周穎東，張夢嫻，王青玲，康浩然，郭向東 （. 河南中醫(yī)藥大學，河南 鄭州 450046；. 河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000）

老年性聾（age-related hearing loss，ARHL）是隨著衰老而發(fā)生的進行性聽力損失。在發(fā)達國家，約有1/3的65歲老年人存在不同程度的聽力下降，這不僅影響他們的生活質(zhì)量，還會導致認知障礙[1]。目前認為[2]，老年性聾是一種由噪音暴露、遺傳等多因素共同作用而導致的疾病，其分子機制主要涉及氧化應激、凋亡、自噬等，病理改變包括毛細胞丟失、血管紋萎縮、螺旋神經(jīng)節(jié)及聽覺中樞的退行性變，而由聽覺中樞退行性變導致的聽力下降稱為中樞性老年性聾。盡管抗氧化劑在延緩耳蝸毛細胞丟失方面取得了一定的進展，但多數(shù)抗氧化劑僅針對單一靶點發(fā)揮作用，其臨床療效有待確認，并且有關(guān)中樞性老年性聾治療藥物的研究較少。由于老年性聾的發(fā)病機制非常復雜，單一針對耳蝸的靶向治療難以在其治療中取得較好的療效，因此需要尋找包括且不限于針對聽皮層的綜合治療方案。

中醫(yī)認為，耳與腦相通，腎精通過腦髓來滋養(yǎng)耳[3]?！夺t(yī)林改錯》中對耳聾的描述，氣血瘀滯阻塞耳與腦連接的通道是導致耳聾的原因。這些理論將腎-腦-耳-氣血聯(lián)系在一起，也成為補腎活血法治療老年性聾的理論基礎。補腎活血湯（BushenHuoxueDecoction，BSHXD）由當歸、獨活、紅花、熟地黃、酒萸肉、醋沒藥、鹽菟絲子、杜仲、酒蓯蓉、枸杞子、鹽補骨脂等11 種中藥組成，在臨床上治療老年性聾具有較好的療效，我們推測補腎活血湯能夠通過延緩聽皮層的衰老來治療老年性聾，但該機制推論尚缺乏現(xiàn)代科學依據(jù)。

網(wǎng)絡藥理學是使用生物信息數(shù)據(jù)庫，整合疾病相關(guān)基因、預測藥物治療疾病潛在靶點及通路，從而認識藥物作用機制的一種新型藥物研發(fā)模式，現(xiàn)已成為闡釋中藥復方科學依據(jù)的有效途徑，運用網(wǎng)絡藥理學可最大限度地發(fā)揮中醫(yī)藥多化合物、多靶點、多途徑特點的優(yōu)勢[4]。在本研究中，我們使用網(wǎng)絡藥理學方法篩選補腎活血湯與中樞性老年性聾的共同靶點，利用京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）和基因本質(zhì)論（Gene Ontology，GO）分析這些分子的生物過程和信號通路，通過蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）分析篩選出核心靶點，并選取自然衰老的C57BL/6J 小鼠進行實驗驗證。本研究旨在將網(wǎng)絡藥理學與實驗研究相結(jié)合，系統(tǒng)探討補腎活血湯治療中樞性老年性聾的潛在分子機制，為老年性聾的防治提供新的策略。

1 材料和方法

1.1 網(wǎng)絡藥理學研究

1.1.1 補腎活血湯與老年性聾共同靶點獲取 使用TCMSP 數(shù)據(jù)庫（http://tcmspw.com/tcmsp.php）、ETCM數(shù)據(jù)庫（http://www.tcmip.cn/ETCM）、BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫（http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm）檢索并篩選補腎活血湯活性成分和作用靶點。活性成分滿足口服生物利用度≥30%、類藥性≥0.18 和血腦屏障≥-0.3 條件。使用UniProt 數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org）對靶點名稱規(guī)范化。3 個數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果合并且去除重復值。在Genecards 數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）、 DisGeNET 數(shù)據(jù)庫（http://www.disgenet.org）輸入關(guān)鍵詞“age related hearing loss”“presbycusis”，檢索老年性聾病理機制靶點，結(jié)果合并且去除重復值。使用在線工具Venny 2.1（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny）獲得補腎活血湯與老年性聾共同靶點，并保存韋恩圖。通過Cytoscape 3.9.0軟件構(gòu)建“藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡。

1.1.2 GO功能與KEGG通路富集分析 將補腎活血湯與老年性聾共同靶點導入DAVID 數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/home.jsp）進行GO 功能與KEGG 通路富集分析。使用微生信在線工具（http://www.bioinformatics.com.cn/）繪制GO 條形圖與KEGG 氣泡圖。

1.1.3 PPI 分析與核心基因的篩選 將補腎活血湯與老年性聾共同靶點導入在線數(shù)據(jù)庫STRING（https://string- db.org/）進行PPI 分析， 并將結(jié)果輸入Cytoscape 3.9.0 軟件進行聚類分析。我們選取degree（度值）前十位的基因作為核心靶點進一步分析，并使用Cytoscape 3.9.0 軟件繪制核心靶點相互作用網(wǎng)絡。

1.2 實驗驗證

1.2.1 動物 雄性C57BL/6J小鼠，30周齡28只、8周齡7 只，SPF 級，體質(zhì)量（30±2）g，購自江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司，動物質(zhì)量合格證號：2022114782，于河南中醫(yī)藥大學SPF動物實驗中心飼養(yǎng)。動物使用許可證號：SYXK（蘇）2018-0027，飼養(yǎng)環(huán)境：恒溫（24±2）℃，濕度55%～68%，12 h 明暗循環(huán)，充足的食物和水。本實驗已通過河南中醫(yī)藥大學倫理委員會審批，動物實驗倫理編號為：DWLL202106202。

1.2.2 藥物及試劑 補腎活血湯配方顆粒由熟地黃18 g、菟絲子18 g、補骨脂18 g、獨活6 g、當歸6 g、杜仲6 g、肉蓯蓉6 g、枸杞子6 g、山萸肉6 g、沒藥6 g、紅花3 g組成，均購自四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展有限公司。PI3K 抑制劑LY294002，批號：HY-10108，美國MCE 公司；Bax（批號：GTX32465）、Caspase-3（批號：GTX110543），美國Genetex 公司；PI3K（批號：17366）、AKT（批號：9272）、mTOR（批號：2983）、p-PI3K（批號：4257）、p-AKT（批號：4060）、p-mTOR（批號：5536），美國Cell Signaling Technology公司；內(nèi)參抗體GAPDH，批號：GB12002，中國Servicebio 公司；Alexa Flour488，批號：111-545-003，美國Jackson 公司；一步法TUNEL 細胞凋亡原位檢測試劑盒，批號：KGA7062，中國凱基生物公司；總蛋白提取試劑盒（批號：BC3710-100T）、BCA 蛋白濃度測定試劑盒（批號：PC0020），中國Solarbio公司。

1.2.3 主要儀器 MF52-M 熒光生物顯微鏡，廣州明美光電技術(shù)公司；JY-BMB石蠟包埋機，湖北錦源醫(yī)療科技有限公司；DYY-6D 電泳儀、DYCZ-24DH 電泳槽、WD9413C凝膠成像分析儀，北京六一公司。

1.2.4 動物模型復制、分組及給藥方法 所有小鼠適應性飼養(yǎng)1周后開展后續(xù)實驗。本實驗選擇了自然衰老的30周齡C57BL/6J小鼠28只作為中樞性老年性聾小鼠模型，用聽性腦干測試檢驗模型。C57BL/6J 小鼠因其自身的基因缺陷在不加以特殊干預情況下即表現(xiàn)出加速衰老表型，是老齡化研究的常用動物模型，在4月齡時即表現(xiàn)出明顯的聽力損失，并隨年齡增長進一步加重[5]。將小鼠隨機分為模型組、補腎活血湯組、LY294002（LY）組、補腎活血湯+LY組，每組7只。根據(jù)人與小鼠體表面積折算等效劑量，補腎活血湯組以12.87 g·kg-1灌胃給藥[6]，LY組以1.5 g·kg-1PI3K 抑制劑LY294002腹腔注射給藥，補腎活血湯+LY 組予以等量補腎活血湯灌胃和LY294002 腹腔注射，模型組灌胃及腹腔注射等量生理鹽水，每日1 次，持續(xù)12周。對照組選用7只8周齡青年小鼠。

1.2.5 標本采集與病理學檢測 小鼠深度麻醉后，頸椎脫臼法處死，迅速取出腦組織置于4%多聚甲醛中，4 ℃下固定過夜。石蠟包埋并連續(xù)切片。將石蠟切片常規(guī)烤片，二甲苯脫蠟，梯度濃度乙醇水合，蘇木素染色5 min，鹽酸酒精分化，氨水堿化促藍，伊紅復染5 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，封片。顯微鏡下觀察，根據(jù)海馬形態(tài)與位置定位聽皮層區(qū)域并拍攝。

1.2.6 轉(zhuǎn)移酶介導的dUTP切口末端標記（TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling，TUNEL）染色 聽皮層石蠟切片常規(guī)烤片、脫蠟和水合，檸檬酸鈉緩沖液抗原修復。TdT酶反應液室溫避光孵育60 min。Streptavidin-TRITC工作室溫避光孵育30 min， DAPI（1∶1 000）染細胞核，室溫避光反應10 min，封片，熒光生物顯微鏡拍攝，以ImageJ 1.53a軟件進行計數(shù)與分析。

1.2.7 免疫熒光染色檢測Caspase-3 蛋白表達 聽皮層石蠟切片烤片、脫蠟和水合，檸檬酸鈉抗原修復。1%山羊血清封閉液室溫封閉30 min。一抗Caspase-3（1∶800）4 ℃孵育過夜。二抗Alexa Flour 488 Donkey anti-Rabbit（1∶500）避光孵育2 h，DAPI（1∶1 000）染細胞核，室溫避光反應10 min，封片，熒光生物顯微鏡拍攝，以ImageJ 1.53a進行量化與分析。

1.2.8 免疫印跡（Western Blot，WB）法測定Bax、Caspase-3、PI3K、AKT、mTOR、p-PI3K、p-AKT、p-mTOR、GAPDH 蛋白水平 參照圖譜[7]快速分離聽皮層組織，聽皮層組織稱質(zhì)量，冰上切碎、裂解并勻漿，離心收集上清液。檢測蛋白質(zhì)濃度，加入上樣緩沖液，以100 ℃、5 min變性。制膠，上樣（40 μg蛋白質(zhì)/孔），電泳，轉(zhuǎn)膜。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。一抗Bax（1∶1 500）、Caspase-3（1∶5 000）；PI3K（1∶1 500）、AKT（1∶1 500）、mTOR（1∶1 500）、p-PI3K（1∶1 500）、p-AKT（1∶1 500）、p-mTOR（1∶1 500）、GAPDH（1∶1 000）4 ℃孵育過夜。辣根過氧化物酶（HRP）偶聯(lián)山羊抗兔IgG 室溫孵育60 h，顯影。使用ImageJ 1.53a進行量化與分析。實驗設計流程見圖1。

圖1 實驗設計流程圖Figure 1 Experimental flow chart

1.2.9 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS 23.0 和GraphPad Prism 8.0 統(tǒng)計軟件，計量資料結(jié)果以均數(shù)± 標準差（±s）表示，多組間比較采用方差分析（ANOVA）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 補腎活血湯與老年性聾共同靶點及網(wǎng)絡構(gòu)建通過TCMSP、ETCM 和BATMAN-TCM 數(shù)據(jù)庫檢索并篩選獲得滿足條件的補腎活血湯活性成分219種，所有成分作用靶點去除重復項后共有1 583 個。通過Genecards 和DisGeNET 數(shù)據(jù)庫總共獲得了8 968 個老年性聾相關(guān)靶點。將藥物的作用靶點與老年性聾相關(guān)靶點輸入在線工具Venny 2.1總共獲得了1 118個補腎活血湯-老年性聾共同靶點，見圖2。將這些結(jié)果導入Cytoscape構(gòu)建“藥物-成分-靶點-疾病”相互作用網(wǎng)絡，見圖3。

圖2 補腎活血湯（BSHXD）與老年性聾（ARHL）共同靶點的Venn 圖Figure 2 Venn diagram of common targets of Bushen Huoxue Decotion（BSHXD） and age-related hearing loss（ARHL）

圖3 補腎活血湯（BSHXD）-活性成分-共同靶點-老年性聾（ARHL）相互作用網(wǎng)絡Figure 3 The interaction network of BSHXD-active compounds-common targets-ARHL

2.2 GO 功能和KEGG 通路富集分析通過GO功能標注分析，共得到2 599 個GO 功能，包括1 947 個生化過程（BP），398個分子功能（MF）以及254個細胞組分（CC），見圖4。在BP中前10位包括：RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正向調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導、基因表達的正向調(diào)控、RNA 聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的負向調(diào)控、轉(zhuǎn)錄的正向調(diào)控、DNA 模板化、凋亡過程的負向調(diào)控、細胞增殖的正向調(diào)控、藥物反應、化學突觸傳遞、細胞增殖的負向調(diào)控。KEGG分析顯示這些靶基因涉及205條信號通路，其中最重要的10條通路是代謝通路、癌癥通路、神經(jīng)活性配體受體相互作用通路、神經(jīng)退行性變-多種疾病通路、鈣信號通路、cAMP 信號通路、阿爾茨海默病、癌癥蛋白多糖、PI3K-AKT信號通路、MAPK信號通路，見圖5。

圖4 補腎活血湯（BSHXD）與老年性聾（ARHL）共同靶點的GO富集分析Figure 4 GO enrichment analysis of common targets of BSHXD and ARHL

圖5 補腎活血湯（BSHXD）與老年性聾（ARHL）共同靶點的KEGG 富集分析Figure 5 KEGG enrichment analysis of common targets of BSHXD and ARHL

2.3 PPI 網(wǎng)絡構(gòu)建與核心靶點篩選在String 數(shù)據(jù)庫中，進一步分析了1 118個共同靶點的相互作用，并繪制PPI 網(wǎng)絡圖，見圖6。degree 值排前10 位的基因分別是SRC、TP53、PIK3R1、AKT1、HRAS、PIK3CA、CTNNB1、JUN、HSP90AA1、HDAC1。再進一步分析這些核心靶點之間的相互作用關(guān)系，見圖7；分析這些核心靶點與KEGG 富集分析結(jié)果的關(guān)系，見圖8。

圖6 補腎活血湯（BSHXD）與老年性聾（ARHL）共同靶點的PPI 網(wǎng)絡Figure 6 PPI network of common targets of BSHXD and ARHL

圖7 補腎活血湯與老年性聾（ARHL）核心靶點的PPI 網(wǎng)絡Figure 7 PPI network of core targets of BSHXD and ARHL

圖8 KEGG 前10 位通路與核心靶點的弦圖Figure 8 Chord diagram of top 10 KEGG pathways and core targets

2.4 聽皮層HE 染色見圖9。對照組聽皮層神經(jīng)元染色均勻，形態(tài)飽滿，排列整齊致密，細胞核呈類圓形，細胞膜、核膜清楚。模型組海馬區(qū)神經(jīng)元染色不均勻，排列雜亂、分布疏松，可見神經(jīng)元壞死，細胞核固縮，細胞膜，核膜不清晰，層次散亂。與模型組比，補腎活血湯組神經(jīng)元排列較整齊，神經(jīng)元病理表現(xiàn)較模型組有明顯改善。LY 組與補腎活血湯+LY 組神經(jīng)元病理表現(xiàn)與補腎活血湯組近似。

圖9 各組小鼠聽皮層病理變化（HE 染色，×400）Figure 9 Pathological changes of auditory cortex in mice of each group（HE staining，×400）

2.5 聽皮層細胞Caspase-3 的免疫熒光檢測見圖10。在聽皮層中Caspase-3主要在神經(jīng)元細胞質(zhì)內(nèi)表達。模型組小鼠聽皮層Caspase-3（P＜0.001）表達明顯上調(diào)；相比于模型組，補腎活血湯組、LY 組、補腎活血湯+LY 組Caspase-3 表達明顯下調(diào)（P＜0.001）；相對于補腎活血湯組和LY組，補腎活血湯+LY組的Caspase-3表達進一步下調(diào)（P＜0.05，P＜0.01）。

圖10 聽皮層Caspase-3免疫熒光與量化分析（ ±s，n=15）Figure 10 Immunofluorescence and quantitative analysis of Caspase-3 in auditory cortex（ ±s，n=15）

2.6 聽皮層細胞TUNEL 染色見圖11。模型組小鼠聽皮層細胞凋亡陽性細胞明顯增多（P＜0.001）；而相比于模型組，補腎活血湯組、LY組與補腎活血湯組+LY 組凋亡陽性細胞明顯降低（P＜0.001）；相對于補腎活血湯組和LY 組，補腎活血湯+LY 組的凋亡陽性細胞數(shù)進一步降低（P＜0.05）。

圖11 各組聽皮層組織TUNEL 染色結(jié)果（ ±s，n=15）Figure 11 TUNEL staining of auditory cortex（ ±s，n=15）

2.7 WB 檢測聽皮層PI3K/AKT/mTOR 信號通路與細胞凋亡相關(guān)蛋白表達見圖12。模型組小鼠聽皮層Bax、Caspase-3表達明顯上調(diào)（P＜0.001）；而相比于模型組，補腎活血湯組、LY 組與補腎活血湯+LY組Bax、Caspase-3 表達明顯下調(diào)（P＜0.05，P＜0.001，P＜0.001），但3 組間的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖12 各組聽皮層組織凋亡相關(guān)蛋白的表達（ ±s，n=15）Figure 12 Expression of apoptosis-related proteins in auditory cortex（ ±s，n=15）

補腎活血湯干預后衰老C57 小鼠聽皮層PI3K/AKT/mTOR 信號通路相關(guān)蛋白的表達情況見圖13。模型組小鼠聽皮層p-PI3K、p-Akt、p-mTOR 表達明顯上調(diào)（P＜0.01，P＜0.001）；而相比于模型組，補腎活血湯組、LY 組與補腎活血湯+LY 組可明顯下調(diào)p-PI3K、p-Akt、p-mTOR表達（P＜0.01，P＜0.001），但3組間的差異沒有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖13 各組聽皮層組織PI3K/AKT/mTOR 通路蛋白的表達（ ±s，n=15）Figure 13 Expression of proteins in PI3K /AKT /mTOR pathway in auditory cortex（ ±s，n=15）

3 討論

補腎活血湯是基于中醫(yī)耳腎相關(guān)理論、在臨床上能夠有效治療老年性聾的藥物。為了研究補腎活血湯能否通過延緩聽皮層的衰老來治療老年性聾，我們通過網(wǎng)絡藥理學方法檢索并篩選補腎活血湯中可透過血腦屏障的的活性成分和其對應的作用靶點，以及老年性聾相關(guān)基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)1 118個補腎活血湯與老年性聾的共同靶點。通過GO 與KEGG 富集分析進一步分析這些共同靶點，共獲得2 599 個GO詞條與205條可能的信號通路。因此，我們有理由相信補腎活血湯可以通過多途徑對中樞性老年性聾有治療作用。通過PPI 分析獲得度值前10 位的核心靶點，在這些核心靶點中，SRC、TP53、PIK3R1、AKT1、CTNNB1 和HDAC1 參與了細胞凋亡途徑，TP53、PIK3R1、AKT1、HRAS、PIK3CA和HSP90AA1參與了PI3K/AKT 信號通路。我們推測，補腎活血湯可能通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT 信號通路和凋亡途徑起到對聽皮層細胞的保護作用，并在補腎活血湯治療中樞性老年性聾中充當重要角色。值得注意的是，有研究[8]發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT 信號通路參與了細胞凋亡的調(diào)節(jié)，對此，我們進行了體內(nèi)實驗驗證。

越來越多的研究[9-10]表明，細胞凋亡與阿爾茲海默癥、帕金森等神經(jīng)退行性疾病密切相關(guān)。也有證據(jù)[11]顯示，聽皮層細胞的凋亡是導致中樞性老年性聾的主要原因之一。Bax是Bcl2蛋白家族中的促凋亡蛋白之一，正常情況下，Bax與Bcl2相互作用，不具有促凋亡活性，而在線粒體介導的細胞凋亡內(nèi)在通路中，胞漿中的Bax被激活并轉(zhuǎn)移到線粒體，引起線粒體外膜通透性改變，隨后引發(fā)一系列改變完成細胞程序性死亡的過程[12-13]。Caspase-3是一種半胱氨酸蛋白酶，其激活在神經(jīng)元凋亡中起著重要的作用，是線粒體途徑和死亡受體途徑介導凋亡的共同終末剪切酶[14]。D-半乳糖誘導小鼠衰老后聽力明顯下降，并且在聽皮層中發(fā)生細胞凋亡，伴隨著Caspase-3的明顯升高[15]。衰老小鼠聽皮層中Bax、Caspase-3與細胞凋亡成正相關(guān)，抑制凋亡途徑可延緩年齡相關(guān)性聽力損失[16]。本研究的免疫熒光、TUNEL和WB結(jié)果顯示，衰老聽皮層組織中凋亡的神經(jīng)細胞數(shù)量明顯增加，并且Caspase-3、bax的表達增加。

PI3K/AKT 信號通路與細胞生長、增殖密切相關(guān)，可被多種類型的細胞應激激活[17]，該通路也參與了聽皮層的衰老過程。在D-半乳糖誘導的大鼠衰老模型中觀察到p-PI3K 與p-AKT 在聽皮層內(nèi)上調(diào)[18]。我們的研究結(jié)果與此前的研究一致，衰老小鼠聽皮層PI3K/AKT 信號通路被激活，使用補腎活血湯或PI3K抑制劑都能明顯抑制PI3K/AKT信號通路。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是PI3K/AKT 通路最重要的下游分子之一，受PI3K/AKT 信號調(diào)節(jié)。mTOR 的過度激活可加速衰老小鼠的聽力損失，導致聽皮層細胞凋亡的增加[19]，而注射mTOR抑制劑雷帕霉素可以對大腦皮層神經(jīng)元起保護作用，預防老年性聾[20]。最近研究[21]表明，抑制PI3K/AKT/mTOR 可延緩耳蝸毛細胞衰老。此外，PI3K/AKT 信號通路還可通過調(diào)控下游的Bax 和Caspase-3 而調(diào)節(jié)細胞凋亡[22]。與此前的研究一致，本研究的TUNEL 染色、免疫熒光和WB 的結(jié)果均顯示，衰老小鼠聽皮層mTOR被激活，使用補腎活血湯或PI3K 抑制劑都能明顯抑制mTOR 的激活，并明顯降低衰老小鼠聽皮層細胞凋亡相關(guān)蛋白的含量。這說明補腎活血湯對凋亡的抑制作用可能是通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT/mTOR信號通路發(fā)揮作用的。

綜上所述，本研究通過對補腎活血湯進行網(wǎng)絡藥理學分析預測，發(fā)現(xiàn)補腎活血湯可能是通過調(diào)控PI3K/AKT/mTOR 信號通路與抑制細胞凋亡途徑對聽皮層衰老發(fā)揮治療作用，提示補腎活血湯有望成為一種治療中樞性老年性聾安全、有效的藥物。然而，我們的研究并沒有驗證補腎活血湯的其他有效通路，有必要通過相關(guān)實驗，進一步探索補腎活血湯治療中樞性老年性聾的作用機制。