的培養(yǎng)采用LB 培養(yǎng)基（參照方中達(dá)[10]的方法制備）。DNA片段膠回收試劑盒和pMD18－T載體購買自寶生物工程（大連）有限公司；Taq酶和dNTP購買自天根生化科技（北京）有限公司；所用引物對(duì)（Cop1：GTGCTGCATCGCCTGCTC和Cop2：TCAAAACCACACGCGTACAC；Xme1：ATCAGTCGGCCTTGGGC和Xme2：TCACGGCTCAAACCGATACC）由北京六合華大基因科技股份有限公司合成；大腸桿菌T1感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

表1 供試菌株及其來源

1.2 不同來源Xam病菌抗銅性評(píng)價(jià) 采用含毒介質(zhì)法中的最低抑制濃度法[11]進(jìn)行，參照慕立義[12]的方法進(jìn)行結(jié)果的檢查及計(jì)算。

1.3 候選抗銅基因簇的克隆和分析 各病原菌菌株活化、培養(yǎng)后收集菌體，用SDS法提取基因組DNA[13]。PCR反應(yīng)體系為：10×PCR緩沖液2.5 μL、10 mmol·L-1dNTP 1 μL、10 μmol·L-1各引物溶液1 μL、40%甘油3.75 μL、20%DMSO 3.75 μL、DNA模板50～100 ng、TaqDNA聚合酶1.0 U，加無菌水至25 μL。PCR循環(huán)參數(shù)為：94℃預(yù)變性3 min；94℃ 30 s、54℃ 30 s、72℃ 2 min，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用l.0 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。參照DNA片段膠回收試劑盒和pMD18－T載體試劑盒說明書進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的回收、連接和克隆，篩選陽性克隆后，各樣品隨機(jī)挑選3個(gè)克隆送北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，確認(rèn)序列后在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST上進(jìn)行比對(duì)。和近源菌株這2個(gè)基因簇的序列進(jìn)行聚類分析，用MEGA version 4.0中的NJ（Neighbor-Joining）方法生成系統(tǒng)樹，用Bootstrap 對(duì)系統(tǒng)樹進(jìn)行檢驗(yàn)，1 000次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 Xam病菌抗銅性評(píng)價(jià) 完成了39個(gè)菌株的抗銅性評(píng)價(jià)，結(jié)果表明，硫酸銅對(duì)各菌株的抑菌最低有效濃度在1.25～1.55 mmol·L-1之間。來自哥倫比亞的菌株Xam1197抗銅能力最強(qiáng)，為1.55 mmol·L-1，來自江西的XamJX08，廣西的Xam-GX44、XamGX45、XamGX46、XamGX51、XamGX-52、XamGX53、XamGX68和XamGX70，來自廣東的XamGD54、XamGD55，來自海南的XamHN-57，來自柬埔寨的XamKHM05和馬來西亞Xam-ML1825的抗銅性較差，均為1.25 mmol·L-1，其他菌株的抗銅性在1.30～1.45 mmol·L-1之間（表1）。

2.2 候選抗銅基因簇的克隆和初步分析 根據(jù)2個(gè)候選基因簇的序列特征，分別設(shè)計(jì)了Cop1、Cop2和Xme1、Xme2兩對(duì)引物。提取各菌株基因組DNA后，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，各菌株用2個(gè)引物對(duì)均能獲得大小約3.4 kb的擴(kuò)增產(chǎn)物。隨機(jī)選擇國內(nèi)外17個(gè)代表性菌株（XamJX02、Xam-JX08、XamGX46、XamGX69、XamGX70、XamGD-26、XamGD54、XamHN16、XamHN57、XamMK-1823、XamKHM04、XamKHM05、XamMLXY-1825、Xam1197、Xam1198、XamUG1和XamUG2）的擴(kuò)增產(chǎn)物，純化回收、克隆后測(cè)序并進(jìn)行同源基因的比較。

所有菌株均編碼有和XamGX11完全相同的CopTAB基因簇，該基因簇由CopT、CopA和CopB等編碼方向一致的3個(gè)基因組成，3個(gè)基因之間的非編碼區(qū)長(zhǎng)度分別為90 nt和454 nt。這些菌株中，僅有XamGD26和其他菌株在copA編碼區(qū)的第964個(gè)nt為“A”，而其他菌株為“C”，對(duì)應(yīng)的氨基酸為異亮氨酸，其他菌株為纈氨酸。以其他菌株共有的基因序列進(jìn)行了初步分析，CopT編碼區(qū)全長(zhǎng)425 nt，和多個(gè)黃單胞菌的預(yù)測(cè)CopL家族金屬結(jié)合調(diào)節(jié)基因（或稱銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）僅有2個(gè)堿基的差異，同源性最高為99%（登錄號(hào)CP012063.1、CP012060.1等），該基因編碼139個(gè)aa，和番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病菌（Xanthomonas axonopodispv.vesicatoria）菌株7882的預(yù)測(cè)蛋白序列（WP_017157235.1）完全一致[14]。CopA全長(zhǎng)1 806 nt，和黃單胞菌的預(yù)測(cè)多銅氧化酶基因同源性最高，為99%（CP012063.1、CP012060.1等），有21個(gè)堿基的差異，該基因編碼601個(gè)aa，和菜豆黃單胞菌（Xanthomonas phaseoli）預(yù)測(cè)蛋白序列（WP_017157234）一致[15]。CopB全長(zhǎng)654 nt，和地毯黃單胞萬年青致病變種（Xanthomonas axonopodispv.dieffenbachiae）菌株LMG 695預(yù)測(cè)的抗銅相關(guān)基因（CP014347.1）僅有16個(gè)堿基的差異，同源性為99%，編碼369個(gè)aa，和菜豆黃單胞菌預(yù)測(cè)蛋白序列（WP_017157233）一致。

和CopTAB基因簇相同，所有菌株同樣編碼有XmeRSA基因簇，其中XmeR和XmeS位于染色體負(fù)鏈上，兩者編碼區(qū)有4個(gè)堿基的重疊，而XmeA位于正鏈上，和另外2個(gè)基因編碼區(qū)方向相反并有161 nt的間隔區(qū)。這些菌株中，Xam-GX69和XamGD54與其他菌株均有1nt的序列差異。XamGX69在XmeS編碼區(qū)的第1 015個(gè)nt為“A”，而其他菌株為“C”，對(duì)應(yīng)的氨基酸為蘇氨酸，其他菌株為丙氨酸。XamGD54在XmeA編碼區(qū)的第1 141個(gè)nt為“C”，而其他菌株為“G”，對(duì)應(yīng)的氨基酸為天冬氨酸，其他菌株為組氨酸。以其他菌株共有的基因序列進(jìn)行了分析，XmeR編碼區(qū)全長(zhǎng)684 nt，和多個(gè)黃單胞菌預(yù)測(cè)的DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子BaeR基因（CP012063.1、CP012060.1、CP012057.1等）同源性最高，為99%，僅有6個(gè)nt的差異，該基因編碼227個(gè)aa，和菜豆黃單胞菌等病原菌預(yù)測(cè)蛋白序列（WP_046833221、WP_017157623）一致[16]。XmeS編碼區(qū)全長(zhǎng)1 380 nt，和黃單胞菌預(yù)測(cè)的組氨酸激酶感受分泌調(diào)節(jié)基因BaeS同源性為99%，有12個(gè)nt的差異，編碼459個(gè)aa，和菜豆黃單胞菌預(yù)測(cè)蛋白序列（WP_017157622）完全相同。XmeA編碼區(qū)全長(zhǎng)1 224 nt，和多個(gè)黃單胞菌預(yù)測(cè)的外排RND（resistancenodulation-cell-division，簡(jiǎn)稱RND，耐藥結(jié)節(jié)細(xì)胞分化）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白亞基基因（CP012063.1、CP012060.1、CP012057.1等）有24個(gè)nt的差異，同源性為99%，編碼407aa，和菜豆黃單胞菌預(yù)測(cè)基因蛋白序列（WP_017157621）完全一致。

2.3 候選抗銅基因簇的系統(tǒng)發(fā)育分析 在NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索和下載近源黃單胞病原菌及其他病原菌中的copTAB和XmeRSA同源基因簇（表2），構(gòu)建NJ 系統(tǒng)進(jìn)化樹，分析其進(jìn)化關(guān)系，結(jié)果表明，所獲17個(gè)木薯細(xì)菌性萎蔫病菌菌株的copTAB基因簇聚為1個(gè)分枝，和菜豆黃單胞菜豆變種（Xanthomonas phaseolipv.phaseoli）菌株P(guān)R1同源基因的親緣關(guān)系最近。柑橘潰瘍病菌（Xanthomonas axonopodispv.citri）菌株306、檸檬黃單胞病檸檬致病變種（Xanthomonas citripv.citri）菌株LH276、檸檬黃單胞菌（Xanthomonas citripv.punicae）菌株LMG7504和菜豆普通細(xì)菌性疫病病菌（Xanthomonas fuscanssubsp.fuscans）菌株ISO118C5等聚成1個(gè)分枝，和木薯細(xì)菌性萎蔫病菌菌株有很高的同源性。細(xì)菌性葉斑病菌（Xanthomonas axonopodispv. vesicatoria）菌株7882、檸檬黃單胞病菌（Xanthomonas citrisubsp. citri）菌株A44和野油菜黃單胞菌胡桃致病變種（Xanthomonas campestrispv.juglandis）菌株C5聚為1個(gè)分枝，同源性也較高。農(nóng)桿菌（Agrobacterium）菌株CFBP 6 623、丁香假單胞菌丁香致病變種（Pseudomonas syringaepv.syringae）菌株DC3000和木薯細(xì)菌性萎蔫病菌菌株的同源性最低（圖1）。

圖1 供試菌株的 copTAB基因簇聚類分析XamJX08 代表相同的 16 個(gè)序列。

表2 近源黃單胞病原菌及其他病原菌的抗銅基因簇

各木薯細(xì)菌性萎蔫病菌菌株的XmeRSA基因簇同樣聚為1個(gè)分枝，菜豆黃單胞菜豆變種菌株Xcp25同源基因的相似性最高。地毯草黃單胞菌菜豆致病菌變種（Xanthomonas axonopodispv.phaseoli）菌株ISO98C12和野油菜黃單胞菌辣椒致病變種（Xanthomonas campestrispv.vesicatoria）菌株85-10聚為1個(gè)分枝，同源性也較高。檸檬黃單胞病菌菌株29-1、檸檬黃單胞病杧果致病變種（Xanthomonas citripv.mangiferaeindicae）GXG07和 塔斯曼尼亞歐文氏菌（Erwinia tasmaniensis）菌株ET1/99親緣關(guān)系較近，聚為1個(gè)分枝，和木薯細(xì)菌性萎蔫病菌親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。穿孔黃單胞（Xanthomonas perforans）菌株91-118和甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus）菌株B25與木薯細(xì)菌性萎蔫病菌親緣關(guān)系最遠(yuǎn)（圖2）。

圖2 供試菌株的 XmeRSA基因簇聚類分析XamJX08 代表相同的 15 個(gè)序列。

3 討 論

研究結(jié)果表明，來自國內(nèi)不同種植區(qū)以及密克羅尼西亞、馬來西亞、烏干達(dá)、哥倫比亞等不同國家的木薯細(xì)菌性萎蔫病菌均對(duì)銅離子具有較高的抗性。分子克隆結(jié)果表明，所有供試菌株均攜帶有copTAB和XmeRSA兩個(gè)高度保守的抗銅基因簇，其和黃單胞及其他常見病原菌的抗銅相關(guān)基因也有較高的同源性，相關(guān)基因在病原菌抗銅反應(yīng)及其他方面的作用機(jī)制，將是下一步的研究重點(diǎn)。

不同病原細(xì)菌之間的抗銅基因具有保守性，敏感性菌株常通過結(jié)合轉(zhuǎn)移獲得相關(guān)基因并產(chǎn)生抗銅性[21]。國外研究結(jié)果表明，隨著銅基殺菌劑使用，危害番茄和柑橘的黃單胞病菌中，抗銅菌株的數(shù)量和比例也在不斷增加[22-23]。國內(nèi)也有研究結(jié)果表明，隨著銅基殺菌劑的使用，危害核桃的細(xì)菌性疫病病原菌（Xanthomonas arboricolapv.juglandis）菌株種群中出現(xiàn)抗銅能力不同的抗銅性菌株[24]；臺(tái)灣地區(qū)的細(xì)菌性瘡痂病菌（Xanthomonas euvesicatoria）和柑橘潰瘍病菌也都具有抗銅性[25]。本研究結(jié)果表明，國內(nèi)外代表性菌株均具備抗銅性，分析菌株之間可能存在廣泛的抗銅相關(guān)基因轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。

除抗銅外，copTAB基因簇還參與黃單胞菌的其他功能。例如番茄瘡痂病菌（Xanthomonas gardneri）菌株Xv10的copB基因同時(shí)控制著抗銅性和侵染番茄的能力[26]，而水稻白葉枯病菌（Xanthomonas oryzaepv.oryzae）菌株P(guān)XO99的copAB上產(chǎn)生6個(gè)氨基酸突變，導(dǎo)致其對(duì)銅離子敏感而且降低了對(duì)水稻的侵染能力[27]。筆者團(tuán)隊(duì)在國內(nèi)木薯主栽區(qū)及柬埔寨、哥倫比亞、烏干達(dá)、密克羅尼西亞、馬來西亞等地區(qū)收集病原菌，發(fā)現(xiàn)所有菌株均具有較高的抗銅性。除國內(nèi)廣西、廣東等部分重病區(qū)之外，其他國家和地區(qū)并無使用銅基殺菌劑的記錄，分析這2個(gè)基因簇可能和病原菌侵染寄主、適應(yīng)環(huán)境等方面功能相關(guān)。

前人研究結(jié)果表明，抗銅性黃單胞病菌對(duì)銅離子的抗性水平通常在0.6～1.2 mmol·L-1之間[24]，本研究結(jié)果表明木薯細(xì)菌性萎蔫病菌的抗性水平在1.25～1.55 mmol·L-1，整體上其抗銅能力高于前人報(bào)道的其他菌株。copTAB基因簇分別編碼銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、多銅氧化酶和抗銅相關(guān)基因，而XmeRSA基因簇編碼DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子、組氨酸激酶感受分泌調(diào)節(jié)因子和外排RND轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白亞基。細(xì)菌的抗銅作用包括RND等基因家族的外排作用，陽離子擴(kuò)散（CDF）基因家族的過濾作用，P型ATP酶的調(diào)控作用等不同層次的作用機(jī)制，包括銅離子的吸附沉積、隔離、修飾及向外轉(zhuǎn)運(yùn)等。木薯細(xì)菌性萎蔫病菌的抗銅能力相對(duì)較高，可能和該病菌同時(shí)具備copTAB基因簇的銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)功能和XmeRSA基因簇的外排作用相關(guān)。