王 梅 許志斌

(泰州市人民醫(yī)院1 麻醉科,2 泌尿外科,江蘇省泰州市 225300)

心搏驟停、休克、腦卒中、低血壓等均可導致腦缺血再灌注損傷。能量代謝障礙與細胞酸中毒、興奮性氨基酸毒性作用、鈣超載、氧化應激損傷、炎癥損傷和細胞凋亡等機制互為因果,構成了腦缺血再灌注損傷的級聯(lián)反應,其中,細胞凋亡是主要機制之一。酸敏感離子通道(acid-sensing ion channel,ASIC)是一類由胞外酸化激活的陽離子通道,廣泛存在于哺乳動物中樞及外周神經系統(tǒng),參與機體感覺傳遞、學習記憶、恐懼焦慮、炎癥、缺血性損傷等多種生理及病理過程,在腦缺血再灌注損傷的病理生理過程中發(fā)揮重要作用[1-4]。其中,ASIC1a對酸的敏感性較高,與腦缺血再灌注損傷關系最為密切,具有多種生理功能和重要的病理生理學意義[5]。研究表明,抑制ASIC1a可提高急性缺血再灌注損傷后心肌細胞的存活率[6]。而狼蛛毒素1(psalmotoxin 1,PcTx1)對ASIC1a的抑制效率極高[7],且在腦缺血等病理條件下,PcTx1對ASIC1a的抑制作用將增強[8]。細胞外信號調節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)家族的重要成員,在所有真核細胞中均有表達,其激活與細胞生長、分化、增殖、轉化等有關。目前研究最為廣泛的是ERK1/2,其存在于細胞漿,可被多種因子激活而發(fā)生磷酸化,隨后轉至細胞核,調節(jié)轉錄因子的活性。已有研究表明,在腦缺血性損傷中活化的ERK1/2具有神經保護作用[9]。近期有學者發(fā)現(xiàn),ERK/MAPK信號通路參與ASIC1a的激活[10]。本研究構建全腦缺血再灌注損傷大鼠模型,并給予PcTx1干預,探討ASIC1a對全腦缺血再灌注損傷大鼠海馬神經元細胞凋亡的影響及其相關機制,以期為腦缺血再灌注損傷的臨床治療提供新靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康清潔成年雄性SD大鼠180只,體重180～220 g,由西安交通大學醫(yī)學部實驗動物中心提供[許可證號:SYXK(陜)2018-001]。將大鼠飼養(yǎng)于無特定病原體級的實驗室,經檢查確認大鼠無異常行為。飼養(yǎng)環(huán)境溫度為18 ℃～26 ℃,給予標準全價顆粒飼料喂養(yǎng),不限食、不限水,適應性飼養(yǎng)1周后進行實驗。

1.2 主要試劑與藥品 Annexin Ⅴ-FITC凋亡試劑盒(珠海健康元生物醫(yī)藥有限公司,批號:FXP018),PcTx1(Alomone Labs公司,批號:RTP-100),原位細胞凋亡檢測試劑盒(Roche公司,批號:17901),DAB顯色試劑(北京中杉金橋生物技術有限公司,批號:ZLI9019),鏈霉素親和素-生物素復合物(streptavidin-biotin complex,SABC)免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司,批號:SA2005),磷酸化ERK1/2單克隆抗體(Cell Signaling Technology公司,批號:4370),多聚甲醛(上海麥克林生化科技股份有限公司,批號:P924368)。其余試劑為實驗室常用規(guī)格。

1.3 主要儀器 流式細胞儀(Becton,Dickinson and Company,型號:FACSCalibur),腦立體定位儀(徐州利華電子科技發(fā)展有限公司,型號:ZH-藍星C),石蠟切片機(Leica公司,型號:Leica-2045),計算機圖像分析系統(tǒng)(Leica公司,型號:Leica Quantiment 570),倒置顯微鏡(OLYMPUS公司,型號:BH-2)。

1.4 動物分組與建模

1.4.1 動物分組:采用隨機數(shù)字表法將180只大鼠分為假手術組、模型組、ASIC1a抑制劑組(PcTx1組),每組60只。根據(jù)再灌注時間的不同將每組再分為2 h組、6 h組、12 h組、24 h組、48 h組5個亞組,每個亞組12只。

1.4.2 建立動物模型:對模型組和PcTx1組大鼠采用經典四血管阻斷法制備全腦缺血再灌注損傷模型。通過腹腔注射10%水合氯醛(40 mg/100 g)對大鼠施行麻醉,麻醉滿意后以俯臥位固定大鼠四肢,將其頭前傾約30°,用橡皮筋拴住尾部并適度牽拉使頸椎伸直,在枕骨下平第1頸椎水平處做一正中切口,逐層分離并充分暴露第1頸椎橫突上的翼小孔,將燒紅的探針插入翼小孔,燒灼雙側椎動脈使之永久閉塞,逐層縫合皮下組織及皮膚。除不給予燒灼椎動脈外,假手術組的其他操作同其余兩組。術后單籠飼養(yǎng),保持大鼠呼吸道通暢,維持室溫在20 ℃～25 ℃,用60 W白熾燈持續(xù)照射24 h,觀察大鼠蘇醒過程。術后第2天,通過腹腔注射10%水合氯醛(40 mg/100 g)對大鼠施行麻醉,麻醉滿意后以仰臥位固定大鼠四肢,做一頸部正中切口,分離雙側頸總動脈,采用微動脈夾夾閉雙側頸總動脈6 min,夾閉1 min內大鼠如出現(xiàn)瞳孔散大、眼球蒼白、嘴唇發(fā)紺、呼吸急促等反應說明造模成功,若未出現(xiàn)上述現(xiàn)象或出現(xiàn)偏癱則認為建模不成功,將其剔除實驗。夾閉6 min后迅速松開微動脈夾恢復大鼠腦血流,然后逐層嚴密縫合皮下組織及皮膚。按上述方法分離并暴露假手術組大鼠的雙側頸總動脈,但不給予夾閉,6 min后逐層縫合皮下組織及皮膚。本研究的模型組、ASIC1a組大鼠均建模成功。術后所有大鼠單籠飼養(yǎng),飼養(yǎng)條件如前。

1.5 干預方法 再灌注后30 min,向PcTx1組大鼠側腦室注射PcTx1溶液(給藥劑量為1 ng/100 g,用無菌無酶PBS配置為濃度500 ng/mL的溶液)[11],向假手術組、模型組大鼠側腦室注射等體積無菌無酶PBS,均在5 min內分次注完藥物,留針2 min后縫合皮下組織及皮膚。術后單籠飼養(yǎng),飼養(yǎng)條件如前。側腦室注射方法:通過腹腔注射10%水合氯醛(40 mg/100 g)麻醉大鼠后,將其頭部固定于腦立體定位儀上,將微量注射器固定于腦立體定位儀的游動支架上,并記錄各標尺的坐標刻度。對大鼠頭部進行備皮消毒后做一正中切口,分離頭皮及皮下組織,暴露顱骨后用棉球擦拭及洗耳球吹干,充分暴露前囟、后囟,以前囟為標志,移動微量注射器以向左側1.2 cm、尾側0.8 cm定位,用微型鉆頭電鉆鉆一直徑約2.0 mm的小孔,下移微量注射器,當針尖貼緊硬腦膜時,記錄標尺刻度,繼續(xù)下移微量注射器約3.5 mm即達側腦室,分次緩慢注射藥物,注射時應無阻力。

1.6 觀察指標

1.6.1 流式細胞儀檢測海馬細胞凋亡率:分別于再灌注后2 h、6 h、12 h、24 h、48 h,取各亞組6只大鼠,經腹腔注射10%水合氯醛(40 mg/100 g)麻醉后處死大鼠,完整取出大鼠大腦組織并置于冰盤上,在裝有4℃ PBS的培養(yǎng)皿中分離出海馬組織,使用PBS洗去殘留血液,放入裝有4 ℃ PBS的離心管后于4℃保存?zhèn)溆?。取大鼠海馬組織并用預冷的PBS沖洗,置入研磨皿研磨1 min,銅網(wǎng)過濾除去細胞團塊,取上清液置入離心管,重復以上操作2次后以4℃、 2 000 r/min離心5 min,棄上清液,獲得海馬細胞。用預冷PBS溶液清洗細胞2次后,采用250 μL結合緩沖液重新懸浮細胞,并充分混勻,獲得單細胞懸液。將100 μL單細胞懸液加入流式管中,依次加入5 μL Annexin Ⅴ、10 μL PI溶液。室溫條件下避光孵育20 min,在1 h內上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.6.2 HE染色觀察海馬組織形態(tài)學改變及TUNEL法檢測海馬細胞凋亡指數(shù):(1)分別于再灌注后2 h、6 h、12 h、24 h、48 h,取各亞組剩余6只大鼠,經腹腔注射10%水合氯醛(40 mg/100 g)麻醉后處死大鼠,充分暴露心臟,剪開心包,用磨鈍的9號針頭從心尖部插入升主動脈,在針頭尾部連接灌注裝置,剪開右心房的同時快速灌注肝素生理鹽水250 mL,隨后將4%多聚甲醛溶液300 mL緩慢灌入直至大鼠全身僵硬。隨后撬開顱骨取出完整大腦組織,大腦組織呈瓷白色提示灌注成功。在視交叉后1 mm及視交叉后4 mm處各切取一塊冠狀面組織,將組織置于4%多聚甲醛溶液中浸泡,4℃保存3 d后制備蠟塊,然后制作厚度為5 μm的海馬組織冠狀薄片。(2)取備好的海馬組織冠狀切片行HE染色,光鏡下觀察海馬CA1區(qū)神經元的形態(tài)結構變化。(3)取備好的海馬組織冠狀切片進行脫蠟及水化,使用4%多聚甲醛溶液室溫孵育15 min后,使用PBS沖洗2次(5 min/次),滴加20 μg/mL蛋白酶K溶液100 μL后室溫孵育10 min,使用PBS沖洗5 min,使用4%多聚甲醛溶液室溫孵育5 min,使用PBS沖洗2次(5 min/次),滴加100 μL平衡緩沖液室溫孵育10 min,滴加100 μL rTdT孵育緩沖液后在37 ℃下濕盒避光孵育60 min,加入2×SSC緩沖液終止反應,室溫放置15 min后,使用PBS沖洗3次(5 min/次),采用含0.3%過氧化氫的PBS孵育5 min,使用PBS沖洗3次(5 min/次);滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉素親和素100 μL,室溫孵育30 min,使用PBS沖洗3次(5 min/次),透明、封片。在400倍光學顯微鏡下計數(shù)海馬CA1區(qū)中1/3段內及CA3區(qū)中段的TUNEL染色陽性細胞(棕黃色)數(shù)和總細胞數(shù),計算凋亡指數(shù),凋亡指數(shù)=陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

1.6.3 免疫組織化學染色法檢測磷酸化ERK1/2的表達水平:取海馬組織冠狀面石蠟切片進行脫蠟水化后,加入3.0% H2O2室溫孵育10 min,用蒸餾水沖洗5 min后,再用PBS沖洗5 min,高壓加熱法修復抗原,用PBS沖洗3次(3 min/次),滴加正常山羊血清封閉液,室溫孵育30 min,滴加磷酸化ERK1/2單克隆抗體(1 ∶100)4 ℃過夜,用PBS沖洗3次(5 min/次),滴加生物素標記的山羊抗兔IgG工作液,37℃孵育40 min,用PBS沖洗3次(5 min/次),滴加SABC,37 ℃孵育20 min,用PBS沖洗3次(5 min/次),DAB顯色,蘇木素復染,脫水、透明、封片后進行圖像采集和分析。在400倍光鏡下計數(shù)海馬CA1區(qū)中1/3段及CA3區(qū)中段的磷酸化ERK1/2染色陽性細胞(棕黃色)數(shù)和總細胞數(shù)。計算陽性細胞指數(shù)以反映磷酸化ERK1/2的表達水平,陽性細胞指數(shù)=陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

1.7 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以(x±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用Bonferroni檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 再灌注后各時間點3組大鼠海馬細胞凋亡率的比較 在再灌注后各時間點,假手術組、PcTx1組、模型組海馬細胞凋亡率依次升高(P<0.05),其中,PcTx1組、模型組海馬細胞凋亡率在再灌注24 h后達高峰,見表1、圖1。

圖1 再灌注后24 h 3組大鼠海馬細胞凋亡情況

表1 再灌注后各時間點3組大鼠海馬細胞凋亡率的比較(x±s,%)

2.2 3組大鼠海馬組織形態(tài)學改變 HE染色結果顯示,在再灌注后各時間點,假手術組大鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞共有3～4層,細胞排列整齊、緊密,邊界清,胞質淡紅,胞核藍染,高倍鏡下可見細胞核大而圓,核仁清晰,核仁數(shù)量1～2個;模型組大鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞結構被破壞,排列紊亂松散,細胞間隙增大,邊界不清,細胞大小不等、數(shù)量減少,胞核皺縮,可見凋亡小體;PcTx1組大鼠海馬CA1區(qū)的錐體細胞形態(tài)變化介于上述兩組之間,見圖2。

圖2 再灌注后12 h 3組海馬CA1區(qū)組織形態(tài)學改變(HE染色,×400)

2.3 再灌注后各時間點3組大鼠海馬細胞凋亡指數(shù)的比較 在再灌注后各時間點,假手術組中海馬CA1區(qū)及CA3區(qū)的凋亡細胞均極少,模型組、PcTx1組的凋亡指數(shù)較假手術組升高,而PcTx1組的凋亡指數(shù)較模型組降低(P<0.05),模型組、PcTx1組的細胞凋亡指數(shù)在再灌注后24 h達高峰,見表2、表3、圖3。

圖3 3組大鼠海馬CA1區(qū)及CA3區(qū)細胞凋亡情況(TUNEL染色,×400)

表2 再灌注后各時間點3組大鼠海馬CA1區(qū)細胞凋亡指數(shù)的比較(x±s,%)

表3 再灌注各時間點后3組大鼠海馬CA3區(qū)細胞凋亡指數(shù)的比較(x±s,%)

2.4 3組大鼠海馬CA1區(qū)及CA3區(qū)磷酸化ERK1/2表達水平的比較 (1)大鼠海馬CA1區(qū):在再灌注后2 h、6 h、12 h、24 h,假手術組、模型組、PcTx1組的磷酸化ERK1/2表達水平依次升高;在再灌注后48 h,PcTx1組的磷酸化ERK1/2表達水平亦高于其他兩組(P<0.05),見表4、圖4。(2)大鼠海馬CA3區(qū):在再灌注后2 h、6 h,假手術組、模型組、PcTx1組的磷酸化ERK1/2表達水平依次升高(P<0.05);在再灌注后12 h,模型組、PcTx1組的磷酸化ERK1/2表達水平高于假手術組(P<0.05);在再灌注后24 h、48 h,3組的磷酸化ERK1/2表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表5、圖4。

圖4 3組大鼠海馬CA1區(qū)及CA3區(qū)磷酸化ERK1/2表達情況(免疫組織化學染色,×400)

表4 再灌注后各時間點3組大鼠海馬CA1區(qū)磷酸化ERK1/2表達水平的比較(x±s,%)

表5 再灌注后各時間點3組大鼠海馬CA3區(qū)磷酸化ERK1/2相對表達水平的比較(x±s,%)

3 討 論

組織酸化是腦缺血性損傷的共同特征之一,pH值降低誘發(fā)ASIC電流的產生。腦組織缺血時其周圍pH值下降,ASIC1a通道被激活,引起神經元損傷,而ASIC1a阻滯劑可減輕神經元損傷[12]。PcTx1是ASIC1a特異性阻滯劑,對ASIC1a的抑制效率極高。Xiong等[13]在局部腦缺血小鼠模型中發(fā)現(xiàn),經側腦室內注射ASIC1a非特異性阻滯劑阿米洛利、特異性阻滯劑PcTx1或敲除ASIC1a基因均可顯著減少小鼠大腦梗死面積。

本研究構建全腦缺血再灌注損傷大鼠模型,并給予ASIC1a的特異性阻滯劑PcTx1進行干預。流式細胞儀檢測結果顯示,在再灌注后各時間點,假手術組、PcTx1組、模型組海馬細胞凋亡率依次升高(P<0.05);HE染色結果顯示,在再灌注后各時間點,模型組海馬CA1區(qū)錐體細胞結構破壞,排列紊亂松散,胞核皺縮,可見凋亡小體,而PcTx1組海馬CA1區(qū)錐體細胞形態(tài)結構較模型組改善;TUNEL法檢測結果顯示,在再灌注后各時間點,假手術組、PcTx1組、模型組大鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)的凋亡指數(shù)依次升高(P<0.05)。上述研究結果提示全腦缺血再灌注損傷大鼠的海馬神經元細胞凋亡現(xiàn)象明顯,而給予PcTx1干預后可減輕神經元細胞的凋亡,說明在全腦缺血再灌注損傷中ASIC1a有加重腦損傷的作用。

研究顯示,ERK活化轉變?yōu)榱姿峄疎RK可抑制心肌細胞凋亡,而給予ERK抑制劑后心肌細胞凋亡增多[14]。有學者認為,ERK1/2被激活發(fā)生磷酸化后,可抑制細胞凋亡,減輕腦缺血再灌注損傷,發(fā)揮神經保護作用[15-16]。本研究結果顯示,與假手術組相比,模型組大鼠海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)的磷酸化ERK1/2表達水平增高,磷酸化ERK1/2于再灌注后2 h即可在大鼠海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)被檢測到,其在大鼠海馬CA1區(qū)的表達水平于再灌注后12 h達高峰,于再灌注后48 h恢復至假手術組水平,而其在海馬CA3區(qū)的表達水平于再灌注后6 h達高峰,于再灌注后24 h即恢復至假手術組水平。上述結果提示海馬神經元細胞發(fā)生凋亡時,ERK1/2被激活發(fā)生磷酸化,原因可能是由于腦組織缺血時其周圍pH值下降,ASIC1a被激活,導致神經元損傷,ERK1/2信號通路代償性激活,以減輕神經元細胞凋亡,而隨著再灌注時間的延長,腦組織pH值逐漸恢復正常,ASIC1a失活,磷酸化ERK1/2的表達趨于正常。此外,在再灌注后2 h、6 h、12 h、24 h、48 h,PcTx1組大鼠海馬CA1區(qū)的磷酸化ERK1/2表達水平高于模型組,而在再灌注后2 h、6 h,其海馬CA3區(qū)的磷酸化ERK1/2表達水平也高于模型組(P<0.05),這提示給予PcTx1干預后ASIC1a受到抑制,海馬神經元細胞凋亡減少,ERK1/2信號通路進一步被激活。由此推測,在全腦缺血再灌注損傷大鼠中,ERK1/2信號通路與ASIC1a存在一定的關系:腦組織缺血再灌注后,ASIC1a被激活而引起神經元損傷的同時,磷酸化ERK1/2的神經保護作用出現(xiàn)代償性增強,而給予ASIC1a特異性阻滯劑后,可使磷酸化ERK1/2的神經保護作用進一步增強,以減少神經元凋亡。但是,ERK1/2信號通路與ASIC1a之間相互作用的具體機制還有待進一步研究和探討。

綜上所述,ASIC1a可能參與全腦缺血再灌注損傷大鼠海馬神經元細胞凋亡的發(fā)生,其特異性阻滯劑PcTx1可減輕神經元細胞凋亡,作用機制可能與促進ERK1/2磷酸化有關。