劉迅，劉華，彭嵐玉，羅政，鄧奕輝（. 湖南中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合心腦疾病防治湖南省重點實驗室，湖南 長沙 4008；. 中國人民解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院，廣東 廣州 5000）

腦梗死（cerebral infarction，CI）是致殘的主要疾病，也是全球第二大致死性疾病[1]。糖尿病（diabetes mellitus，DM）可直接誘發(fā)或加重腦梗死，是腦梗死的主要高危因素。據(jù)統(tǒng)計[2]，與沒有糖尿病的人比較，糖尿病患者罹患腦梗死的概率明顯上升，約為沒有糖尿病的患者的2倍以上；且糖尿病合并腦梗死（diabetes mellitus complicated with cerebral infarction，DM-CI）患者的神經(jīng)功能缺損更嚴重、恢復速度更慢、病死率更高[3]。DM-CI的發(fā)病機制非常復雜，包括但不限于糖脂代謝紊亂、內(nèi)皮功能障礙、應激損傷以及炎癥反應等，其中炎癥反應在DM-CI 的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著越來越重要的作用[4-5]。

細胞焦亡是以消皮素D（GSDMD）為執(zhí)行蛋白的程序性細胞死亡方式，表現(xiàn)為細胞不斷腫脹，細胞器變形，最終細胞膜破裂，釋放IL-1β、IL-18 等炎癥因子，進而引起強烈的炎癥反應，又稱細胞炎性壞死[6]。有證據(jù)[7]支持PERK可以通過誘導TXNIP激活NLRP3 炎癥小體，使胰島β 細胞發(fā)生焦亡。事實上，PERK[8]和TXNIP/NLRP3炎癥小體[9]蛋白的表達上升也能在缺血性腦損傷的神經(jīng)元細胞上被觀察到，通過抑制神經(jīng)元上述蛋白的表達，腦缺血損傷可以得到明顯緩解。

DM-CI屬中醫(yī)“消渴病中風”范疇[10]，以氣陰兩虛，瘀血阻滯為其主要病機[11]?；谠摬C特征，課題組前期研究[12-13]認為該病的中醫(yī)治法為滋陰益氣活血，并探索出了具有治療前景的左歸降糖通脈方（原名降糖通脈方）。該方對DM-CI療效確切，具有改善糖脂代謝、減輕炎癥因子等作用[12-16]。但其能否通過調(diào)控PERK/TXNIP/NLRP3 炎癥小體途徑介導神經(jīng)元細胞焦亡，從而對DM-CI 起到神經(jīng)保護作用，目前尚不明確。

鑒于以上基礎，本研究擬以神經(jīng)元細胞焦亡為研究重點，以PERK/TXNIP/NLRP3 炎癥小體途徑為切入點，探討左歸降糖通脈方對DM-CI 大鼠PERK/TXNIP/NLRP3 炎癥小體通路及神經(jīng)元細胞焦亡的影響。

1 材料

1.1 動物SPF雄性SD大鼠，6～8周齡，體質(zhì)量160～180 g，均來自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2019-0004，動物質(zhì)量合格證號：430727221100325916，飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學實驗動物中心，溫度為（24±0.5）℃，相對濕度為50%。本實驗由湖南中醫(yī)藥大學動物倫理委員會批準，批號：LL2022022306。

1.2 藥物①左歸降糖通脈方：組方源自課題組前期的降糖通脈方，以黃芪30 g、熟地20 g、山茱萸12 g、枸杞子12 g、丹參20 g、川芎12 g、地龍12 g、水蛭8 g、黃連10 g 和石菖蒲8 g 等10 味藥組成，中藥均購自湖南中醫(yī)藥大學門診部中藥房，分別以10 倍水和8倍水進行煎藥，兩次水煎后取出藥液進行合并，將合并的藥液繼續(xù)濃縮至每毫升含2 g 生藥，在-80 ℃的溫度下儲存?zhèn)溆?。②陽性對照藥：吡格列酮二甲雙胍片， 杭州華東制藥集團生產(chǎn)， 貨號：H20 100180；阿司匹林腸溶片，拜耳集團生產(chǎn)，貨號：HJ20160685。使用前將吡格列酮二甲雙胍片和阿司匹林腸溶片按比例研磨成粉末狀，用超純水溶解制成懸液，以備后續(xù)灌胃使用。

1.3 主要試劑鏈脲佐菌素、曲拉通Triton X-100、封閉山羊血清、檸檬酸鈉緩沖液、DAPI 溶液、抗熒光衰減封片劑，北京Solarbio 公司，貨號分別為：8050、T8200、SL038、C1013、C0065、S2100；PERK、eIF2α、p-eIF2α、TXNIP、GSDMD、IL-1β、IL-18一抗，美國Abcam 公司，貨號分別為：b229912、ab169528、ab32157、ab188865、ab219800、ab254360、ab 191860；p-PERK 一抗，美國賽默飛公司，貨號：PA5- 102853；NLRP3 一抗，美國ABclonal 公司，貨號：A12694 ；Caspase-1、β-actin、NSE一抗，美國Proteintech 公司，貨號分別為：2915-1-AP、66009-1-Ig、66150-1-Ig；山羊抗小鼠二抗、山羊抗兔二抗，長沙Abiowell 公司，貨號分別為：WS0001、AWS0002。

1.4 主要儀器GA-3 型血糖測試儀、血糖試紙，長沙Sinocare 公司；DYY-6C 型蛋白電泳儀、DYCZ-24DN 型電泳槽、DYCZ-40D 型轉(zhuǎn)膜儀，北京六一生物科技有限公司；Milli-Q BiocelA10超濾除熱源純水器，德國Merck公司；HM325石蠟切片機，美國賽默飛公司；ChemiDoC XRS+化學發(fā)光凝膠成像儀，美國Bio-Rad 公司；Tissue FAXS Plus 全景組織細胞定量分析系統(tǒng)，奧地利Tissue Gnostics公司。

2 方法

2.1 模型復制及評價大鼠用高糖高脂飼料（67%基礎飼料+10%豬油+20%蔗糖+2.5%膽固醇+0.5%膽酸鈉）喂養(yǎng)4 周后禁食12 h，在冰盒上用預冷檸檬酸鈉緩沖液現(xiàn)配1%的STZ，測量體質(zhì)量后即以35 mg·kg-1STZ的劑量進行腹腔注射（現(xiàn)用），恢復飲食。在注射STZ 后的第3 天采尾尖血檢測，測得隨機血糖≥16.7 mmol·L-1且穩(wěn)定7 d 判定為糖尿病模型復制成功[17]。隨后的7 d 按照組別給予相應藥物灌胃，至第7 天灌胃結(jié)束，禁食8 h 后復制MCAO 術(shù)[18]造成局灶性腦缺血損傷，以下為具體步驟：①大鼠麻醉：測量大鼠體質(zhì)量后以50 mg·kg-11%戊巴比妥鈉的劑量進行腹腔麻醉（現(xiàn)配現(xiàn)用）；②三叉口分離：將大鼠麻醉后仰臥固定在操作板上，進行剃毛消毒處理后，以手術(shù)刀在頸部正中縱向切開長1 cm 左右的切口，用鑷子將組織進行鈍性分離，找到并剝離干凈右側(cè)頸總、頸外和頸內(nèi)動脈，三者相交處即為三叉口；③結(jié)扎、插栓：以縫合線將右側(cè)的頸總、頸外動脈的近心端進行結(jié)扎，動脈夾夾閉頸內(nèi)動脈，在距三叉口5 mm左右的頸總動脈壁上破口，從破口處將栓線插入頸內(nèi)動脈（中途松開動脈夾），直至栓線上黑色標記點對齊三叉口為基準，再以縫合線結(jié)扎頸內(nèi)動脈及頸總動脈；④消毒、縫合及保溫：術(shù)后消毒后加適量阿莫西林外用抗感染，逐層組織縫合，保溫至清醒。

以NIHSS 評分的分數(shù)達到1～3 分為準[18]，判定DM-CI 模型復制成功。使用普通飼料喂養(yǎng)假手術(shù)組大鼠，在相同時間內(nèi)按體質(zhì)量計算給予檸檬酸鈉緩沖液腹腔注射，且只將血管進行分離，不插入栓線，之后的操作與模型組的干預步驟相同。

2.2 NIHSS 評分采用Zea Longa 5 分制法[18]在大鼠麻醉清醒后評分：無神經(jīng)損傷，活動正常的計0 分；尾端倒提，左前爪伸不開的計1分；走平地向左邊轉(zhuǎn)圈的計2分；走平地向左邊傾倒的計3分；不能走平地，意識下降的計4分。

2.3 分組及給藥將95 只大鼠隨機分為5 組，每組19只。依據(jù)人與大鼠體表面積折算法[19]估算各組給藥劑量：①左歸降糖通脈方低劑量組，給予12 g·kg-1（臨床等效劑量）左歸降糖通脈方藥液；②左歸降糖通脈方高劑量組，給予24 g·kg-1（臨床等效劑量的2 倍）左歸降糖通脈方藥液；③陽性對照組，即吡格列酮二甲雙胍片和阿司匹林腸溶片組，給予140 mg·kg-1吡格列酮二甲雙胍片和27 mg·kg-1阿司匹林腸溶片（臨床等效劑量）；④假手術(shù)組、模型組，給予等量蒸餾水。

以上各組均在MCAO 術(shù)前的7 d 按照組別的對應藥液進行灌胃處理，每日2 次，連續(xù)7 d。除去模型復制不成功的大鼠（11 只）和過程中死亡的大鼠（14 只），假手術(shù)組剩下15只，模型組剩下12只，左歸降糖通脈方分別剩下低劑量13 只和高劑量15 只，陽性對照組剩下15只。

2.4 隨機血糖濃度檢測按“2.1”項下方法，大鼠麻醉后，尾靜脈采血，以血糖儀分別檢測各組大鼠注射STZ 前1 d、注射STZ 后3 d 和MCAO 術(shù)前1 d 的隨機血糖水平。

2.5 果糖胺含量檢測腹主動脈采血，靜置2 h 以后以3 000 r·min-1離心10 min（離心半徑8 cm），取上清液后立即送湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院檢驗科檢測驗果糖胺的含量。

2.6 腦梗死體積檢測大鼠麻醉后取出完整大腦，-20 ℃下速凍20 min 后除去嗅球、小腦、腦干等部分，切成冠狀片，每片厚1～2 mm 左右，每個大腦切5 片。將腦片分別用2% TTC 溶液染色和4%多聚甲醛固定后，測量每組大鼠腦梗死體積。

2.7 腦組織形態(tài)學觀察取出完整腦，經(jīng)固定、脫水、透明、石蠟包埋、切片、脫蠟、染色、封片后，顯微鏡下觀察腦組織形態(tài)學變化。

2.8 相關(guān)蛋白檢測各組隨機選取3只大鼠麻醉后分離缺血側(cè)腦皮質(zhì)和海馬區(qū)組織，加入裂解液勻漿后，測定蛋白質(zhì)濃度，再經(jīng)制膠、電泳、轉(zhuǎn)膜和封閉后，分別加入PERK（1∶1 000）、p-PERK（1∶2 000）、eIF2α（1∶3 000）、p-eIF2α（1∶5 000）、TXNIP（1∶1 000）、NLRP3（1∶1 000）、Caspase-1（1∶1 000）、GSDMD（1∶1 000）、IL-1β（1∶1 000）、IL-18（0.5 μg·mL-1）、β-actin（1∶5 000）一抗，4度孵育過夜。TBST 洗滌3 次，每次10 min，加入二抗（1∶5 000）室溫孵育60 min，洗滌后顯色成像，采用ImageJ分析條帶灰度值。

2.9 NSE 與NLRP3 共定位表達檢測各組大鼠隨機抽取5 只，麻醉、取腦、固定、脫蠟步驟同“2.7”項，通透、封閉后，滴加一抗NSE（1∶200）和NLRP3（1∶1 000）。孵育結(jié)束后經(jīng)沖洗，再滴加熒光二抗孵育1 h，洗片后滴加DAPI孵育，洗片后滴加抗熒光衰減封片劑。鏡下計數(shù)雙陽性表達細胞個數(shù)。

2.10 統(tǒng)計學處理方法采用Excel 表和SPSS 25.0 軟件處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)用均數(shù)± 標準差（±s）表示，符合正態(tài)性、方差齊性的數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，組間比較用LSD 檢驗；不滿足正態(tài)性、方差齊性的數(shù)據(jù)用非參數(shù)的秩和檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 左歸降糖通脈方對DM-CI 大鼠NIHSS 評分的影響由表1 可知，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠NIHSS 評分上升，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。與模型組比較，左歸降糖通脈方低劑量組有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；左歸降糖通脈方高劑量組及陽性對照組大鼠NIHSS 評分下降明顯，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表1 左歸降糖通脈方對糖尿病合并腦梗死（DM-CI）大鼠NIHSS 評分的影響（ ±s）Table 1 Effects of Zuogui Jiangtang Tongmai Prescription on NIHSS scores of rats with diabetes mellitus complicated with cerebral infarction（DM-CI）（ ±s）

表1 左歸降糖通脈方對糖尿病合并腦梗死（DM-CI）大鼠NIHSS 評分的影響（ ±s）Table 1 Effects of Zuogui Jiangtang Tongmai Prescription on NIHSS scores of rats with diabetes mellitus complicated with cerebral infarction（DM-CI）（ ±s）

注：與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05

NIHSS評分/分0.00 ± 0.00 2.67 ± 0.49**2.23 ± 0.44 1.53 ± 0.52#1.60 ± 0.51#組別假手術(shù)組模型組左歸降糖通脈方低劑量組左歸降糖通脈方高劑量組陽性對照組鼠數(shù)/只15 12 13 15 15

3.2 左歸降糖通脈方對DM-CI 大鼠腦梗死體積的影響TTC 染色結(jié)果如圖1、表2 所示，TTC 將正常腦組織染成紅色，將腦梗死區(qū)染成白色。假手術(shù)組全部呈現(xiàn)紅色，其余各組均呈現(xiàn)大小不一的白色（梗死灶）。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦梗死體積增大，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，左歸降糖通脈方低、高劑量組和陽性對照組腦梗死體積明顯減少（P＜0.05、P＜0.01）；與左歸降糖通脈方低劑量組和陽性對照組比較，左歸降糖通脈方高劑量組大鼠腦梗死體積減少更為明顯（P＜0.01，P＜0.05）。

圖1 各組大鼠腦梗死體積示意圖（TTC 染色）Figure 1 Schematic diagram of cerebral infarction volume of rats in each group（TTC staining）

表2 左歸降糖通脈方對糖尿病合并腦梗死（DM-CI）大鼠腦梗死體積的影響（ ±s，n=4）Table 2 Effects of Zuogui Jiangtang Tongmai Prescription on cerebral infarction volume of rats with DM-CI（ ±s，n=4）

表2 左歸降糖通脈方對糖尿病合并腦梗死（DM-CI）大鼠腦梗死體積的影響（ ±s，n=4）Table 2 Effects of Zuogui Jiangtang Tongmai Prescription on cerebral infarction volume of rats with DM-CI（ ±s，n=4）

注：與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與左歸降糖通脈方低劑量組比較，△△P＜0.01；與陽性對照組比較，▲P＜0.05

腦梗死體積/%0 24.47 ± 2.01**18.78 ± 1.95#10.68 ± 0.63##△△▲17.40 ± 2.31#組別假手術(shù)組模型組左歸降糖通脈方低劑量組左歸降糖通脈方高劑量組陽性對照組

3.3 左歸降糖通脈方對DM-CI 大鼠隨機血糖的影響見表3。每組大鼠在未進行STZ干預的情況下，隨機血糖相差不大，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。注射STZ 3 d 后，其余各組大鼠隨機血糖較假手術(shù)組均有明顯上升（P＜0.01），且組間比較的差異沒有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。給藥干預后，與模型組比較，左歸降糖通脈方低、高劑量組和陽性對照組大鼠隨機血糖均明顯下降（P＜0.05，P＜0.01），且左歸降糖通脈方高劑量組和陽性對照組較左歸降糖通脈方低劑量組下降更為明顯（P＜0.01，P＜0.05）。用藥前后差值比較，左歸降糖通脈方低、高劑量組和陽性對照組與模型組比較，差值均明顯增加（P＜0.01）；左歸降糖通脈方高劑量組和陽性對照組與左歸降糖通脈方低劑量組比較，差值增加更為明顯（P＜0.01）。

表3 左歸降糖通脈方對糖尿病合并腦梗死（DM-CI）大鼠隨機血糖的影響（ ±s，mmol·L-1）Table 3 Effects of Zuogui Jiangtang Tongmai Prescription on random blood glucose of rats with DM-CI（ ±s，mmol·L-1）

表3 左歸降糖通脈方對糖尿病合并腦梗死（DM-CI）大鼠隨機血糖的影響（ ±s，mmol·L-1）Table 3 Effects of Zuogui Jiangtang Tongmai Prescription on random blood glucose of rats with DM-CI（ ±s，mmol·L-1）

注：與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與左歸降糖通脈方低劑量組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

用藥前后差值0.21±0.34-0.60±3.46 4.02±1.25##9.73±2.12##△△9.83±2.04##△△組別假手術(shù)組模型組左歸降糖通脈方低劑量組左歸降糖通脈方高劑量組陽性對照組鼠數(shù)/只15 12 13 15 15注射STZ 前1 d 5.91±0.52 5.84±0.38 5.82±0.33 5.71±0.27 5.70±0.29注射STZ 3 d 后5.99±0.36 21.65±3.84**22.92±2.48**24.84±3.46**25.51±4.57**給藥干預后5.77±0.31 22.25±2.90**18.90±1.51#15.11±2.68##△△15.68±3.26##△

3.4 左歸降糖通脈方對DM-CI 大鼠血清果糖胺的影響由表4可知，與假手術(shù)組比較，模型組血清中的果糖胺含量升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。與模型組比較，左歸降糖通脈方低劑量組有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；左歸降糖通脈方高劑量組和陽性對照組血清中的果糖胺含量均有所下降（P＜0.05）。

表4 左歸降糖通脈方對糖尿病合并腦梗死（DM-CI）大鼠血清果糖胺的影響（ ±s，n=3）Table 4 Effects of Zuogui Jiangtang Tongmai Prescription on serum fructosamine of rats with DM-CI（ ±s，n=3）

表4 左歸降糖通脈方對糖尿病合并腦梗死（DM-CI）大鼠血清果糖胺的影響（ ±s，n=3）Table 4 Effects of Zuogui Jiangtang Tongmai Prescription on serum fructosamine of rats with DM-CI（ ±s，n=3）

注：與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05

果糖胺/（μmol·L-1）185.67±13.05 333.67±26.86**297.33±17.04 261.33±44.61#269.67±31.50#組別假手術(shù)組模型組左歸降糖通脈方低劑量組左歸降糖通脈方高劑量組陽性對照組

3.5 左歸降糖通脈方對DM-CI 大鼠腦組織形態(tài)學的影響見圖2。經(jīng)顯微鏡觀察，假手術(shù)組腦皮質(zhì)、海馬區(qū)組織結(jié)構(gòu)完整，細胞排列整齊有序，細胞周圍間隙致密無水腫，神經(jīng)元細胞形態(tài)正常；模型組腦皮質(zhì)和海馬區(qū)組織結(jié)構(gòu)疏松，神經(jīng)元細胞消失或排列紊亂，部分細胞發(fā)生核固縮，有明顯的水腫和空泡，甚至壞死；與模型組比較，左歸降糖通脈方低、高劑量組和陽性對照組大鼠腦皮質(zhì)和海馬區(qū)組織損傷均有不同程度的減輕。

圖2 各組大鼠腦組織形態(tài)示意圖（HE 染色，×200）Figure 2 Schematic diagram of brain tissue morphology of rats in each group（HE staining，× 200）

3.6 左歸降糖通脈方對DM-CI 大鼠腦組織中p-PERK、PERK、p-eIF2α、eIF2α 蛋白表達的影響如圖3～圖5所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠缺血側(cè)腦皮質(zhì)、海馬區(qū)組織中p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α 蛋白比值明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，左歸降糖通脈方低劑量組大鼠缺血側(cè)腦皮質(zhì)、海馬區(qū)組織中p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α蛋白比值有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；左歸降糖通脈方高劑量組和陽性對照組大鼠缺血側(cè)腦皮質(zhì)、海馬區(qū)組織中p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α蛋白比值明顯下降（P＜0.05，P＜0.01）。

圖3 各組大鼠腦皮質(zhì)組織p-PERK、PERK、p-eIF2α、eIF2α 蛋白電泳圖Figure 3 Protein electrophoresis of p-PERK，PERK，p-eIF2α and eIF2α in cortical tissue of rats in each group

圖4 各組大鼠海馬區(qū)組織p-PERK、PERK、p-eIF2α、eIF2α 蛋白電泳圖Figure 4 Protein electrophoresis of p-PERK，PERK，p-eIF2α and eIF2α in hippocampus of rats in each group

圖5 左歸降糖通脈方對糖尿病合并腦梗死（DM-CI）大鼠腦組織中p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α 蛋白比值的影響（ ±s，n=3）Figure 5 Effects of Zuogui Jiangtang Tongmai Prescription on the protein ratio of p-PERK/PERK and p-eIF2α/eIF2α in brain tissue of rats with DM-CI（ ±s，n=3）

3.7 左歸降糖通脈方對DM-CI 大鼠腦組織中TXNIP、NLRP3 蛋白表達的影響由圖6～圖8 可知，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠缺血側(cè)腦皮質(zhì)、海馬區(qū)組織中TXNIP、NLRP3 蛋白表達增加，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。與模型組比較，左歸降糖通脈方低劑量組僅大鼠缺血側(cè)腦皮質(zhì)組織中NLRP3 蛋白表達降低（P＜0.05），其余蛋白表達的差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；左歸降糖通脈方高劑量組大鼠缺血側(cè)腦皮質(zhì)、海馬區(qū)組織中TXNIP、NLRP3蛋白表達均降低（P＜0.05，P＜0.01）；陽性對照組大鼠缺血側(cè)腦皮質(zhì)、海馬區(qū)組織中TXNIP、NLRP3蛋白表達均明顯降低（P＜0.01）。

圖6 各組大鼠腦皮質(zhì)組織TXNIP、NLRP3 蛋白電泳圖Figure 6 Protein electrophoresis of TXNIP and NLRP3 in cortical tissue of rats in each group

圖7 各組大鼠海馬區(qū)組織TXNIP、NLRP3 蛋白電泳圖Figure 7 Protein electrophoresis of TXNIP and NLRP3 in hippocampus of rats in each group

圖8 左歸降糖通脈方對糖尿病合并腦梗死（DM-CI）大鼠腦組織中TXNIP、NLRP3 蛋白表達的影響（ ±s，n=3）Figure 8 Effects of Zuogui Jiangtang Tongmai Prescription on the protein expression of TXNIP and NLRP3 in brain tissue of rats with DM-CI（ ±s，n=3）

3.8 左歸降糖通脈方對DM-CI 大鼠腦組織中Caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18 蛋白表達的影響如圖9～圖11 所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠缺血側(cè)腦皮質(zhì)、海馬區(qū)組織中Caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18 蛋白表達明顯增加（P＜0.01）。與模型組比較，左歸降糖通脈方低劑量組大鼠缺血側(cè)腦皮質(zhì)組織中IL-18蛋白表達下降明顯（P＜0.01），海馬區(qū)組織中Caspase-1 蛋白表達下降（P＜0.05），其余差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；左歸降糖通脈方高劑量組和陽性對照組大鼠缺血側(cè)腦皮質(zhì)、海馬區(qū)組織中Caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18 蛋白表達均明顯減少（P＜0.05，P＜0.01）；與左歸降糖通脈方低劑量組比較，左歸降糖通脈方高劑量組和陽性對照組大鼠缺血側(cè)腦皮質(zhì)組織中IL-18蛋白表達明顯下降（P＜0.01），海馬區(qū)組織中Caspase-1蛋白表達降低（P＜0.05，P＜0.01）。

圖9 各組大鼠腦皮質(zhì)組織Caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18 蛋白電泳圖Figure 9 Protein electrophoresis of Caspase-1， GSDMD，IL-1β and IL-18 in cortical tissue of rats in each group

圖10 各組大鼠海馬區(qū)組織Caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18 蛋白電泳圖Figure 10 Protein electrophoresis of Caspase-1， GSDMD，IL-1β and IL-18 in hippocampus of rats in each group

圖11 左歸降糖通脈方對糖尿病合并腦梗死（DM-CI）大鼠腦組織中Caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18 蛋白表達的影響（ ±s，n=3）Figure 11 Effects of Zuogui Jiangtang Tongmai Prescription on the protein expression of Caspase-1，GSDMD，IL-1β and IL-18 in brain tissue of rats with DM-CI（ ±s，n=3）

3.9 左歸降糖通脈方對DM-CI 大鼠腦組織中NSE與NLRP3 共定位表達的影響如表5、圖12和圖13所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠缺血側(cè)腦皮質(zhì)和海馬區(qū)組織中NSE 與NLRP3 雙陽性信號細胞數(shù)量明顯增多（P＜0.01）；與模型組比較，左歸降糖通脈方低、高劑量組和陽性對照組大鼠缺血側(cè)腦皮質(zhì)和海馬區(qū)組織中NSE 與NLRP3 雙陽性信號細胞數(shù)均明顯減少（P＜0.01）；與左歸降糖通脈方低劑量組比較，左歸降糖通脈方高劑量組及陽性對照組大鼠缺血側(cè)腦皮質(zhì)和海馬區(qū)組織中NSE 與NLRP3 雙陽性信號細胞數(shù)量均明顯減少（P＜0.05，P＜0.01）。

圖12 各組大鼠腦皮質(zhì)NSE 與NLRP3 熒光共定位示意圖（×200）Figure 12 Schematic diagram of fluorescence co-localization of NSE and NLRP3 in the cerebral cortex of rats in each group（× 200）

圖13 各組大鼠海馬區(qū)NSE 與NLRP3 熒光共定位示意圖（×200）Figure 13 Schematic diagram of fluorescence co-localization of NSE and NLRP3 in hippocampus of rats in each group（× 200）

表5 左歸降糖通脈方對糖尿病合并腦梗死（DM-CI）大鼠腦組織NSE 與NLRP3 共定位表達細胞數(shù)的影響（ ±s，n=5）Table 5 Effects of Zuogui Jiangtang Tongmai Prescription on number of co-located expression cells of NSE and NLRP3 in brain tissue of rats with DM-CI（ ±s，n=5）

表5 左歸降糖通脈方對糖尿病合并腦梗死（DM-CI）大鼠腦組織NSE 與NLRP3 共定位表達細胞數(shù)的影響（ ±s，n=5）Table 5 Effects of Zuogui Jiangtang Tongmai Prescription on number of co-located expression cells of NSE and NLRP3 in brain tissue of rats with DM-CI（ ±s，n=5）

注：與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01；與左歸降糖通脈方低劑量組比較，△△P＜0.01

海馬區(qū)組織3.40±2.30 45.00±5.87**28.40±2.70##16.40±2.07##△△17.00±1.58##△△組別假手術(shù)組模型組左歸降糖通脈方低劑量組左歸降糖通脈方高劑量組陽性對照組腦皮質(zhì)組織2.80±1.48 30.20±5.36**14.60±2.07##8.40±2.07##△△9.20±2.39##△

4 討論

糖尿病合并腦梗死（DM-CI）在中醫(yī)學中沒有直接的病名，因糖尿病屬中醫(yī)“消渴”范疇，腦梗死屬中醫(yī)“缺血性中風”范疇，加上長期處于消渴易發(fā)作缺血性中風，所以本實驗把DM-CI 合稱為“消渴病中風”。中醫(yī)認為，消渴發(fā)病，皆是由于本臟（肺、胃、腎）陰津虧損，燥熱過盛所致。陰虛則氣無所附，氣虛則陰無所生，周而復始，奠定了消渴氣陰兩虛的基礎。由于長期處于消渴之下，體內(nèi)津液虧耗無以充血、氣虛乏力無以運血、血受燥熱則煎熬成塊，故消渴后期容易造成血液瘀積，而瘀血正是缺血性中風的致病根源之一。基于此，消渴病中風是以氣陰兩虛，瘀血阻滯為主要病機。在左歸降糖通脈方的組方中，重用黃芪入肺脾以急固無形之氣，走經(jīng)絡以補益有形之陰，熟地、山茱萸、枸杞子三者合用功專生血益精固髓，大壯乙癸精血，配以川芎、丹參行血海，破癥結(jié)宿血以生新血，地龍入肝治血熱，通經(jīng)絡，水蛭走血逐瘀結(jié)，利水道，佐以黃連濟君火以養(yǎng)神，石菖蒲帥氣以通竅，諸藥合用，共奏滋陰益氣活血之效。

正常情況下，錯誤折疊蛋白的積累會導致PERK自磷酸化，eIF2α也發(fā)生磷酸化，從而減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的壓力；一旦錯誤折疊蛋白超出細胞的承受范圍，磷酸化的PERK、eIF2α 就會不斷地被激活，該信號通路就會從促使細胞存活向促使細胞死亡的方向逆轉(zhuǎn)[20]。研究[7]表明，PERK/eIF2α在慢性高糖環(huán)境中的異常激活可以提高胰島β細胞中TXNIP的表達，后者激活下游NLRP3 炎癥小體，促使分泌IL-1β 和IL-18，使炎癥反應加劇，進而導致胰島β 細胞死亡。作為機體內(nèi)參與炎癥過程的關(guān)鍵靶點，TXNIP廣泛表達于全身器官和細胞中[21]。此外，當外界不利因素刺激NLRP3 炎性小體時，該炎癥小體就會催生出具有活性的Caspase-1，該炎性Caspase-1又可以通過剪切作用催生出具有活性的IL-1β 和IL-18。同時，Caspase-1作為焦亡事件發(fā)生的“劊子手”，能從抑制性結(jié)構(gòu)域C-末端中解離出具有成孔活性的N-末端結(jié)構(gòu)域（GSDMD-N）。游離的GSDMD-N 表現(xiàn)出與細胞膜上的磷酸肌醇和心磷脂強大的結(jié)合特性，在細胞膜上形成一個內(nèi)徑為12～14 nm 的跨膜孔道，最終導致嚴重的細胞膜裂解、細胞器及IL-1β、IL-18 等炎癥因子外泄[6]。數(shù)據(jù)[22]表明，NLRP3/Caspase-1/GSDMD 介導的焦亡可以造成胰島β 細胞大量丟失甚至胰島功能衰竭。此外，腦梗死中亦常見NLRP3/Caspase-1 通路激活，從而觸發(fā)細胞焦亡的現(xiàn)象[23]。結(jié)合本實驗結(jié)果，DM-CI 大鼠腦組織中PERK/TXNIP/NLRP3 通路蛋白和細胞焦亡關(guān)鍵蛋白的表達明顯上升，且特異性表達在神經(jīng)元細胞上的蛋白（NSE）與NLRP3 的雙陽性信號的細胞數(shù)量亦明顯增加，提示PERK/TXNIP/NLRP3 途徑介導的神經(jīng)元細胞焦亡可能參與該模型的神經(jīng)損傷過程。與模型組比較，經(jīng)左歸降糖通脈方干預的大鼠缺血側(cè)腦組織中PERK/TXNIP/NLRP3 通路蛋白和細胞焦亡關(guān)鍵蛋白的表達均明顯下降，NSE 與NLRP3 共定位表達細胞數(shù)量均明顯減少，這表明左歸降糖通脈方可以降低PERK/TXNIP/NLRP3 炎癥小體的表達，抑制神經(jīng)元細胞焦亡，從而對DM-CI 大鼠起到神經(jīng)保護作用。綜合實驗結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，左歸降糖通脈方對DM-CI 大鼠神經(jīng)損傷有明顯改善作用，且高劑量的左歸降糖通脈方改善作用更加明顯，這種改善作用可能是通過抑制PERK/TXNIP/NLRP3 炎癥小體途徑，減輕神經(jīng)元細胞焦亡實現(xiàn)的。

綜上，本研究初步證明左歸降糖通脈方可以通過抑制PERK/TXNIP/NLRP3 通路，減輕神經(jīng)元細胞焦亡，從而改善DM-CI損傷。