李飛航，武浩恒，李 宏，李娟娟，馬 香，唐燕瓊，劉 柱

（海南大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，海口 570228）

抗菌肽（antimicrobial peptides, AMPs）也稱抗微生物肽和宿主防御肽，是一類具有抗菌活性的小分子量多肽，一般由20 ～ 50個氨基酸組成，具有凈正電荷，廣泛存在于各類植物、動物、真菌、細(xì)菌以及人體中[1-3]。依據(jù)來源的不同，可將抗菌肽劃分為動物抗菌肽、微生物抗菌肽及人造抗菌肽等[4]。抗菌肽參與多種生物學(xué)功能，比如免疫調(diào)節(jié)、血管生成、傷口愈合、抗炎活性和抗腫瘤活性。隨著對抗菌肽研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)與傳統(tǒng)抗生素相比，抗菌肽會作用于病原菌細(xì)胞膜，通過物理方式使病原菌死亡，因而不易使病原菌產(chǎn)生耐藥性，其作為抗生素的替代藥物具有巨大發(fā)展?jié)摿5-6]。相關(guān)研究表明，抗菌肽在臨床試驗(yàn)中已取得成功，但受限于其來源，難以投入實(shí)際應(yīng)用[7]。Cathelicidin-1是2006年從雞（Gallusdomesticus）中分離鑒定出來的一種抗菌肽，由26個氨基酸組成，一級結(jié)構(gòu)為NH2-RVKR VWPLVIRTVIAGYNLYRAIKKK-COOH，其具有廣譜抑菌活性，能有效抑制單核細(xì)胞增多性李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）、淋球菌（Neisseria gonorrhoeae）和大腸桿菌（Escherichia coli）等細(xì)菌的生長[8-9]。目前，對于該抗菌肽，獲取途徑仍局限于天然提取和化學(xué)合成，成本高昂，而通過基因工程技術(shù)構(gòu)建工程菌株可以高效、低廉、大量生產(chǎn)抗菌肽。因此，筆者擬通過分子克隆技術(shù)構(gòu)建抗菌肽Cathelicidin-1重組載體，在畢赤酵母（Pichia pastoris）GS115中表達(dá)，并鑒定包含該抗菌肽的發(fā)酵液的抑菌活性，旨在獲得體外表達(dá)的高活性抗菌肽，為純化抗菌肽 Cathelicidin-1、研究其作用機(jī)制及實(shí)際應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 本研究使用的菌株與質(zhì)粒見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)材料及來源

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 從美國 NEB 公司選購限制性核酸內(nèi)切酶和T4 DNA 連接酶；2×Phanta Max Master Mix，DL5000 DNA Marker、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、PCR 純化試劑盒購自中國Vazyme公司；雙色預(yù)染蛋白Marker、酵母基因組提取試劑盒和蛋白上樣緩沖液購于中國生工公司；其他所用試劑為國產(chǎn)分析級。

1.3 Cathelicidin-1的合成、擴(kuò)增及純化 抗菌肽Cathelicidin-1的全長核苷酸序列由中國生工公司合成，以該核苷酸序列為模板，通過引物對Cathelicidin-1-F/ Cathelicidin-1-R擴(kuò)增 Cathelicidin-1目的基因（Cathelicidin-1-F：5′-CCGGAATTCCGAGTAAAGCGAGTTTGGCC-3′ ； Cathelicidin-1-R： 5′-TGCTCTAGAGCACCTTGAAAGTACAAGTTTTCCTTC-3′）。 PCR 總反應(yīng)體系為 12 μL，體系包括：0.5 μL上游引物 ，0.5 μL下游引物，1 μL模板 ， 6 μL 2×PCR mix，4 μL ddH2O。PCR產(chǎn)物經(jīng)由電泳進(jìn)行檢測，依照試劑盒操作，回收目的條帶。

1.4 pGAPZαA-Cathelicidin-1重組載體構(gòu)建 首先用限制性核酸內(nèi)切酶XbaⅠ與EcoR Ⅰ消化pGAPZαA質(zhì)粒與目的基因片段，酶切總體系共100 μL，組分如下：1 μL內(nèi)切酶XbaⅠ，1 μL內(nèi)切酶EcoRⅠ，10 μL Cutsmart緩沖液 ，500 ng目的基因和500 ng空載質(zhì)粒 ，60 μL ddH2O 。依照試劑盒說明書，回收酶切產(chǎn)物，使用酶標(biāo)儀測定濃度，并通過T4 DNA 連接酶20 ℃連接1 h 。通過熱激法轉(zhuǎn)化E.coliDH5α 細(xì)胞， 37 ℃ 孵育 1 h 后涂布到含 25 mg·L-1博萊霉素的 LB 固體培養(yǎng)基上，37 ℃ 恒溫過夜培養(yǎng) ，隨機(jī)選取單菌落至 LB 培養(yǎng)基中，恒溫過夜培養(yǎng)12 h ，過夜培養(yǎng)物提取質(zhì)粒，用目的基因擴(kuò)增引物對 Cathelicidin-1-F/Cathelicidin-1-R 進(jìn)行PCR，將待測樣品送至海南楠山生物技術(shù)有限公司測序。

1.5 pGAPZαA-Cathelicidin-1重組載體擴(kuò)增、單酶切及真核轉(zhuǎn)化 選取測序正確的陽性轉(zhuǎn)化子到含有25 mg·L-1博萊霉素的 LB 培養(yǎng)基中，37 ℃ 恒溫振蕩過夜。用質(zhì)粒萃取試劑盒純化回收pGAPZαA-Cathelicidin-1重組載體，并用內(nèi)切酶BamH I酶切消化，處理體系為50 μL，包括：內(nèi)切酶BamH I 1 μL，Cutsmart緩沖液 5 μL，質(zhì)粒 600 ng，ddH2O 30 μL。依照試劑盒操作步驟回收單酶切產(chǎn)物，電轉(zhuǎn)至畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞中。酵母細(xì)胞在 30℃ 孵育 1 h 后涂布到含 50 mg·L-1博萊霉素的YPDS固體培養(yǎng)基上，30 ℃ 恒溫培養(yǎng)48 h，隨機(jī)選取單克隆菌落轉(zhuǎn)移到 YPD 培養(yǎng)基中30 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)，經(jīng)蝸牛酶處理1 h后，提取酵母基因組，用驗(yàn)證性引物pGAP-F/ 3′AOX1進(jìn)行PCR以驗(yàn)證陽性克隆子（pGAP-F:5′-GTCCCTATTTCAATCAATTGAA-3′; 3′AOX1:5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′），將待測陽性克隆子送至海南楠山生物技術(shù)有限公司測序。

1.6 Tricine-SDS-PAGE凝膠電泳分析 挑經(jīng)測序的酵母陽性轉(zhuǎn)化子單菌落至含50 mg·L-1博萊霉素的5 mL YPD培養(yǎng)基中，30 ℃ 恒溫振蕩培養(yǎng)48 h。將酵母培養(yǎng)物按初始濃度106CFU·mL-1轉(zhuǎn)接到 200 mL YPD 培養(yǎng)基中, 于30 ℃ 發(fā)酵培養(yǎng)72 h，然后5 000 r·min-1離心10 min，經(jīng)濾膜過濾并收集發(fā)酵液。取20 μL發(fā)酵液與20 μL 2×蛋白上樣緩沖液混勻，以轉(zhuǎn)入空載質(zhì)粒的酵母發(fā)酵液為對照，使用試劑盒配置18% Tricine-SDS-PAGE凝膠，隨后進(jìn)行電泳分析，使用考馬斯亮藍(lán)處理1 h，經(jīng)脫色液處理3 h 后觀察結(jié)果。

1.7 重組酵母發(fā)酵液抑菌活性鑒定 以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為指示菌，使用牛津杯法與抑菌曲線法分別測定發(fā)酵液抑菌活性。對于牛津杯法，先將轉(zhuǎn)接培養(yǎng)的2種指示菌恒溫培育12 h，取5×106CFU的初始菌量涂板，待平板晾干后，將牛津杯豎直放置其上，往其中加入100 μL發(fā)酵液，37 ℃放置12 h后，觀察有無抑菌圈，使用游標(biāo)卡尺記錄其直徑。對于抑菌活性測定，先使用96孔板接種107CFU初始指示菌菌量，培養(yǎng)總體積200 μL，然后加入不同體積的發(fā)酵液，使其體積分?jǐn)?shù)分別達(dá)到25%、50%、75%和100%，以轉(zhuǎn)入空載質(zhì)粒重組菌株等體積分?jǐn)?shù)的發(fā)酵液體為陰性對照，設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，在培養(yǎng)期間，每3 h測定1次OD600吸光值，繪制抑菌曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 pGAPZαA-Cathelicidin-1表達(dá)載體構(gòu)建 為了獲得分泌至P.pastoris胞外的抗菌肽，以便于后續(xù)檢測，選用pGAPZαA為載體，將外源片段插入其中α-因子分泌信號肽編碼序列下游。從圖1可知，重組載體在其表達(dá)的蛋白N-端添加釀酒酵母α-因子分泌信號肽，使得表達(dá)的抗菌肽可以分泌到發(fā)酵液中。pGAPZαA的GAP啟動子為組成型啟動子，無需誘導(dǎo)物即可表達(dá)重組蛋白。

圖1 pGAPZαA空載體與攜帶外源片段的pGAPZαA- Cathelicidin-1重組載體圖譜

通過PCR擴(kuò)增Cathelicidin-1全長序列（123 bp），并在其5′及3′端分別引入相應(yīng)的酶切位點(diǎn)。通過電泳分析PCR產(chǎn)物，由圖可知在大約 120 bp處存在1條明亮單一的條帶，即為目的條帶，表明獲得符合預(yù)期的PCR產(chǎn)物（圖2）。

圖2 Cathelicidin-1編碼基因PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物

純化 PCR 產(chǎn)物，與pGAPZαA載體用相同的內(nèi)切酶XbaⅠ和EcoR Ⅰ雙酶切處理，回收酶切產(chǎn)物。接著，將酶切產(chǎn)物連接，構(gòu)建融合表達(dá)載體pGAPZαA- Cathelicidin-1，通過熱激導(dǎo)入E. coliDH5α 細(xì)胞中，均勻涂布到有25 mg·L-1博萊霉素的抗性平板上。最后，隨機(jī)挑取抗性平板的單菌落，通過菌液 PCR驗(yàn)證是否為陽性。 電泳結(jié)果表明，可以獲得 120 bp左右 的目的條帶，PCR產(chǎn)物條帶單一且濃度豐富（圖3，泳道 3～9）。隨后提取質(zhì)粒，送至海南楠山生物技術(shù)有限公司，測序?qū)Ρ缺砻饕褬?gòu)建成功重組載體。

2.2 Cathelicidin-1的真核表達(dá)及 Tricine-SDSPAGE 凝膠電泳分析 pGAPZαA載體能夠整合到酵母染色體上，具有較高遺傳穩(wěn)定性。為了防止環(huán)狀載體與染色體整合時發(fā)生隨機(jī)斷裂，在將重組載體pGAPZαA- Cathelicidin-1轉(zhuǎn)化酵母之前首先對其進(jìn)行單酶切，以固定斷裂位點(diǎn)。由圖4可知，通過內(nèi)切酶BamH I對重組載體進(jìn)行單酶切后，酶切后的線性質(zhì)粒（圖4，泳道2～4）泳動速度要低于未酶切的環(huán)狀質(zhì)粒（圖4，泳道1），證明酶切成功，隨后純化單酶切產(chǎn)物。

將重組載體單酶切產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化至P. pastorisGS115感受態(tài)細(xì)胞中，均勻涂布在有50 mg·L-1博萊霉素抗性平板上，挑選陽性克隆，轉(zhuǎn)接到5 ml YPD培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h，經(jīng)蝸牛酶處理后，提取基因組，通過PCR擴(kuò)增后，電泳驗(yàn)證。由圖可知，能夠獲得與陽性對照大小一致的目的產(chǎn)物，PCR產(chǎn)物條帶單一且濃度豐富（圖5，泳道3）。

圖5 基因組PCR鑒定重組載體轉(zhuǎn)化P. pastoris GS115陽性克隆

回收PCR產(chǎn)物，送至海南楠山生物技術(shù)有限公司分析，結(jié)果表明，重組載體已整合到酵母基因組中，且開放閱讀框未出現(xiàn)突變，一致性達(dá)100%（圖6-A和圖6-B）。最后，將重組酵母轉(zhuǎn)接到Y(jié)PD培養(yǎng)基中發(fā)酵72 h，離心收集發(fā)酵液，進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE分析，結(jié)果表明，與轉(zhuǎn)化空載體的菌株相比，表達(dá)抗菌肽的重組菌株發(fā)酵液在10 kDa處出現(xiàn)顯著目的條帶，與預(yù)期大小一致，表明抗菌肽以胞外分泌形式表達(dá)（圖7）。

圖7 Tricine-SDS-PAGE 分析Cathelicidin-1的胞外分泌表達(dá)

2.3 發(fā)酵液抑菌活性測定 以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌分別為革蘭氏陰性與陽性指示菌，分別采用牛津杯法和抑菌曲線測定法鑒定本研究重組菌株的發(fā)酵液抑菌活性。牛津杯法結(jié)果表明，表達(dá)抗菌肽Cathelicidin-1的重組酵母發(fā)酵液對于大腸桿菌有明顯的抑菌效果，產(chǎn)生抑菌圈直徑達(dá)15 mm（圖8-A），而對于金黃色葡萄球菌則觀察不到明顯的抑菌圈（圖8-B），幾乎沒有抑菌效果。

圖8 牛津杯法檢測表達(dá)Cathelicidin-1的重組酵母發(fā)酵液對大腸桿菌（A）和金黃色葡萄球菌的抑菌圈（B）1～3:生物學(xué)重復(fù)；4～6：生物學(xué)重復(fù)。

經(jīng)SPSS 23對24 h時的OD值進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果表明添加50%、75%、100%抗菌肽Cathelicidin-1發(fā)酵液與其他組存在顯著差異（P<0.05），與表達(dá)空白載體的重組酵母發(fā)酵液相比，隨著表達(dá)Cathelicidin-1的酵母發(fā)酵液所占體積分?jǐn)?shù)的提高，大腸桿菌的生長速度逐漸減緩，表明發(fā)酵液對于大腸桿菌呈現(xiàn)濃度依賴性的抑菌活性，在發(fā)酵液達(dá)到100%的情況下，大腸桿菌無法生長，被完全抑制（圖9-A）。與此不同，對于金黃色葡萄球菌，各個組別在24 h時的OD值都無顯著差異，說明表達(dá)Cathelicidin-1的酵母發(fā)酵液對于金黃色葡萄球菌的生長并未產(chǎn)生顯著抑制效果，甚至100%體積分?jǐn)?shù)的發(fā)酵液也并未對金黃色葡萄球菌的生長造成任何顯著影響（圖9-B）。

圖9 表達(dá)Cathelicidin-1的酵母發(fā)酵液對于大腸桿菌（A）和金黃色葡萄球菌（B）的抑菌曲線

3 討 論

抗菌肽是近年來受到普遍關(guān)注，有望替代抗生素的一類抗菌劑, 與大多數(shù)主要通過阻斷有限的細(xì)胞內(nèi)靶點(diǎn)發(fā)揮作用的常規(guī)抗生素不同，它們的殺菌活性通常來自于破壞細(xì)菌膜完整性的能力[10]。目前，已有多個模型對抗菌肽的抗菌機(jī)制進(jìn)行解析，其中多數(shù)模型提出抗菌肽主要靶向破壞細(xì)胞膜[11]。膜靶向模型解釋抗菌肽對細(xì)菌細(xì)胞的選擇性依賴于帶負(fù)電荷的細(xì)菌細(xì)胞和兩性離子真核細(xì)胞之間的表面電荷差異[12]。陽離子抗菌肽被吸引到陰離子細(xì)菌細(xì)胞表面并與之結(jié)合，從而破壞生物膜完整性，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[13-14]。由于抗菌肽是對細(xì)菌細(xì)胞膜造成物理破壞從而抑菌，細(xì)菌不能針對這種作用方式產(chǎn)生耐藥性，因此，抗菌肽被認(rèn)為是前景巨大的抗菌候選藥物，有可能解決迅速增長的抗微生物藥物耐藥性危機(jī)[15]。

有研究表明，抗菌肽Cathelicidin-1具有良好抗菌活性，對多種細(xì)菌病原菌都具有較好的抑菌效果[8]。然而，目前獲取Cathelicidin-1的方式仍局限于天然提取和化學(xué)合成，成本高昂，相比之下，通過基因工程表達(dá)Cathelicidin-1抗菌肽無疑是降低生產(chǎn)成本、提高產(chǎn)量的有效途徑。

近年來，許多報道通過畢赤酵母表達(dá)蛋白系統(tǒng)表達(dá)蛋白，并且酵母表達(dá)系統(tǒng)也在逐年優(yōu)化，本研究采用的pGAPZαA表達(dá)載體中的GAP類啟動子為組成型的啟動子，不同于誘導(dǎo)型啟動子，無需添加有毒的誘導(dǎo)物即可高效誘導(dǎo)表達(dá)外源蛋白，且該載體中含有的α分泌信號肽編碼序列可以與外源蛋白融合表達(dá)，引導(dǎo)外源蛋白一同分泌到胞外，并且α分泌信號肽在分泌過程中會發(fā)生自剪切，從而不對外源蛋白的最終結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。本研究采用上述經(jīng)過優(yōu)化的畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，旨在獲得高效表達(dá)且具有顯著抗菌活性的抗菌肽Cathelicidin-1。測序?qū)Ρ冉Y(jié)果證明，Cathelicidin-1基因已正確整合到畢赤酵母基因組中，而且，Tricine-SDS-PAGE分析表明，Cathelicidin-1抗菌肽以分泌方式表達(dá)于酵母發(fā)酵液中。進(jìn)一步通過抑菌圈和抑菌曲線測定實(shí)驗(yàn)可知，含有外泌Cathelicidin-1抗菌肽的酵母發(fā)酵液對以濃度依賴的方式對大腸桿菌產(chǎn)生良好抑菌效果，只需少量即可顯著抑制大腸桿菌的生長，在100%添加時完全抑制其生長。本研究構(gòu)建的Cathelicidin-1抗菌肽酵母表達(dá)系統(tǒng)，以及獲得的外源分泌表達(dá)Cathelicidin-1抗菌肽，為后續(xù)進(jìn)一步研究Cathelicidin-1抗菌肽的抑菌機(jī)制及應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。