郭冰蓮 李 季 呂夢迪 薛旭玲 劉紅科

(南京師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，南京 210023)

卵巢癌是全球女性第六大常見癌癥和第七大癌癥死亡原因，其30年總生存率低于1%，急需尋找高效的治療方法[1-2]。在鉑類藥物臨床取得巨大成功的推動下，多年來，人們一直在研究金屬配合物用于抗癌治療劑[3]。半夾心Os（Ⅱ）配合物采用典型的“琴凳”幾何形狀結(jié)構(gòu)，具有六元η6配位的芳烴配體，具有良好的抗癌活性，很多研究者將它視作潛在的抗癌藥物[4]。多核芳基金屬配合物與單核配合物的抗癌機制明顯不同，可以通過多種機制發(fā)揮作用，可以降低耐藥現(xiàn)象[5]。Liang 等用芳烴鋨（Ⅱ）配合物與二甲雙胍聯(lián)合使用，通過葡萄糖代謝重編程作為在低血糖條件下進(jìn)行癌癥治療的新策略[6]。Sadler 等合成的碘化芳烴Os（Ⅱ）配合物中的Os—I 鍵在水溶液中可以被谷胱甘肽(GSH)激活，在體內(nèi)外均顯示出良好的抗癌性能[7]。Xue 等合成的芳烴Os（Ⅱ）姜黃素配合物，光激發(fā)后氧化為Os（Ⅲ），造成DNA 和線粒體損傷，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[8]。Guo 等構(gòu)建的Os4配合物在808 nm 激光的照射下具有極高的光熱轉(zhuǎn)換能力，靶向人黑色素瘤細(xì)胞中的線粒體，在體內(nèi)外充當(dāng)抗腫瘤光熱治療劑[9]。研究表明芳基Os（Ⅱ）配合物在抗腫瘤方面具有巨大的潛在價值。

Stockwell 于2012 年首次報道的鐵死亡是一種鐵依賴性的非凋亡性細(xì)胞死亡[10]，其核心事件是過度活性氧(ROS)介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化，在鐵催化作用下，可以將內(nèi)源性H2O2轉(zhuǎn)化為羥基自由基(·OH)，ROS 的產(chǎn)生和積累進(jìn)一步導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化物(LPO)的聚集并破壞癌細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡，最終導(dǎo)致質(zhì)膜損傷和細(xì)胞死亡[11-14]。Guo 等設(shè)計合成靶向線粒體的環(huán)金屬銥（Ⅲ）配合物MitoIrL2，在缺氧光照下引起腫瘤細(xì)胞LPO 的積累、線粒體形態(tài)收縮、谷胱甘肽過氧化物酶4(GPX4)下調(diào)，誘導(dǎo)多種細(xì)胞鐵死亡協(xié)同細(xì)胞凋亡[15]。Zhao等報道了一種含有新的手性吡啶RAS 選擇性致死配體Ir（Ⅲ）復(fù)合物Ir1，靶向GPX4 和ErbB，誘導(dǎo)人纖維肉瘤細(xì)胞鐵死亡[16]。鐵死亡已經(jīng)成為一種重要的腫瘤抑制機制，有望通過將該機制轉(zhuǎn)化為有效的癌癥治療方法，用于癌癥的化療、免疫治療等[17]。

我們設(shè)計、合成了一種雙核環(huán)狀芳基金屬鋨配合物[Os(η6-bip)(1，3-bib)Cl]2Cl2(bib-Os)，其中η6-bip=η6-聯(lián)苯，1，3-bib=1，3-二(1H-咪唑-1-基)苯。通過MTT 法檢測配合物的抗癌活性。結(jié)果表明配合物bib-Os 對A2780 細(xì)胞具有一定的細(xì)胞毒性和選擇性，電感耦合等離子質(zhì)譜(ICP-MS)和透射電子顯微鏡(TEM)結(jié)果表明配合物bib-Os 能夠分布在細(xì)胞的線粒體中，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞ROS 水平升高。配合物bib-Os 誘導(dǎo)A2780 細(xì)胞明顯的鐵死亡，顯示出LPO積累、GSH 消耗、GPX4 下調(diào)等現(xiàn)象。配合物bib-Os是首例誘導(dǎo)腫瘤鐵死亡的芳基鋨配合物，為鋨類金屬基抗腫瘤藥物提供了一種新的治療方法。

1 實驗部分

1.1 實驗試劑、儀器和方法

實驗所有的化學(xué)藥品及試劑主要有順鉑(能源化學(xué))、Ag(CF3SO3)(安耐吉)、1，4-二碘四氟苯(安耐吉)、咪唑(安耐吉)、二甲亞砜(DMSO)，均為市售分析純，可直接使用，無需提純，根據(jù)文獻(xiàn)方法制備二聚前體[(η6-bip)OsCl2]2和1，3-二(1H-咪唑-1-基)苯(1，3-bib)[18]。生化試劑主要有3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)、Dulbecco 優(yōu)化的細(xì)胞培養(yǎng)基(DMEM)、RIPA 裂解緩沖液(碧云天，中國)、鏈霉素和青霉素、胰蛋白消化酶-EDTA、BCA 蛋白定量試驗(凱基，中國)、SDS-PAGE 樣品加載緩沖液(6×)(碧云天，中國)、熒光素(FITC)標(biāo)記山羊抗兔lgG(H+L)(碧云天，中國)。

在室溫下用Bruker AVANCE 400 光譜儀記錄1H NMR 譜圖。UV-Vis 數(shù)據(jù)采用PerkinElmer Lambda 365 紫外可見光譜儀進(jìn)行收集。使用LabServ K3 多功能酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞毒活性。在PerkinElmer 240C 元素分析儀上測量C、H 和N 的含量。用型號為BD FACSverse(美國)的流式細(xì)胞儀進(jìn)行流式檢測。用型號為A1 Nikon(日本)的激光共聚焦顯微鏡(LCSM)進(jìn)行成像。采用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS，X Series 2，Thermo Fisher)測定金屬Os元素在細(xì)胞內(nèi)的含量。使用Hitachi H-7650透射電子顯微鏡(TEM)進(jìn)行細(xì)胞成像。在Mini-Protean Tetra System(BIORAD) 上進(jìn)行蛋白免疫印跡(Western Blot)實驗。

1.2 bib-Os的合成

將配體1，3-bib(0.042 g，0.2 mmol)和二聚前體[(η6-bip)OsCl2]2(0.083 g，0.1 mmol)加入到兩頸燒瓶中，抽真空充氬氣后加入8 mL 無水二氯甲烷溶液，在室溫下攪拌約48 h，TLC 跟蹤檢測完全反應(yīng)后，減壓除去溶劑得到配合物bib-Os，用硅膠(V二氯甲烷∶V甲醇=1∶10)柱層析純化后，真空干燥，得到0.1 g淺黃色粉末，產(chǎn)率為80%。1H NMR (DMSO-d6，400 MHz)：δ10.22(4H，s，Him)，8.90(2H，s，Hbz，1，3-bib)，7.96(4H，t，Him)，7.71(4H，m，Hbz，1，3-bib)，7.68(2H，m，Hbz，1，3-bib)，7.67(4H，s，Hbz，1，3-bib)，7.51(4H，s，Hbz，η6-bip)，7.35(6H，m，Hbz，η6-bip)，6.97(4H，d，J=5.7 Hz，η6-bip)，6.71(4H，t，J=5.4 Hz，η6-bip)，6.46(2H，t，J=5.4 Hz，η6-bip)，其中Him表示咪唑基上的氫，Hbz表示苯基上的氫。ESI-MS(+，m/z)：[bib-Os-Cl-]+理論值1 215.7，實驗值1 217.0，[bib-Os-2Cl-]+理論值590.0，實驗值591.2。元素分析按C48H44N8O2Cl4Os2(%)的計算值(%)：C 44.79，H 3.45，N 8.71；實驗值(%)：C 44.73，H 3.54，N 8.67。

1.3 配合物親脂性

采用搖瓶法測定配體、二聚前體及配合物bib-Os 的親脂性(lgPo/w)，并采用UV-Vis 進(jìn)行分析。將生理鹽水(0.9%)和正辛醇搖勻飽和4 d，將(10 μL，10 mmol·L-1)配合物溶解于生理鹽水(0.9%)中，并加入等體積的正辛醇，振蕩過夜。8 000 r·min-1離心8 min 后分成兩相，用UV-Vis 吸收光譜測定辛醇有機相和水相的化合物含量，計算脂水分配系數(shù)：Po/w=co/cw=Ao/Aw，其中A為吸光度。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

MCF-7(人乳腺癌細(xì)胞)、A2780(人卵巢癌細(xì)胞)、A549(人肺癌細(xì)胞)、LO2(人正常肝細(xì)胞)等細(xì)胞系來源于中山大學(xué)實驗動物中心。細(xì)胞放在含10%胎牛血清、含1%的鏈霉素(100 μg·mL-1)和青霉素(100 U·mL-1)的DMEM 培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)。在每個實驗中，用DMSO(φ=1%)處理的細(xì)胞作為空白對照組。

1.5 細(xì)胞毒性

細(xì)胞毒性試驗采用MTT法測定配體1，3-bib、二聚前體、配合物bib-Os 及對照藥物順鉑對癌細(xì)胞(A2780、MCF-7、A549)和正常細(xì)胞LO2 的毒性?；罴?xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能還原外源性黃色MTT，生成不溶于水的藍(lán)紫色結(jié)晶甲臜，此沉淀在細(xì)胞中可用DMSO溶解，在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比[19]，之后用酶標(biāo)儀在492 nm 波長處檢測細(xì)胞光密度(OD)值，即可獲得細(xì)胞毒性。

在恒溫37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞，將含有細(xì)胞(5×104mL-1)的DMEM 培養(yǎng)基100 μL 接種到96 孔板中，培養(yǎng)過夜。向每孔加入100 μL 不同濃度梯度的藥物，共孵育48 h 后，每孔加入20 μL MTT 溶液(5 mg·mL-1)，再孵育4 h。小心去除培養(yǎng)基，每孔加入150 μL DMSO。搖板振蕩5 min，使用酶標(biāo)儀讀取492 nm處的吸光度。引用的IC50值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。所有情況下DMSO 的最大濃度(φ)均控制在1%。

為了觀察ROS 清除劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)、鐵離子螯合劑去鐵胺(DFO)，鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1(Fer-1)是否能夠抑制配合物引起的細(xì)胞死亡，在加入配合物bib-Os 前先和NAC(1 mg·mL-1)，F(xiàn)er-1(10 μmol·L-1)及DFO(2 μmol·L-1)共孵育1 h，再通過MTT法檢測最終細(xì)胞毒性。

1.6 細(xì)胞攝取實驗

通過測量金屬鋨含量測定配合物bib-Os 在A2780 細(xì)胞的攝取和分布。將細(xì)胞(1×106mL-1)接種到100 mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)過夜。移除舊培養(yǎng)基，加入含有4 μmol·L-1的配合物bib-Os 的DMEM 培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育8 h 后用胰蛋白酶收集細(xì)胞，用PBS 洗滌3次，離心收集細(xì)胞(2 000 r·min-1，5 min)。細(xì)胞在RIPA裂解緩沖液中裂解，并根據(jù)商業(yè)化說明書使用線粒體/核分離試劑盒(凱基，中國)提取細(xì)胞核、線粒體和細(xì)胞質(zhì)部分。在95 ℃下進(jìn)行消解，先用100 μL濃硝酸消化2 h，再用30%過氧化氫50 μL 消化1.5 h，最后用50 μL 濃鹽酸消化1.5 h，使這些組分完全均質(zhì)消解。最后，用超純水(Milli-Q)將溶液稀釋至最終體積為2 mL，樣品中的金屬鋨Os 含量由ICP-MS測定。

1.7 TEM觀察線粒體形態(tài)變化

取對數(shù)生長期的A2780細(xì)胞(1×106mL-1)接種培養(yǎng)于100 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)過夜。移除舊培養(yǎng)基，加入含有4 μmol·L-1配合物bib-Os 的DMEM 培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育24 h，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3 次，用含2.5%戊二醛的PBS(固定液)固定細(xì)胞4 h，小心使用刮刀收集細(xì)胞，然后用2%鋨酸后固定，梯度酒精脫水，樹脂包埋，超薄切片，飽和醋酸鈾染色30 min，檸檬酸鉛染色5 min，室溫25 ℃下，在透射電鏡JEOL JEM-1230(80 kV)上觀察并進(jìn)行拍攝。

1.8 線粒體膜電位檢測

取對數(shù)生長期的A2780 細(xì)胞以每孔5×105個的密度接種培養(yǎng)于6 孔板中，培養(yǎng)過夜。更換含有不同濃度(0、2、4、8 μmol·L-1)配合物bib-Os 的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育24 h，PBS 洗滌3 次，收集細(xì)胞，加入500 μL 的JC-1 工作液混合均勻，室溫避光孵育20 min，收集細(xì)胞用JC-1 染色緩沖液洗滌2 次，并加入500 μL JC-1 染色緩沖液重懸細(xì)胞。隨后立即使用流式細(xì)胞儀檢測，使用FlowJo 7.6 軟件處理數(shù)據(jù)。對JC-1 單體，λex=488 nm，λem=(535±20) nm；對JC-1聚合體，λex=525 nm，λem=(570±20)nm。

1.9 細(xì)胞內(nèi)ROS檢測

2，7-二氯熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)是一種可以自由穿透細(xì)胞膜的自身無光的ROS 檢測試劑，進(jìn)入細(xì)胞后，被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解，經(jīng)胞內(nèi)的ROS 氧化生成有熒光的2，7-二氯熒光素(DCF)，通過檢測DCF的熒光就可以知道細(xì)胞內(nèi)的ROS水平[19]。

(1) LCSM 成像：將處于對數(shù)生長期的A2780 細(xì)胞接種在共聚焦小皿中(細(xì)胞密度為每孔2×105個)，培養(yǎng)過夜。更換含有4 μmol·L-1配合物bib-Os 的DMEM 培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育24 h，PBS 洗滌2 次。每孔加入500 μL DCFH-DA 探針(10 μmol·L-1)，室溫孵育30 min 后用PBS 洗滌2 次，用LCSM 觀察細(xì)胞熒光強度，從而檢測細(xì)胞內(nèi)ROS 水平。對于DCFH-DA 探針，λex=488 nm，λem=(530±30)nm。

(2)流式細(xì)胞術(shù)：取對數(shù)生長期的A2780 細(xì)胞以每孔2×105個接種培養(yǎng)于6孔板中，培養(yǎng)過夜。更換含有不同濃度(0、2、4、8 μmol·L-1)配合物bib-Os 的DMEM 培養(yǎng)基，繼續(xù)共孵育24 h 后移除培養(yǎng)基，用無血清DMEM 培養(yǎng)基洗滌2 次，再向6 孔板中加入1mL DCFH-DA 探針(10 μmol·L-1)，在37 ℃孵育30 min。收集細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)基清洗以去除多余的染料。用流式細(xì)胞儀檢測ROS 的產(chǎn)生情況，以FlowJo 7.6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.10 細(xì)胞脂質(zhì)過氧化水平檢測

(1)流式細(xì)胞術(shù)：取對數(shù)生長期的A2780 細(xì)胞以每孔2×105個的密度接種培養(yǎng)于6 孔板中，培養(yǎng)過夜。更換含有不同濃度(0、2、4、8 μmol·L-1)配合物bib-Os 的DMEM 培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育24 h，結(jié)束后移除培養(yǎng)基，用DMEM 洗滌培養(yǎng)基3 次，然后向6 孔板中加入1 mL BODIPY-C11(2 μmol·L-1)，室溫避光繼續(xù)孵育30 min 后，PBS 洗滌并收集細(xì)胞，PBS 重懸。隨后立即使用流式細(xì)胞儀檢測，使用FlowJo 7.6 軟件處理數(shù)據(jù)。對于BODIPY-C11探針，λex=488 nm，λem=(520±30)nm。(2) LCSM：取對數(shù)生長期的A2780 細(xì)胞以每孔2×105個接種培養(yǎng)于35 mm 細(xì)胞培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)過夜。更換含有配合物bib-Os(4 μmol·L-1)的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育24 h，結(jié)束后移除培養(yǎng)基，用DMEM 洗滌培養(yǎng)基3 次，然后向培養(yǎng)皿中加入1mL BODIPY-C11(5 μmol·L-1)，室溫避光孵育30 min 后，用PBS 洗滌3 次。加入Hoechst 33342 探針，室溫避光條件下繼續(xù)孵育45 min，PBS 緩沖液洗滌細(xì)胞2次，隨后立即使用LCSM 觀察細(xì)胞熒光強度，從而檢測細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化水平。對BODIPY-C11探針，λex=581 nm，λem=(591±30) nm；對Hoechst 33342 探針，λex=405 nm，λem=(460±30)nm。

1.11 總GSH水平檢測

取對數(shù)生長期的A2780 細(xì)胞以每孔2×105個的密度接種培養(yǎng)于6孔板中培養(yǎng)過夜。更換含有配合物bib-Os(4 μmol·L-1)的DMEM 培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育(0、4、6、16、24 h)，PBS洗滌，用細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞，離心(1 800 r·min-1，5 min)，吸盡上清液，加入3 倍細(xì)胞沉淀體積的蛋白去除劑，充分渦旋。在液氮和37 ℃水浴下2 次快速凍融，冰上放置10 min，隨后離心(10 000 r·min-1，10 min)，取上清液按GSH 檢測試劑盒操作說明在LabServ K3酶標(biāo)儀上進(jìn)行測定。

1.12 蛋白免疫印跡(Western Blot)技術(shù)檢測GPX4蛋白

取對數(shù)生長期的A2780 細(xì)胞接種培養(yǎng)于100 mm 細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)過夜。更換含有不同濃度的配合物bib-Os(0、4、8 μmol·L-1)的DMEM 培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育6 或12 h，收集細(xì)胞并用PBS 洗滌2 遍，用RIPA 裂解緩沖液在冰上處理30 min(每5 min 振蕩1次)。裂解物離心20 min(13 400 r·min-1，4 ℃)，收集上層蛋白清液。然后根據(jù)BCA 蛋白定量實驗測定上層蛋白清液中蛋白質(zhì)濃度。加入6×SDS-PAGE 樣品加載緩沖液(碧云天，中國)，95 ℃加熱6 min，-80 ℃保存。用免疫印跡(12%丙烯酰胺凝膠)檢測30 μg 蛋白中各目標(biāo)蛋白的表達(dá)情況。利用PVDF膜轉(zhuǎn)印蛋白(200 mA，1 h)，跨膜后用脫脂牛奶(5%PBST)封閉，與按比例稀釋的一抗(抗GPX4)溶液4 ℃下孵育過夜。膜用PBST 洗滌3 次，再用FITC 偶聯(lián)的二抗避光室溫孵育1 h。用過氧化酶偶聯(lián)的相應(yīng)二抗繼續(xù)孵育1 h，膜在脫色振動篩中洗滌3 次。1∶1 混合配制發(fā)光液，反應(yīng)1 min 顯影曝光。最后用ImageJ軟件對蛋白表達(dá)進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 配合物bib-Os的合成及其表征

多核芳基Os（Ⅱ）配合物與單核配合物相比，包含更多的離子，因此，它們的脂溶性和水溶性與單核配合物有很大區(qū)別。為了合成高抗腫瘤活性的配合物，我們選擇1，3-bib 為橋聯(lián)配體，與聯(lián)苯鋨芳基前驅(qū)體[(η6-bip)OsCl2]2在室溫下反應(yīng)，構(gòu)建了雙核環(huán)狀芳基Os （Ⅱ）配合物[Os(η6-bip)(1，3-bib)Cl]2Cl2(bib-Os)(圖1)，并通過1H NMR(圖S1 和S2，Supporting information)對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。

圖1 配合物bib-Os的合成路線Fig.1 Synthetic route of complex bib-Os

2.2 配合物的親脂性

親脂性是評估生物活性分子的ADMET 特性(吸收、分布、代謝、排泄和毒性)所需的化合物最重要的物理化學(xué)參數(shù)之一，它描述了藥物通過生物膜并與血液蛋白質(zhì)和受體結(jié)合的能力[20]。采用正辛醇/水分配系數(shù)(lgPo/w)對配合物的親脂性進(jìn)行了研究和評價。圖2 數(shù)據(jù)顯示，與配體1，3-bib(lgPo/w=0.89)和二聚前體[(η6-bip)OsCl2]2(lgPo/w=0.23)的脂溶性相比，配合物bib-Os的親脂性最高(lgPo/w=1.52)，表明配合物易于進(jìn)入細(xì)胞。

圖2 搖瓶法測定化合物1,3-bib、[(η6-bip)OsCl2]2和bib-Os的脂溶性Fig.2 Determination of lipophilicity of 1,3-bib,[(η6-bip)OsCl2]2,and bib-Os by shaking flask method

2.3 配體1，3-bib和配合物bib-Os的細(xì)胞毒性

通過MTT 法研究了配體1，3-bib 和配合物bib-Os 對人源腫瘤細(xì)胞株MCF-7，A549，A2780 和正常細(xì)胞LO2 的體外細(xì)胞毒性。結(jié)果如表1 所示，配體1，3-bib 對細(xì)胞無毒性(>200 μmol·L-1)，與金屬鋨前體配位后所得的配合物活性顯著增加，其抑制腫瘤細(xì)胞增殖效果與順鉑(CDDP)相當(dāng)甚至超過順鉑。配合物bib-Os 對正常肝細(xì)胞LO2 基本沒有毒性(IC50>100 μmol·L-1)，明顯小于順鉑(IC50=16.1 μmol·L-1)，對A2780 細(xì)胞(IC50=4.2 μmol·L-1)的抗增殖活性相較于A549 細(xì)胞(IC50=18.3 μmol·L-1)和MCF-7 細(xì)胞(IC50=7.4 μmol·L-1)更好，活性約為順鉑的3.3倍。因此配合物bib-Os 對A2780 細(xì)胞具有最佳的抗腫瘤活性和選擇性，接下來我們將選擇bib-Os 在A2780細(xì)胞中進(jìn)行進(jìn)一步生物學(xué)性能研究。

表1 1,3-bib、配合物bib-Os及順鉑對不同細(xì)胞株的IC50值Table 1 IC50 values of 1,3-bib,bib-Os,and cisplatin for different cell lines*

2.4 配合物bib-Os的細(xì)胞攝取分布

細(xì)胞器的靶向性有望提高藥物靶向性治療效果。小分子可以通過細(xì)胞膜的被動擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞，富集在不同的亞細(xì)胞器上，更有助于我們了解細(xì)胞攝取機制和抗腫瘤作用機制[21]。為了研究配合物bib-Os在細(xì)胞內(nèi)的分布情況，我們采用電ICP-MS檢測金屬配合物的吸收和分布。實驗結(jié)果如圖3 所示，配合物bib-Os(4 μmol·L-1)與細(xì)胞共孵育8 h 后即可進(jìn)入細(xì)胞，具有良好的過膜性。大約有55%配合物bib-Os 分布在細(xì)胞質(zhì)中，33%分布在線粒體中，僅有9%分布在細(xì)胞核中。結(jié)果表明，配合物bib-Os 不僅可以透過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞中，與親脂性實驗結(jié)果相符合，并且可以分布在線粒體中。

圖3 ICP-MS測定配合物bib-Os處理A2780細(xì)胞各組分中金屬鋨的含量Fig.3 Determination of osmium content in each component of A2780 cells treated with complex bib-Os by ICP-MS

2.5 TEM觀察線粒體形態(tài)變化

不同于傳統(tǒng)的細(xì)胞死亡方式，鐵死亡的形態(tài)學(xué)特征包括線粒體體積減少、線粒體外膜斷裂、線粒體嵴減少或缺失[22]。為了檢測配合物bib-Os 對線粒體的損傷情況，我們用TEM 觀察了配合物bib-Os處理后的線粒體形態(tài)的變化。結(jié)果如圖4 所示，未經(jīng)藥物處理的細(xì)胞顯示出邊界完整的細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核以及線粒體內(nèi)外膜與脊的形態(tài)(圖4 Control)。當(dāng)配合物bib-Os 作用于A2780 細(xì)胞24 h 后，細(xì)胞線粒體出現(xiàn)了明顯的損傷，即腫脹變圓，線粒體脊結(jié)構(gòu)消失(圖4 bib-Os)，與鐵死亡陽性藥物Erastin引起的線粒體變化相似，且線粒體損傷程度強于Erastin。實驗結(jié)果表明，配合物bib-Os 能誘導(dǎo)A2780 細(xì)胞線粒體的損傷，初步判斷配合物引起腫瘤細(xì)胞死亡方式為鐵死亡。

圖4 配合物bib-Os誘導(dǎo)A2780細(xì)胞中線粒體的形態(tài)變化的TEM照片F(xiàn)ig.4 TEM images for the morphological changes of mitochondria in A2780 cells induced by bib-Os

2.6 線粒體膜電位檢測

線粒體損傷后，線粒體膜電位會喪失，在這個過程中，線粒體膜間隙的凋亡因子通常會滲漏到細(xì)胞質(zhì)中，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[23]。近年來，有研究報道金屬配合物可以通過損傷線粒體膜電位最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[24-28]?；谂浜衔颾ib-Os 可分布在細(xì)胞線粒體中，為了進(jìn)一步確定其抗癌機理，我們對細(xì)胞線粒體的膜電位情況進(jìn)行了研究。JC-1 探針是一種線粒體膜電位依賴性熒光探針，當(dāng)線粒體具有較高的膜電位時，它會聚集在線粒體的基質(zhì)中形成聚合體(J-aggregates)，產(chǎn)生紅色熒光(590 nm)；當(dāng)線粒體膜電位下降時，JC-1 會從線粒體基質(zhì)中釋放出來，形成顯綠色熒光的單體(monomer，525 nm)，據(jù)此可以檢測化合物對線粒體膜電位的影響[29]。結(jié)果如圖5 所示，4 μmol·L-1配合物bib-Os 作用于A2780 細(xì)胞3 h 后，與未經(jīng)藥物處理的細(xì)胞相比，綠色熒光的細(xì)胞數(shù)有所增多(3.83%增至24.7%)，而紅色熒光的細(xì)胞數(shù)逐漸減少，說明經(jīng)藥物處理后細(xì)胞線粒體膜電位有所降低。并且隨著配合物濃度的增加到8 μmol·L-1，綠色熒光的細(xì)胞數(shù)增至53.2%，意味著配合物bib-Os 能引起線粒體膜電位下降，并隨濃度增加而加強。因此，細(xì)胞可能是通過線粒體損傷的方式發(fā)生了死亡。

2.7 胞內(nèi)ROS的檢測

線粒體是一種雙膜結(jié)合的亞細(xì)胞器，是細(xì)胞的能量工廠[24]。作為ROS 生成和鐵代謝的主要部位，線粒體在誘導(dǎo)鐵死亡中起著核心作用[14]。配合物bib-Os 可作用于線粒體部位，誘導(dǎo)線粒體損傷，引起整個細(xì)胞氧化還原能力的變化，且NAC 實驗證明配合物bib-Os 可以誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生ROS 從而殺傷腫瘤細(xì)胞，我們用DCFH-DA 作為細(xì)胞內(nèi)ROS 指標(biāo)，采用流式細(xì)胞術(shù)和激光共聚焦成像法檢測不同處理后細(xì)胞內(nèi)ROS 水平的變化。DCFH-DA 被細(xì)胞內(nèi)ROS 氧化后會生成綠色熒光物質(zhì)，因此我們使用了LCSM(圖6A)直觀地檢測了藥物處理后細(xì)胞內(nèi)ROS的生成。與空白對照組相比，配合物bib-Os 共孵育后綠色熒光強度明顯增亮，表明配合物可以誘導(dǎo)A2780 產(chǎn)生ROS。此外，我們進(jìn)一步用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，使用2 μmol·L-1的配合物bib-Os 與A2780 細(xì)胞共孵育4 h 后，細(xì)胞內(nèi)的ROS平均熒光強度MFI值從63.9上升到526，增加了7.23倍，隨著濃度繼續(xù)提高至8 μmol·L-1，細(xì)胞內(nèi)平均熒光強度增加到1 424，增加了約21.3 倍，胞內(nèi)ROS 水平上升幅度非常明顯(圖6B、6C)。該結(jié)果清楚地揭示了配合物bib-Os 可以誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，這可能是誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的關(guān)鍵因素之一。

圖6 (A)配合物bib-Os誘導(dǎo)A2780細(xì)胞產(chǎn)生ROS的LCSM圖像;(B、C)流式細(xì)胞儀檢測不同濃度的配合物bib-Os與A2780細(xì)胞共孵育后引起的內(nèi)部ROS水平變化Fig.6 (A)LSCM images for ROS production in A2780 cells induced by bib-Os;(B,C)Flow cytometry diagrams for the changes of ROS in A2780 cells after co-incubation with bib-Os at different concentrations

2.8 加ROS 抑制劑或鐵死亡抑制劑后配合物的細(xì)胞毒性

NAC 是一種巰基抗氧化劑，可清除細(xì)胞中的H2O2和·OH[30]。Fer-1 是一種抑制脂質(zhì)氧化并隨后抑制鐵死亡的小分子化合物，DFO 是一種鐵離子螯合劑，可結(jié)合細(xì)胞中游離的鐵離子[31]?；诖耍ㄟ^降低細(xì)胞中ROS 和鐵離子水平及抑制鐵死亡過程的方式，可以研究配合物bib-Os 對A2780 的抗腫瘤機制。我們分別以NAC、Fer-1 和DFO 為陰性對照進(jìn)行實驗。結(jié)果如圖7 所示，A2780 細(xì)胞預(yù)先用NAC(1 mg·mL-1)、Fer-1(10 μmol·L-1)或者DFO(2 μmol·L-1)處理后，可以明顯提高細(xì)胞存活率，降低細(xì)胞毒性。結(jié)合以上結(jié)果，我們認(rèn)為配合物bib-Os可以通過誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生ROS 和鐵死亡通路來抑制腫瘤生長。

圖7 NAC、Fer-1及DFO與A2780細(xì)胞共孵育后對配合物bib-Os抗增殖活性的影響Fig.7 Effects of NAC,Fer-1,and DFO on the antiproliferative activity of complex bib-Os after co-incubation with A2780 cells

2.9 細(xì)胞脂質(zhì)過氧化水平檢測

作為細(xì)胞膜的主要成分，脂質(zhì)在從膜運輸?shù)叫盘栟D(zhuǎn)導(dǎo)的各種生物學(xué)功能中發(fā)揮著重要作用。鐵死亡是一種由過度脂質(zhì)過氧化驅(qū)動的鐵依賴性調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡形式，與腫瘤的發(fā)展和治療反應(yīng)有關(guān)[32]。此外，在脂質(zhì)過氧化過程中產(chǎn)生的LPO 不僅可以進(jìn)一步誘導(dǎo)ROS 的產(chǎn)生，還可以降解為能夠共價修飾蛋白質(zhì)和核酸的反應(yīng)性化合物[33]。為了進(jìn)一步研究配合物bib-Os 誘導(dǎo)A2780 死亡的機理，我們使用脂質(zhì)過氧化探針(BODIPY 581/591 C11)對bib-Os 處理的細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化水平進(jìn)行了檢測。實驗結(jié)果表明，8 μmol·L-1的配合物bib-Os 處理細(xì)胞24 h 后，細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)過氧化水平即平均熒光強度MFI 從67.2 上升到229.0，增加了2.41 倍，胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化水平明顯上升(圖8A)。此外，我們還使用了LCSM更加直觀地觀察細(xì)胞脂質(zhì)過氧化現(xiàn)象。如圖8C 所示，與未加配合物bib-Os 的對照組相比，藥物組的熒光強度明顯提高，從而進(jìn)一步驗證了配合物可以誘導(dǎo)A2780發(fā)生脂質(zhì)過氧化。

圖8 (A、B)流式細(xì)胞儀檢測不同濃度的配合物bib-Os處理A2780細(xì)胞內(nèi)部脂質(zhì)過氧化水平變化;(C、D)LCSM研究配合物bib-Os誘導(dǎo)A2780細(xì)胞發(fā)生脂質(zhì)過氧化Fig.8 (A,B)Flow cytometry diagrams for lipid peroxidation levels in A2780 cells treated with bib-Os at different concentrations;(C,D)LCSM images for lipid peroxidation in A2780 cells induced by bib-Os

2.10 總GSH水平檢測

GSH 是細(xì)胞中含量最高的硫醇，是一種重要的抗氧化劑和自由基清除劑，可將有害毒素轉(zhuǎn)化為無害物質(zhì)并將其排出體外[34]，在許多細(xì)胞功能中起著關(guān)鍵作用，GSH 變化也是鐵死亡的標(biāo)志之一[35]。為了研究配合物bib-Os對細(xì)胞中GSH 水平的影響，我們以時間梯度(0、4、6、12、24 h)使用同等濃度的配合物bib-Os對A2780細(xì)胞進(jìn)行共孵育培養(yǎng)，結(jié)果如圖9所示。與未經(jīng)藥物處理的細(xì)胞相比，4 μmol·L-1配合物bib-Os處理細(xì)胞4 h后GSH 水平由4.67下降為3.21，當(dāng)孵育時間提高至24 h后，細(xì)胞內(nèi)GSH水平下降為1.19。因此，隨孵育時間延長，配合物bib-Os導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)GSH 含量逐漸降低，表明配合物bib-Os可以引起腫瘤細(xì)胞GSH含量的下降。

圖9 配合物bib-Os不同孵育時間對A2780細(xì)胞內(nèi)GSH水平的影響Fig.9 Effects of different incubation times of complex bib-Os on GSH level in A2780 cells

2.11 細(xì)胞鐵死亡信號通路

在鐵死亡過程中，鐵相關(guān)的脂質(zhì)過氧化氫會積累達(dá)到致死水平[36-37]。其特征在于一種硒酶(GPX4)引起的脂質(zhì)過氧化物酶修復(fù)活性的喪失，通過將磷脂和膽固醇?xì)溥^氧化物還原為無毒脂質(zhì)醇來保護(hù)細(xì)胞免受鐵死亡。因此，在一定條件下使GPX4 酶失活，會引起LPO 積累從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡[38]。我們通過蛋白免疫印跡實驗檢測GPX4 蛋白含量的表達(dá)情況，進(jìn)一步驗證細(xì)胞鐵死亡。如圖10A 所示，2 μmol·L-1配合物bib-Os 作用于A2780 細(xì)胞24 h 后，GPX4 表達(dá)量有微弱的降低，當(dāng)配合物濃度增至8 μmol·L-1時，GPX4 表達(dá)量明顯下降約50%，表明隨著濃度增大，配合物bib-Os 的抑制效果顯著增加。此外，我們又研究了藥物處理后GPX4 的時間依賴性。當(dāng)4 μmol·L-1配合物bib-Os 對A2780 細(xì)胞處理6 h后，GPX4沒有出現(xiàn)明顯的變化，當(dāng)作用時間進(jìn)一步延長達(dá)到12 h 后，GPX4 表達(dá)量相較于12 h 的空白對照顯著降低了51%，當(dāng)配合物濃度增加至8 μmol·L-1時，GPX4含量出現(xiàn)了類似更加明顯的趨勢(圖10B)。結(jié)果表明配合物bib-Os 可以隨濃度梯度和時間梯度抑制GPX4的表達(dá)，誘導(dǎo)癌細(xì)胞鐵死亡。

圖10 蛋白免疫印跡分析配合物bib-Os的(A)濃度梯度和(B)時間梯度對A2780細(xì)胞中鐵死亡信號分子GPX4的影響Fig.10 Effect of(A)concentration gradient and(B)time gradient of complex bib-Os on the iron death signaling molecule GPX4 in A2780 cells by Western blotting analysis

3 結(jié) 論

我們用1，3-bib 作配體合成并表征了一種新型環(huán)狀芳基鋨金屬配合物bib-Os，并研究了配合物的抗腫瘤增殖活性及其誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的作用機制。研究結(jié)果表明，與順鉑相比，配合物bib-Os 表現(xiàn)出更高的細(xì)胞毒性和選擇性，對正常細(xì)胞的細(xì)胞毒性較低。配合物bib-Os 的脂溶性較好，進(jìn)入細(xì)胞后，部分可分布在線粒體中，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量ROS并引起線粒體損傷膜電位下降，且在加入ROS 的清除劑NAC 之后，配合物的抗腫瘤活性受到抑制。配合物bib-Os 引起細(xì)胞脂質(zhì)過氧化積累、GSH 代謝及鐵死亡相關(guān)的蛋白GPX4 表達(dá)量下降，誘發(fā)腫瘤細(xì)胞鐵死亡?？傊@是目前芳基鋨配合物誘發(fā)抗腫瘤細(xì)胞鐵死亡的首例報道，拓展了鋨配合物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡方式，這些結(jié)果將為鋨類金屬抗腫瘤藥物的研究與發(fā)展提供一定的指導(dǎo)意義。

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