沈丹婷，祝旺，張佳河，侯秋科，劉鳳斌，3（. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 50405；. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院脾胃病科，廣東 廣州 50405；3. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院白云醫(yī)院，廣東 廣州 50470）

腹瀉型腸易激綜合征（Diarrhea-predominant irritable bowel syndrome，IBS-D）是一種臨床表現(xiàn)不僅局限于胃腸系統(tǒng)方面的功能性腸病，大多數(shù)患者還合并了腸外表現(xiàn)，如睡眠障礙、焦慮和抑郁等。研究發(fā)現(xiàn)，腸黏膜低度炎癥是IBS-D的重要發(fā)病機(jī)制之一[1-2]，與腹痛、腹瀉和腸道功能障礙等臨床癥狀的出現(xiàn)密切相關(guān)[3]。IBS-D 患者腸黏膜炎癥水平比健康對(duì)照者更顯著，改變了過(guò)去“沒(méi)有形態(tài)學(xué)上的改變，是一種功能性腸道疾病”的說(shuō)法[4]。NF-κB信號(hào)通路是導(dǎo)致IBS-D的核心炎性通路，該通路通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的免疫信號(hào)途徑，調(diào)節(jié)多種炎性因子的表達(dá)，在IBS-D患者長(zhǎng)期持續(xù)存在的腸黏膜低度炎癥的病理過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[5]。

生物鐘參與調(diào)節(jié)機(jī)體的生理病理進(jìn)程[6]，生物鐘基因CRY1 可通過(guò)抑制NF-κB 信號(hào)通路發(fā)揮抗炎作用[7]。近年來(lái)，腸道生物鐘基因表達(dá)在功能性腸病中的作用逐漸得到研究者的關(guān)注[8-13]。有研究[14]發(fā)現(xiàn)，在IBS-D 患者結(jié)腸黏膜中生物鐘基因表達(dá)節(jié)律紊亂，與IBS-SSS總分和腹痛不適評(píng)分呈顯著正相關(guān)。但目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)結(jié)腸生物鐘基因表達(dá)節(jié)律在IBS-D發(fā)病情況中作用及其發(fā)生機(jī)制的研究仍鮮見(jiàn)報(bào)道。

腸安菌泰（Chang’anJuntai，CAJT）是廣東省名中醫(yī)劉鳳斌教授在臨床上用于治療肝郁脾虛型IBS-D的有效復(fù)方[15-16]，具有疏肝止痛、健脾止瀉、寧心安神之功。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)腸安菌泰對(duì)IBS-D的治療作用與晝夜節(jié)律的調(diào)節(jié)密切相關(guān)，但具體作用機(jī)制尚不明確?；诖耍狙芯炕谏镧娬{(diào)控探討腸安菌泰對(duì)IBS-D的療效及其作用機(jī)制，以期為腸安菌泰的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物從廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)買SPF級(jí)C57BL/6J 小鼠9 只，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：44007200095171，其中雄性3 只、雌性6 只，4～6 周齡，體質(zhì)量14～18 g，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（粵）2018-0002，飼養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。本研究方案獲得廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，倫理編號(hào)：TCMF1-2021025。

1.2 藥物及試劑腸安菌泰由太子參、茯苓、白術(shù)、白芍、甘草、陳皮、防風(fēng)、木香、黃連組成，中藥飲片購(gòu)自廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，經(jīng)該院李得堂副主任中藥師鑒定為正品。匹維溴銨片，美國(guó)ABBOTT LABORATORIES LIMITED 公司，批號(hào)：714641。乙酸，天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號(hào)：1110。TRIzolTM試劑、PageRulerTM預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，美國(guó)Thermo Scientific公司，批號(hào)分別為：15596026、26616。Evo M-MLV 反轉(zhuǎn)錄試劑預(yù)混液、SYBR?Green Pro Taq HS 預(yù)混型qPCR試劑盒，AG艾科瑞生物公司，批號(hào)：AG11706、AG11701。Melatonin 抗體，英國(guó)Abbexa 公司，批號(hào)：Abx 100179；Aanat 抗體，英國(guó)Biorbyt 公司，批號(hào)：orb5712；Tryptase 抗體、抗GAPDH 抗體、抗CRY1 抗體、Phospho-IκBα抗體，美國(guó)Abcam 公司，批號(hào)分別為：ab2378、ab181602、ab104736、ab 133462；IκBα抗體、NF-κB p65 抗體、Phospho-NF-κB p65 抗體、抗兔IgG HRP偶聯(lián)抗體，美國(guó)CST 公司，批號(hào)分別為：4812、8242、3033、7074S。

1.3 儀器HERATHERM烘箱，美國(guó)Thermo Scientific公司；Nanodrop2000 超微量核酸蛋白測(cè)定儀、Quanstudio5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀，美國(guó)Thermofisher公司；CFX96 逆轉(zhuǎn)錄儀、1658004EDU 垂直電泳儀、1703930 濕轉(zhuǎn)槽、1708195 全自動(dòng)多功能凝膠成像分析儀，美國(guó)BIO-RAD 公司；80i 熒光顯微鏡、FI3 成像系統(tǒng)，日本尼康公司。

1.4 藥物制備腸安菌泰中藥飲片委托廣東一方制藥有限公司制作成腸安菌泰顆粒劑，生產(chǎn)批號(hào)：J2007002，蒸餾水稀釋至所需濃度。匹維溴銨用研缽研碎至粉狀，蒸餾水稀釋至所需濃度。

1.5 模型復(fù)制、分組及給藥方法采用母嬰分離、乙酸灌腸聯(lián)合饑飽失常的方法構(gòu)建IBS-D 小鼠疾病模型[17-19]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按性別分籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食、飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按雄雌比例1∶2進(jìn)行混居繁衍，孕鼠待產(chǎn)前單籠飼養(yǎng)，分娩后每窩子代小鼠保持在5～8 只，以仔鼠出生作為第0 天（Post-natal day 0，PD0）。以抽簽的方式隨機(jī)選取2 窩PD0 仔鼠為正常組，其余PD0 仔鼠進(jìn)行IBS-D 造模。在PD1 至PD21，對(duì)仔鼠進(jìn)行母嬰分離，分離時(shí)間為每天09∶00～13∶00。在PD21 至PD28，將幼鼠斷奶，與母鼠分開(kāi)飼養(yǎng)。在PD28至PD42，進(jìn)行乙酸灌腸和隔日喂食以模擬饑飽失常狀態(tài)。灌腸具體操作為：灌腸第1周每日取0.5%的乙酸0.5 mL注入小鼠結(jié)腸（距肛門(mén)5 cm處），保留30 s；隨后用等量生理鹽水徐徐注入，以稀釋醋酸并沖洗。灌腸第2周，乙酸濃度升高至0.8%，其余操作不變。正常對(duì)照組小鼠給予等量生理鹽水灌腸。造模結(jié)束7 d 后，進(jìn)行IBS-D 模型評(píng)價(jià)。

篩選出模型復(fù)制成功的IBS-D小鼠，稱質(zhì)量，按隨機(jī)數(shù)字法將其分成模型組、腸安菌泰組（2.457 g·kg-1）和匹維溴銨組（22.75 mg·kg-1），每組6 只，雌雄各半。藥物給藥劑量依據(jù)課題組前期實(shí)驗(yàn)給藥方案[20-21]。灌胃給藥前先將腸安菌泰藥液置于37 ℃水浴鍋中溫?zé)?。每天灌胃給藥1次，連續(xù)2周。正常組與模型組小鼠給予等容積的生理鹽水灌胃。

1.6 IBS-D 發(fā)病情況評(píng)價(jià)①糖水偏嗜實(shí)驗(yàn)（Sucrose preference test，SPT）：計(jì)算小鼠24 h 糖水偏嗜率（SP），SP（%）＝[糖水消耗量（g）/總液體消耗量（g）]×100%。②大便含水率測(cè)定（Fecal moisture content，F(xiàn)MC）和排便頻率（Fecal frequency，F(xiàn)F）：將小鼠單獨(dú)置于一個(gè)籠子中，下面放置托盤(pán)，收集1 h內(nèi)小鼠排出的糞便并稱質(zhì)量，記錄為大便濕質(zhì)量。隨后放入60 ℃烘箱中干燥24 h 后稱質(zhì)量，記錄為干質(zhì)量。糞便含水量按照《中華人民共和國(guó)藥典》水分測(cè)定烘干法測(cè)定，大便含水率=（大便濕質(zhì)量-大便干質(zhì)量）/大便濕質(zhì)量×100%。排便頻率是1 h 的糞便顆?？倲?shù)。③避水應(yīng)激實(shí)驗(yàn)（Water avoid stress，WAS）：在約60 cm×60 cm×25 cm容器底部中央用磚塊搭建一個(gè)固體平臺(tái)（6 cm×3 cm×3 cm），盆內(nèi)裝入室溫水，液面高度距離固體平臺(tái)頂端1 cm 左右，將待測(cè)小鼠單獨(dú)置于平臺(tái)上；觀察記錄1 h內(nèi)，小鼠的排便顆粒數(shù)（干便）或者次數(shù)（稀便）?？瞻捉M放于同樣的平臺(tái)上，水盆內(nèi)不加水。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）法檢測(cè)緊密連接蛋白ZO-1、Occludin、E-cadherin，生物鐘基因CRY1，炎癥因子腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素6（IL-6），褪黑素合成酶Aanat、Asmt，褪黑素受體MT1、MT2 的mRNA 表達(dá)情況評(píng)價(jià)結(jié)束后次日，對(duì)小鼠進(jìn)行頸椎脫臼處死，迅速留取小鼠的結(jié)腸組織，置于-80 ℃冰箱保存。取結(jié)腸組織加入Trizol裂解液充分研磨，提取總的RNA溶液。測(cè)濃度后，根據(jù)Evo M-MLV 反轉(zhuǎn)錄試劑預(yù)混液說(shuō)明書(shū)配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)工作液進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。再按照SYBR?Green Pro Taq HS 預(yù)混型qPCR試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行RT-qPCR 擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)以管家基因ACTB為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。所有引物均由上海捷瑞生物工程有限公司設(shè)計(jì)與合成，引物序列見(jiàn)表1。

表1 RT-qPCR 引物序列Table 1 Primer sequences for RT-qPCR

1.8 免疫組化法檢測(cè)Aanat、褪黑素Melatonin、肥大細(xì)胞類胰蛋白酶Tryptase 的蛋白表達(dá)情況結(jié)腸樣本經(jīng)固定、脫水、修剪和石蠟包埋后，切成5 μm切片。切片經(jīng)脫蠟至水、抗原修復(fù)、阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶和血清封閉后，在4 ℃環(huán)境下孵育Aanat 抗體（1∶200）、Melatonin 抗體（1∶200）、Tryptase 抗體（1∶200 000）過(guò)夜。次日在室溫條件下孵育二抗和DAB 顯色后，再用蘇木精輕度復(fù)染，最后進(jìn)行脫水，中性樹(shù)膠封片。

1.9 免疫熒光法檢測(cè)CRY1、p-IκBα、p65、p-p65的蛋白表達(dá)情況切片經(jīng)脫蠟至水、抗原修復(fù)、畫(huà)圈自發(fā)熒光淬滅和血清封閉后，在4 ℃條件下孵育CRY1（1∶1 000）、Phospho-IκBα 抗體（1∶500）、NF-κB p65 抗體（1∶1 600）和Phospho-NF-κB p65 抗體（1∶3 000）過(guò)夜。次日孵育二抗后，用DAPI避光室溫下復(fù)染細(xì)胞核，洗滌后用抗熒光淬滅封片劑封片。

1.10 蛋白免疫印跡（Western Blot，WB）法檢測(cè)IκBα、p-IκBα、p65、p-p65 的蛋白表達(dá)情況采用RIPA 法裂解小鼠結(jié)腸組織，提取總蛋白，加入蛋白上樣緩沖液，100 ℃變性10 min。取60 μg 樣品進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜和封閉后，加入GAPDH（1∶10 000）、IκBα抗體（1∶1 000）、Phospho-IκBα抗體（1∶10 000）、NF-κB p65 抗體（1∶1 000）和Phospho-NF-κB p65 抗體（1∶1 000），4 ℃孵育過(guò)夜，次日加入二抗抗兔IgG HRP偶聯(lián)抗體（1∶1 000）室溫孵育1 h，最后加入化學(xué)發(fā)光液進(jìn)行顯色。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件分析和處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，符合正態(tài)性分布且方差齊性的多組資料則進(jìn)行單因素方差分析檢驗(yàn)，組間多重比較運(yùn)用LSD 檢驗(yàn)。方差不齊時(shí)，采用Welch檢驗(yàn)，組間多重比較則采用鄧尼特T3檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腸安菌泰對(duì)IBS-D 小鼠SP、FMC、FF 和WAS的影響如表2所示，與正常組比較，模型組小鼠SP明顯降低，F(xiàn)MC、FF 和WAS 明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組比較，腸安菌泰組小鼠SP升高，F(xiàn)MC、FF和WAS均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。以上結(jié)果表明，腸安菌泰對(duì)IBS-D 小鼠的SP、FMC、FF和WAS 均有明顯的改善作用。

表2 腸安菌泰對(duì)IBS-D 小鼠SP、FMC、FF 和WAS 的影響（ ±s，n=6）Table 2 Effects of Chang’an Juntai on the SP，F(xiàn)MC，F(xiàn)F and WAS in IBS-D mice（ ±s，n=6）

表2 腸安菌泰對(duì)IBS-D 小鼠SP、FMC、FF 和WAS 的影響（ ±s，n=6）Table 2 Effects of Chang’an Juntai on the SP，F(xiàn)MC，F(xiàn)F and WAS in IBS-D mice（ ±s，n=6）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

WAS/（顆·h-1）12.000±4.195 19.833±3.545**13.833±3.430##16.500±2.665組別正常組模型組腸安菌泰組匹維溴銨組SP/%88.435±2.402 74.942±3.425**85.900±5.060##85.353±3.490##FMC/%45.912±2.568 69.420±2.497**50.195±5.114##50.404±7.231##FF/（顆·h-1）7.833±3.061 16.833±4.535**11.000±3.464#14.000±4.382

2.2 腸安菌泰對(duì)IBS-D 小鼠結(jié)腸組織緊密連接蛋白、炎癥因子、生物鐘基因和褪黑素相關(guān)指標(biāo)的mRNA 表達(dá)的影響如圖1 所示，與正常組比較，模型組小鼠ZO-1、Occludin、E-cadherin、CRY1、Aanat、Asmt、MT1 和MT2 的mRNA 表達(dá)水平均明顯降低，炎癥因子TNF-α 和IL-6 的mRNA 表達(dá)水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組比較，腸安菌泰組小鼠ZO-1、Occludin、Ecadherin、 CRY1、 Aanat、 Asmt、 MT1 和MT2 的mRNA 表達(dá)水平均升高，TNF-α 和IL-6 的mRNA 表達(dá)水平均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。由此可見(jiàn)，腸安菌泰可上調(diào)IBS-D小鼠結(jié)腸組織緊密連接蛋白、生物鐘基因和褪黑素相關(guān)指標(biāo)的mRNA表達(dá)水平，下調(diào)IBS-D小鼠結(jié)腸組織炎癥因子的mRNA表達(dá)水平。

圖1 腸安菌泰對(duì)IBS-D 小鼠結(jié)腸組織緊密連接蛋白、炎癥因子、生物鐘基因和褪黑素相關(guān)指標(biāo)的mRNA 表達(dá)的影響（ ±s，n=3）Figure 1 Effect of Chang’an Juntai on mRNA expressions of tight junction protein，inflammatory factors，biological clock gene and melatonin-related indicators in colonic tissue of IBS-D mice（ ±s，n=3）

2.3 腸安菌泰對(duì)IBS-D 小鼠結(jié)腸組織Aanat、Melatonin和Tryptase 蛋白表達(dá)的影響如圖2 所示，與正常組比較，模型組小鼠結(jié)腸組織Aanat和Melatonin蛋白表達(dá)的平均光密度值降低，Tryptase 的平均光密度值升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組比較，腸安菌泰組小鼠Aanat和Melatonin蛋白表達(dá)的平均光密度值明顯升高，Tryptase 的平均光密度值明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

圖2 腸安菌泰對(duì)IBS-D 小鼠結(jié)腸組織Aanat、Melatonin 和Tryptase 蛋白表達(dá)的影響（免疫組化，×400； ±s，n=3）Figure 2 Effect of Chang’an Juntai on the protein expressions of Aanat，Melatonin and Tryptase in the colonic tissue of IBS-D mice（ICH，×400； ±s，n=3）

2.4 腸安菌泰對(duì)IBS-D 小鼠結(jié)腸組織CRY1、p-IκBα、p65、p-p65 蛋白免疫熒光表達(dá)的影響如圖3 所示，與正常組比較，模型組小鼠結(jié)腸組織CRY1蛋白的相對(duì)熒光強(qiáng)度降低，p-IκBα 和p-p65 蛋白的相對(duì)熒光強(qiáng)度升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組比較，腸安菌泰組小鼠結(jié)腸組織CRY1蛋白相對(duì)熒光強(qiáng)度明顯升高，p-IκBα 和p-p65 蛋白相對(duì)熒光強(qiáng)度降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。各組小鼠結(jié)腸組織p65 蛋白的相對(duì)熒光強(qiáng)度變化不明顯，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。由此可見(jiàn)，腸安菌泰可上調(diào)CRY1的蛋白表達(dá)水平，抑制p-IκBα和p-p65蛋白的磷酸化。

圖3 腸安菌泰對(duì)IBS-D 小鼠生物鐘基因CRY1、p-IκBα、p65 及p-p65 蛋白表達(dá)的影響（免疫熒光，×200； ±s，n=3）Figure 3 Effect of Chang’an Juntai on the protein expressions of biological clock gene CRY1，p-IκBα，p65 and p-p65 in IBS-D mice（IF，×200； ±s，n=3）

2.5 腸安菌泰對(duì)IBS-D 小鼠IκBα、p-IκBα、p65和p-p65 蛋白免疫印跡表達(dá)的影響如圖4所示，與正常組比較，模型組小鼠p-IκBα 和p-p65 蛋白表達(dá)水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組比較，腸安菌泰組小鼠p-IκBα 和p-p65 蛋白表達(dá)水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。綜上，腸安菌泰可能通過(guò)抑制NF-κB 信號(hào)通路的激活發(fā)揮治療作用。

圖4 各組小鼠結(jié)腸組織中IκBα、p-IκBα、p65 和p-p65 蛋白的表達(dá)（ ±s，n=3）Figure 4 Bands of protein expressions of IκBα，p-IκBα，p65 and p-p65 in colonic tissues of various groups of mice（ ±s，n=3）

3 討論

腹瀉型腸易激綜合征（IBS-D）屬中醫(yī)“腹痛”“泄瀉”的范疇，其病機(jī)可總結(jié)為肝木疏泄不暢、脾土健運(yùn)失司、脾腎之陽(yáng)失于溫煦，最終導(dǎo)致該病由實(shí)轉(zhuǎn)虛，虛實(shí)夾雜。IBS-D 的臨床表現(xiàn)不僅局限于“腹痛”“腹瀉”等胃腸系統(tǒng)方面，許多患者還合并了腸外表現(xiàn)，如睡眠障礙、焦慮和抑郁等[22]。研究[23]證實(shí)，焦慮、抑郁等精神心理因素對(duì)IBS-D患者的臨床癥狀產(chǎn)生了一定的影響，而長(zhǎng)期的睡眠障礙也會(huì)在一定程度上影響到患者的焦慮情緒。中醫(yī)理論認(rèn)為，IBS-D伴有睡眠障礙問(wèn)題，主要與患者自身的氣血循環(huán)不暢、相關(guān)的臟腑功能受損、機(jī)體的陰陽(yáng)失調(diào)等因素有關(guān)。中醫(yī)治療強(qiáng)調(diào)“整體觀念”，重視各臟腑器官功能之間的相互聯(lián)系，認(rèn)為人體自身的陰陽(yáng)應(yīng)順應(yīng)天地陰陽(yáng)的晝夜節(jié)律性的消長(zhǎng)變化。IBS-D臨床癥狀反復(fù)發(fā)作，易導(dǎo)致患者氣血不和，十二正經(jīng)經(jīng)氣運(yùn)行紊亂，故其治療應(yīng)重在調(diào)節(jié)人體自身之陰陽(yáng)。

IBS-D 患者多合并一定程度的睡眠障礙[24]，這是IBS-D 患者的典型腸外表現(xiàn)[25]，也是造成IBS-D 患者晝夜節(jié)律紊亂的重要影響因素。IBS-D患者的臨床癥狀亦多受焦慮、抑郁等精神心理情志障礙的影響，長(zhǎng)期的睡眠障礙在一定程度上影響到患者的焦慮情緒[26]。有研究[27]發(fā)現(xiàn)，在睡眠剝奪小鼠模型中，生物鐘基因CRY1的表達(dá)減少，會(huì)加重血管炎癥和內(nèi)皮功能障礙，而CRY1的過(guò)表達(dá)則可有效逆轉(zhuǎn)由睡眠剝奪引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥。生物鐘基因CRY1的抗炎作用可能是通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。CRY1可抑制腺苷酸環(huán)化酶活性并下調(diào)cAMP 水平，導(dǎo)致PKA 失活，進(jìn)而阻斷p65 在S276 位點(diǎn)上的磷酸化，阻斷NF-κB 信號(hào)通路，減少其下游炎癥因子的產(chǎn)生[7]。

有臨床研究指出抑郁癥患者的IL-6、TNF-α 水平顯著高于非抑郁癥患者[28]；而在IBS-D 患者中，TNF-α 釋放水平與IBS-D 患者的焦慮癥狀呈現(xiàn)正相關(guān)[29]。本研究發(fā)現(xiàn)IBS-D小鼠腸緊密連接蛋白和生物鐘基因CRY1 表達(dá)減少，而IL-6 和TNF-α 表達(dá)增多。IBS-D患者發(fā)生腹痛、腹瀉和腸道功能障礙可能與患者的結(jié)腸黏膜存在低度炎癥、免疫激活和屏障功能受損相關(guān)[3]。IBS-D 表現(xiàn)出“低度炎癥”和“免疫激活”，引起炎癥-免疫細(xì)胞黏膜浸潤(rùn)的增加，并釋放出多種生物活性物質(zhì)和炎癥介質(zhì)（如TNF-α、IL-6、Tryptase 等），增加結(jié)腸黏膜的通透性，最終破壞結(jié)腸黏膜屏障的完整性，從而引起IBS-D癥狀的發(fā)生[4]。

褪黑素合成酶和褪黑素受體的日常表達(dá)與生物鐘基因的表達(dá)呈現(xiàn)出同步的節(jié)律性振蕩[30]。已有相關(guān)報(bào)道[31]指出褪黑素可被研究作為治療IBS-D的藥物，但其療效及其中可能發(fā)生的具體機(jī)制尚不清楚。有研究[30，32]發(fā)現(xiàn)褪黑素可改善睡眠剝奪動(dòng)物模型的腸道黏膜完整性，褪黑素的治療效益可能與加強(qiáng)腸道屏障，減少腔內(nèi)抗原與黏膜的接觸有關(guān)。NF-κB 信號(hào)通路是導(dǎo)致IBS-D的核心炎性通路，該通路通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的免疫信號(hào)途徑，調(diào)節(jié)多種炎性因子的表達(dá)，在IBS-D患者長(zhǎng)期持續(xù)存在的腸黏膜低度炎癥的病理過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[5]。

腸安菌泰由痛瀉要方、四君子湯、香連丸合方加減而成。痛瀉要方補(bǔ)脾瀉肝、祛濕止瀉，是治療腹痛、泄瀉的名方[33]；四君子湯益氣健脾，其類方加減可有效治療脾胃虛弱引起的睡眠障礙[34]；而香連丸清熱化濕、行氣止痛，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究多報(bào)道其抗炎效果顯著[35]。三者合方加減，具有疏肝止痛、健脾止瀉、調(diào)和陰陽(yáng)之功，在改善患者腹痛、腹瀉等腸道癥狀，以及由肝氣郁結(jié)、情志不暢等引起的睡眠障礙等腸外癥狀方面具有很好的臨床效果，使患者達(dá)到“陰平陽(yáng)秘”的平衡狀態(tài)。

課題組前期對(duì)腸安菌泰進(jìn)行液相色譜質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)腸安菌泰的有效成分包括黃連堿、小檗堿、巴馬汀、木蘭花堿等9 種有效成分[20-21]。這些有效成分部分對(duì)腸上皮屏障能夠起到保護(hù)作用。其中，小檗堿能夠通過(guò)下調(diào)泛素修飾酶A20 的表達(dá)負(fù)性調(diào)控TNF-α/NF-κB/MLCK 通路，從而維護(hù)腸上皮緊密連接的完整性[18]。黃連堿與巴馬汀在結(jié)腸炎以及高脂血癥模型中也被報(bào)道出能夠改善腸屏障通透性，提高緊密連接蛋白的表達(dá)[36-37]。本研究發(fā)現(xiàn)腸安菌泰治療不僅能有效改善IBS-D小鼠發(fā)病情況和上調(diào)腸黏膜屏障緊密連接蛋白的表達(dá)，還能上調(diào)CRY1，同時(shí)下調(diào)IL-6 和TNF-α 的表達(dá)水平。此外，腸安菌泰治療還能促進(jìn)褪黑素合成酶、褪黑素及受體表達(dá)，同時(shí)有效抑制NF-κB 信號(hào)通路的活化，起到降低腸道炎癥，保護(hù)腸黏膜屏障的作用。

綜上所述，腸安菌泰能調(diào)控生物鐘，并通過(guò)抑制NF-κB 信號(hào)通路保護(hù)IBS-D 小鼠的腸黏膜屏障。本實(shí)驗(yàn)從生物鐘調(diào)控的角度出發(fā)，為腸安菌泰治療IBS-D的作用機(jī)制提供了一定的實(shí)驗(yàn)研究基礎(chǔ)。由于中醫(yī)藥治療疾病具有多靶點(diǎn)，其治療作用背后更具體的機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。