何蘇誠(chéng) 宋軍陽

（西北農(nóng)林科技大學(xué)風(fēng)景園林藝術(shù)學(xué)院 咸陽 712100）

種子休眠是指健康完整有活力的種子在適合種子萌發(fā)的條件下不能完全發(fā)芽(Oraczet al., 2016)，這是植物為了生存和繁衍，經(jīng)過長(zhǎng)期進(jìn)化形成的一種自我保護(hù)特性，這種特性由遺傳學(xué)、植物激素和環(huán)境影響因素決定(Finch-Savageet al., 2006；Nelsonet al.,2017；Tognaccaet al., 2019),對(duì)于大部分休眠的種子通?？梢酝ㄟ^激素處理和低溫層積來打破休眠(Pinfieldet al., 1990a)。

國(guó)外在種子休眠方面的研究比較早，Baskin 等（1998）把種子休眠分為生理休眠、形態(tài)休眠、形態(tài)生理休眠、物理休眠和復(fù)合休眠5 大類型。其中生理休眠又分為深度、中度、淺度，淺度生理休眠和部分中度生理休眠的種子可以通過GA3處理或者層積處理來打破種子休眠；深度生理休眠的種子自然環(huán)境下打破休眠的時(shí)間通常是幾個(gè)月甚至幾年，GA3對(duì)于這類種子往往不起作用，需要長(zhǎng)時(shí)間低溫層積才能打破休眠(Baskinet al., 1998；Baskinet al., 2004)。槭屬（Acer）絕大部分植物種子具有休眠特性，通過低溫層積，休眠種子中生長(zhǎng)抑制物質(zhì)濃度下降，生長(zhǎng)促進(jìn)物質(zhì)濃度上升(Sinskaet al., 1984)，從而促進(jìn)種子的萌發(fā)。Pinfiel等（1985）將槭屬種子休眠分為胚休眠（embryo dormancy，去除種皮，胚也不會(huì)發(fā)芽）和種皮強(qiáng)加休眠（testa-imposed，去除種皮，胚就能發(fā)芽）。通過低溫層積可以打破一些種的休眠，比如挪威楓（Acer platanoides）(Paw?owski， 2009)、 歐 亞 槭 （Acer pseudoplatanus）(Pinfieldet al., 1990a)和巴爾干楓（Acer hyrcanum）(Naseriet al., 2018)等。物理休眠是由于種皮或者果皮的不透水性阻礙種子萌發(fā)引起，如意大利楓（Acer opalus）(Gleiseret al., 2004)、 深灰槭（Acer caesium）(Phartyalet al., 2003)、茶條楓（Acer ginnala）(Vordtriedeet al., 2012)等存在種子物理休眠。

具有休眠特性的種子在休眠到萌發(fā)的過程中，種子內(nèi)多種物質(zhì)發(fā)生顯著變化，對(duì)種子休眠具有正調(diào)節(jié)或負(fù)調(diào)節(jié)的作用。部分槭屬和豆科（Leguminosae）植物在種子萌發(fā)和生長(zhǎng)過程中黃尿酸（xanthurenic acid）會(huì)分解產(chǎn)生大量尿囊素(Mothes，1961；Reinbothe，1962；Fujiharaet al., 1978)，而尿囊素能促進(jìn)一些植物種子的萌發(fā)，比如擬南芥（Arabidopsis thaliana）(Nourimandet al., 2019)，尿囊素在植物應(yīng)激保護(hù)中也發(fā)揮作用(Alamilloet al., 2010)。茉莉酸對(duì)不同植物種子具有不同的作用， 它能促進(jìn)韃靼槭（Acer tataricum）(Berestetzkyet al., 1991)、蘋果（Malus communis）(Yildizet al., 2007)和西洋梨（Pyrus communis）(Yildizet al.,2008)休眠種子的萌發(fā)，但是對(duì)蒙古黃芪（Astragalus membranaceus）(Yanget al., 2018)、 蒼耳（Xanthium pennsylvanicum）(Nojavan-Asghariet al., 1998)、向日葵（Helianthus annuus）(Corbineauet al., 1988)等具有抑制作用。脂肪酸在植物的整個(gè)生命過程中具有十分重要的作用(Fernández-Valverdeet al., 1993；Steinberget al., 2000；Fuldaet al., 2002；曹山等，2016)。2-羥基辛酸（Hydroxyoctanoic acid）能抑制中鏈酰基輔酶A 合成酶（medium chain acyl-CoA synthetase）的活性(Kasuyaet al., 1996)，從而阻礙脂肪酸參與代謝。酚類物質(zhì)對(duì)許多植物種子的萌發(fā)也具有抑制作用，如紅花琉璃草（Cynoglossum officinale）(Qiet al., 1993)、燕麥（Avena sativa）(Corbineauet al., 1986)、 普通小麥（Triticum aestivum）(Konget al., 2008)和大麥（Hordeum vulgare）(Lenoiret al., 2010)等。在歐洲油菜（Brassica napus）(Kuras，1999)和深灰槭（Acer caesium）(Phartyalet al.,2003)種子萌發(fā)的過程中大量減少或消失。

血皮槭（Acer griseum）是無患子科（Sapindaceae）(Chaseet al., 2016)槭屬落葉喬木，屬于中國(guó)特有種和瀕危種（汪松等，2004），其樹皮赭褐色，自然分布于河南西南部、陜西南部、甘肅東南部、湖北西部和四川東部海拔1 500~2 000 m 的疏林中（中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì)，1981）。血皮槭空種率高，種子有翅,堅(jiān)硬的外種皮包裹著內(nèi)種皮和胚，阻礙種子的透氣吸水；種子沒有胚乳，子葉在打破休眠之前就已經(jīng)具備基本形態(tài)，健康種子占比率僅為15.5%，且發(fā)芽率低。

目前，對(duì)血皮槭的研究主要集中在繁殖栽培技術(shù)（杜麗雁等，2005；陳麗等，2010）、生物學(xué)特征和休眠機(jī)制（張川紅等，2012；郭幸飛等，2017；孫佳偉等，2022）、資源調(diào)查（陳朋等，2013；張川紅等，2015）、分子遺傳（孫圣，2014；王佳慧，2015；葉學(xué)敏，2017；Wanget al., 2017；付其迪，2020）等方面，尚沒有關(guān)于基于代謝組學(xué)的血皮槭種子休眠的研究報(bào)道。

代謝組學(xué)可用于分析植物代謝途徑中底物和產(chǎn)物(Lisecet al., 2006；Changet al., 2012)，可檢測(cè)種子在打破休眠過程中的一些物質(zhì)變化，從分析導(dǎo)致種子休眠的內(nèi)源性物質(zhì)。本研究采用了代謝組學(xué)的分析方法，分析和鑒定與血皮槭胚休眠相關(guān)并可能調(diào)控其萌發(fā)的物質(zhì)，旨在探索和揭示血皮槭種子休眠的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用的血皮槭為野生種，采自陜西省安康市平利縣八仙鎮(zhèn)（32°09′ E，109°25′ N），采種母樹胸徑90 cm。試驗(yàn)所用的血皮槭種子分2 批采集，第1 批種子采于2018 年10 月，根據(jù)千粒質(zhì)量，測(cè)算種子總量約35 000 粒。未經(jīng)任何處理，直接播種于母樹附近約30 m2的源生地土壤中，不采取任何人工干預(yù)措施。分別于2019 年春季和秋季、2020 年春季和秋季、2021 年春季挖取播種地樣土觀察。第2 批種子采于2020 年10 月，一部分做低溫層積處理，另一部分風(fēng)干后置于4 ℃冰箱中貯藏。抑制物測(cè)定試驗(yàn)所用對(duì)照材料為小麥（Triticum aestivum）（品種為“鄭麥379”），購(gòu)于楊凌華星綠色種苗有限公司。

1.2 血皮槭種子發(fā)芽試驗(yàn)

在發(fā)芽試驗(yàn)開始前，將血皮槭種子去除種翅（同下文中的種子），用0.5% KMnO4消毒15 min，用超純水沖洗5 次。由于血皮槭單性結(jié)實(shí)的頻率較高導(dǎo)致空種率高，因此進(jìn)行漂浮處理去除空種。沙子過0.45 mm 孔徑篩后的細(xì)沙，用1% NaClO 溶液浸泡1 h消毒，再用超純水沖洗5 次，除去沙子中的氯后放置于烘箱中烘干水分。在90 mm 的玻璃培養(yǎng)皿中墊一張濾紙并加入30 g 烘干的細(xì)沙，加入15 mL 超純水作為發(fā)芽床。

試驗(yàn)采用雙因素設(shè)計(jì)（低溫層積處理和切離胚處理），切離胚處理包括去除外種皮和內(nèi)種皮，取出完整的胚，播種于發(fā)芽床中，定時(shí)噴水保持濕潤(rùn)。在低溫層積處理中，沙子濕度保持60%，定期翻攪，4 ℃儲(chǔ)存。低溫層積時(shí)間為3~12 個(gè)月，每隔1 個(gè)月取出部分種子做發(fā)芽試驗(yàn)。每個(gè)因素有2 個(gè)層次（是否低溫層積處理或切離胚處理），按以下組合進(jìn)行：1) 不層積+不切離；2) 不層積+切離胚；3) 低溫層積+不切離；4) 低溫層積+切離胚。

為了驗(yàn)證外源性激素赤霉素對(duì)血皮槭種子打破休眠的影響，筆者另外增加了2 個(gè)種子處理組合：1) 不層積+不切離+赤霉素溶液浸泡；2) 不層積+切離胚+赤霉素溶液浸泡。赤霉素溶液的質(zhì)量濃度設(shè)置了3 個(gè)梯度，分別為200、400 和800 mg·L–1。

在這些處理之后，在每個(gè)培養(yǎng)皿中用鑷子均勻地?cái)[放30 粒種子或30 個(gè)胚。將培養(yǎng)皿放入恒溫培養(yǎng)箱中，周期性光照12 h·d-1，溫度設(shè)置為27 ℃/19 ℃，空氣相對(duì)濕度90%。每2 天觀察記錄萌發(fā)情況，并及時(shí)添加超純水，保持發(fā)芽床的濕潤(rùn)，持續(xù)1 個(gè)月。當(dāng)根尖從種皮中伸出時(shí)，認(rèn)為種子已經(jīng)發(fā)芽。試驗(yàn)設(shè)3 次重復(fù)。在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，打開未發(fā)芽的種子，檢查是否為空種子或胚壞死。

式中：GE 為發(fā)芽勢(shì)；GSN10為前10 天內(nèi)正常發(fā)芽種子數(shù)；TSN 為供試種子總數(shù)；GR 為發(fā)芽率；GSN30為30天內(nèi)正常發(fā)芽種子數(shù)；GI 為發(fā)芽指數(shù)；Gt 為第t 天發(fā)芽數(shù)，Dt 為發(fā)芽的天數(shù)(d)。

1.3 抑制性物質(zhì)存在的部位

1.3.1 浸提液提取 按照種子休眠理論，血皮槭種子休眠的原因之一可能是種子里面抑制性物質(zhì)的存在導(dǎo)致種子不能萌發(fā)。為探究抑制性物質(zhì)主要存在于種子的哪個(gè)部分，筆者選取當(dāng)年休眠的血皮槭種子，把種子分解為種翅、外種皮、內(nèi)種皮和種胚4 個(gè)部分，研磨成粉末。取4 根試管，分別加入1 g 血皮槭種子各部分粉末和30 mL 超純水，充分搖勻后置于25 ℃恒溫條件下浸提72 h。將浸提好的各部分浸提液離心（12 000 r·min–1，2 min）使固液分離，取上方浸提液并用0.22 μm 濾頭過濾。

1.3.2 發(fā)芽對(duì)照試驗(yàn) 用種子4 個(gè)部分的浸提液培養(yǎng)小麥種子，測(cè)定小麥種子萌發(fā)的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率（根尖從種皮中伸出2 mm 時(shí)認(rèn)為種子已經(jīng)發(fā)芽），依此推斷抑制血皮槭種子萌發(fā)的物質(zhì)存在部位。試驗(yàn)設(shè)置4 個(gè)處理，A1 種翅浸提液，A2 外種皮浸提液，A3 內(nèi)種皮浸提液，A4 種胚浸提液，用超純水做對(duì)照（UP），每個(gè)處理（含對(duì)照）3 個(gè)生物學(xué)樣本重復(fù)。

式中: GE 為發(fā)芽勢(shì)；GSN3為前3 天內(nèi)正常發(fā)芽種子數(shù)；TSN 為供試種子總數(shù)；GR 為發(fā)芽率；GSN7為7 天內(nèi)正常發(fā)芽種子數(shù)；GI 為發(fā)芽指數(shù)；Gt 為第t 天發(fā)芽數(shù)，Dt 為發(fā)芽的天數(shù)(t)。

1.3.3 抑制物驗(yàn)證試驗(yàn) 驗(yàn)證抑制小麥種子發(fā)芽的物質(zhì)是否跟種子休眠有關(guān)，試驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)處理，A4 種胚浸提液，A5 打破休眠的種胚浸提液，用超純水做對(duì)照（UP），每個(gè)處理（含對(duì)照）3 個(gè)重復(fù)。

1.4 代謝組學(xué)分析

1.4.1 代謝物提取 將血皮槭打破休眠的種子種胚（CK）和休眠的種子種胚（T）放在冰上解凍，分別將0.5 g 樣品轉(zhuǎn)移到EP 管中，加入1 000 μL 提取液（甲醇∶乙腈∶水=2∶2∶1（V/V），含同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)混合物）。35 Hz 研磨處理4 min，在冰水浴中超聲5 min，-40 ℃靜置1 h 沉淀蛋白，然后在4 ℃、12 000 r·min–1離心15 min。上清液轉(zhuǎn)移到新鮮的2 mL LC/MS 玻璃瓶中進(jìn)行UHPLC-QE-MS 分析。生物學(xué)樣本重復(fù)3 次。質(zhì)量控制（quality control, QC）樣品的制備方法是將所有樣品的上清液混合均勻。

1.4.2 LC-MS/MS 分析 LC-MS/MS 分析采用UHPLC系統(tǒng)（Vanquish, Thermo Fisher Scientific），通過Waters ACQUITYUPL C BEH Amide（2.1 mm×100 mm, 1.7 μm）液相色譜柱對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行色譜分離。流動(dòng)相由25 mmol·L-1乙酸銨（NH4OAc）和25 mmol·L-1氫氧化銨（NH4OH）水溶液（pH9.75）（A）和乙腈（B）組成。樣品盤溫度為4 ℃，進(jìn)樣量為3 μL。

1.4.3 一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集 QE HFX 質(zhì)譜儀在采集軟件（Xcalibur, Thermo）的控制下進(jìn)行，在這種模式下，采集軟件持續(xù)評(píng)估全掃描質(zhì)譜。ESI 源條件設(shè)置為: Sheath gas flow rate: 30 Arb, Aux gas flow rate: 25 Arb, Capillary temperature: 350 ℃, Full MS resolution:60 000, MS/MS resolution: 7 500, Collision energy:10/30/60 in NCE mode, Spray voltage: 3.6 kV（正離子）或-3.2 kV（負(fù)離子）。

1.4.4 數(shù)據(jù)預(yù)處理和注釋 MS 原始數(shù)據(jù)文件（.raw）使用Proteo Wizard 轉(zhuǎn)換為mzXML 格式文件，并使用內(nèi)部程序進(jìn)行處理，該程序使用R 開發(fā)，基于XCMS，用于峰值識(shí)別、提取、對(duì)齊和積分等處理。然后與BiotreeDB（V2.1）自建二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫匹配進(jìn)行物質(zhì)注釋，算法打分的Cutoff 值設(shè)為0.3。

為了提高代謝物覆蓋率，提高檢測(cè)效果，充分了解血皮槭種子打破休眠后種胚內(nèi)代謝物的變化，筆者采用正離子（POS）和負(fù)離子（NEG）2 種模式檢測(cè)代謝物。以質(zhì)譜為基礎(chǔ)，采用QC 樣品進(jìn)行質(zhì)量控制(Dunnet al., 2011)。主成分分析（principal component analysis, PCA）采用R 語言gmodels（v2.18.1）(Warnes，2007)進(jìn)行。QC 分布越密集，結(jié)果越可靠。對(duì)于差異代謝物的分析，變量投影重要性（variable importance in projection, VIP）閾值為1。初步篩選差異豐富的代謝物，采用Student’st檢驗(yàn)，P<0.05, VIP≥1 作為鑒別這些代謝物的標(biāo)準(zhǔn)。

對(duì)于 KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）(Kanehisaet al., 2000)注釋和富集分析，已鑒定的代謝物使用KEGG Compound 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行注釋（http://www.kegg.jp/kegg/compound/）。將注釋的代謝物映射到KEGG Pathway 數(shù)據(jù)庫中（http://www.kegg.jp/kegg/pathway.html），然后將標(biāo)記有顯著調(diào)控代謝物的途徑輸入MSEA(代謝物集富集分析)，通過超幾何檢驗(yàn)獲得的P值來確定富集的意義。

利用R 進(jìn)行樣本間相關(guān)性計(jì)算，并用pheatmap（Koldeet al., 2018）繪制樣本相關(guān)性熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 血皮槭種子自然休眠特性

2018 年10 月采集的約35 000 粒種子播種在母樹附近任其自然生長(zhǎng)，筆者分別于2019 年春季和秋季、2020 年春季和秋季、2021 年春季觀察出苗情況，并選取幾個(gè)小面積樣點(diǎn)，挖取播種地樣土過篩，觀察種子情況，觀察完后隨機(jī)把種子埋回樣地。

2019 年春季觀察時(shí)發(fā)現(xiàn)有大量種子被剝開只剩外種皮，堅(jiān)硬的外種皮上有被咬過的痕跡，應(yīng)被鳥類或者蟲類所食。剝開完整的種子，沒有任何發(fā)芽跡象。2019 年秋季觀察時(shí)，原本堅(jiān)硬的種殼已經(jīng)開始變黑變軟，可以輕松剝開，種胚完好無發(fā)芽跡象。2020 年春季和秋季觀察時(shí)發(fā)現(xiàn)種子仍沒有發(fā)芽跡象，但種子腐爛率明顯提高，健康種子占比越來越少。2021 年春季（4 月初），在播種地觀測(cè)到500 多株已經(jīng)發(fā)芽出土的血皮槭幼苗。依據(jù)觀察結(jié)果，發(fā)現(xiàn)血皮槭自然休眠時(shí)間長(zhǎng)達(dá)29 個(gè)月，其種子自然出苗率大約僅有1.4%。血皮槭種子自身的限制因素加上自然環(huán)境下種子的損失率較高，制約其種群的自然更新，也使盡快保護(hù)繁育這一珍稀瀕危植物顯得尤為重要。

2.2 血皮槭種子發(fā)芽試驗(yàn)

采用雙因素設(shè)計(jì)試驗(yàn)，對(duì)血皮槭種子進(jìn)行低溫層積處理和切離胚處理，在12 個(gè)月內(nèi)的低溫層積并不能打破其種子休眠，堅(jiān)硬的外種皮可能在前期阻礙了種胚吸水，但當(dāng)?shù)蜏貙臃e至6 個(gè)月時(shí)，種子堅(jiān)硬的外種皮開始吸飽水分，可以輕松剝開。在去除種皮，切離胚培養(yǎng)的情況下，也未能實(shí)現(xiàn)種子萌發(fā)。

筆者嘗試使用不同濃度的激素配合低溫層積處理和切離胚處理來打破種子休眠，在前面雙因素試驗(yàn)的每個(gè)處理基礎(chǔ)上，增加3 種濃度的赤霉素溶液。由表1 可知，血皮槭種子不論是否經(jīng)過3~12 個(gè)月的低溫層積處理，不論是否去除內(nèi)外種皮，在恒溫培養(yǎng)箱中播種后均未能發(fā)芽；不同濃度的赤霉素溶液對(duì)其種子打破休眠也沒有影響。打開種子觀察，發(fā)現(xiàn)除了已經(jīng)壞死的，健康的種子種胚和低溫層積前并沒有太大變化。

表1 低溫層積處理、切離胚處理和不同濃度的赤霉素溶液處理對(duì)血皮槭種子打破休眠的影響①Tab. 1 Effects of low temperature stratification, embryo sectioning and different concentrations of gibberellin on the breaking of dormancy of A. griseum seeds

2.3 抑制性物質(zhì)存在的部位

血皮槭種子4 個(gè)不同部分浸提液對(duì)小麥種子萌發(fā)影響結(jié)果如圖1 和圖3 所示。A4 處理下，小麥的萌發(fā)率最低（圖1）。A1、A2、A3 這3 個(gè)處理與UP 差異不大。顯著性分析結(jié)果（圖3）表明，A4 處理與A1、A2、A3 和UP 在發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)上都存在極顯著性差異（P<0.01）；A1、A2、A3 之間沒有極顯著性差異，A1、A2、A3 與UP 也不存在極顯著性差異。由以上結(jié)果可推測(cè)，抑制血皮槭種子萌發(fā)的抑制性物質(zhì)存在于血皮槭種子的種胚中。（A1、A2 處理的小麥種子發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率反而高于對(duì)照（圖3），說明血皮槭種子的種翅和外種皮含有一些促進(jìn)種子發(fā)芽的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。

圖1 血皮槭種子4 個(gè)不同部分浸提液對(duì)小麥種子萌發(fā)的抑制作用比較Fig. 1 Comparison of inhibitory effects of four extracts from A. griseum seeds on wheat seeds germination

休眠血皮槭種子種胚浸提液明顯抑制小麥種子的萌發(fā)，由此推測(cè)抑制血皮槭種子發(fā)芽的物質(zhì)存在于種胚中。已經(jīng)打破休眠的血皮槭種子的種胚浸提液（A5）處理小麥種子，試驗(yàn)結(jié)果如圖2 和圖3 所示：A5處理的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)分別比A4（休眠種子種胚浸提液）提高了30.67%、22%和15.81%。由此可見，打破休眠后的血皮槭種子種胚中的內(nèi)源抑制物得以減少。但是A5 處理的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)仍然比超純水（UP）處理的低，這可能是試驗(yàn)所用打破休眠的血皮槭種子未完全發(fā)芽，種胚中的內(nèi)源抑制物還有余留。

2.4 代謝組學(xué)分析

2.4.1 數(shù)據(jù)質(zhì)量控制和樣本相關(guān)性熱圖 通過LCMS/MS 比較血皮槭休眠和打破休眠的種子種胚PCA檢測(cè)峰值，PCA 評(píng)分由每個(gè)條件下6 個(gè)重復(fù)樣品檢測(cè)到的所有代謝物得出。由PCA 圖（圖4）可以看出來，在正離子模式（POS）和負(fù)離子模式（NEG）下，T 和CK 相同處理聚在一起，樣本之間具有良好的重復(fù)性，QC 樣本分布較密集，說明檢測(cè)結(jié)果可靠。

圖4 質(zhì)量控制主成分分析Fig. 4 Principal component analysis (PCA) of quality control

從樣本相關(guān)性熱圖（圖5）可以看出來，在正離子模式（POS）和負(fù)離子模式（NEG）下，T 的6 個(gè)重復(fù)之間相關(guān)系數(shù)均接近1，表明試驗(yàn)組樣本間的代謝組成和豐度相似度高；CK 的6 個(gè)重復(fù)之間相關(guān)系數(shù)也均接近1，表明對(duì)照組樣本間的代謝組成和豐度相似度也較高。

圖5 樣本相關(guān)性熱圖Fig. 5 Sample correlation heat map

在正離子模式（POS）和負(fù)離子模式（NEG）下，T的6 個(gè)重復(fù)和CK 的6 個(gè)重復(fù)之間相關(guān)系數(shù)均呈下降趨勢(shì)，表明血皮槭種子打破休眠后，種胚內(nèi)的代謝組成和豐度發(fā)生了明顯變化。

2.4.2 差異代謝物分析 通過LC-MS/MS 分析比較T 和CK 的6 個(gè)重復(fù)樣本，在正離子模式（POS）下共檢測(cè)出8 384 個(gè)代謝物，負(fù)離子模式（NEG）下共檢測(cè)出7 240 個(gè)代謝物。結(jié)合正交偏最小二乘法判別分析(orthogonal partial least-squares discrimination analysis)OPLS-DA 的VIP（variable importance in projection）值和單變量統(tǒng)計(jì)分析t-testP值來篩選不同比較組間的顯著差異代謝物（圖6）(Bylesjoet al., 2006；Saccentiet al.,2014；Thevenot, 2016)，差異的閾值為：OPLS-DA 模型中VIP≥1 且t-testP<0.05。顯著差異代謝物分別為289 個(gè)和215 個(gè)，在正離子模式（POS）下，T 組相對(duì)于CK 組上調(diào)和下調(diào)的代謝物數(shù)量分別為176 個(gè)和113 個(gè)；在負(fù)離子模式（NEG）下，T 組相對(duì)于CK 組上調(diào)和下調(diào)的代謝物數(shù)量分別為159 個(gè)和56 個(gè)。

圖6 OPLS-DA 得分Fig. 6 OPLS-DA score chart

對(duì)比分析T 和CK 中的顯著差異代謝物，在代謝以及生物合成相關(guān)的KEGG 分類中顯著富集（圖7），顯著富集的通路包括不飽和脂肪酸生物合成途徑（biosynthesis of unsaturated fatty acids，ko01040）、組氨酸代謝（histidine metabolism，ko00340）、單菌素生物合成（monobactam biosynthesis，ko00261）、苯丙素的生物合成（phenylpropanoid biosynthesis，ko00940）、氨酰生物合成（aminoacyl-trna biosynthesis，ko00970）、丙氨酸，天冬氨酸，谷氨酸代謝（alanine, aspartate and glutamate metabolism，ko00250）、酪氨酸代謝（tyrosine metabolism，ko00350）、精氨酸和脯氨酸代謝（arginine and proline metabolism，ko00330）、氰基氨基酸代謝（cyanoamino acid metabolism，ko00460）、耐萬古霉素（vancomycin resistance，ko01502）、ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ABC transporters，ko02010）、D精氨酸和鳥氨酸代謝（D-arginine and Dornithine metabolism，ko00472）、泛醌等萜醌生物合成（ubiquinone and other terpenoid-quinone biosynthesis，ko00130）、 異喹啉生物堿生物合成（isoquinoline alkaloid biosynthesis，ko00950）、硫代葡萄糖苷生物合成（glucosinolate biosynthesis，ko00966）、苯丙氨酸代謝（phenylalanine metabolism，ko00360）、β-丙氨酸代謝（beta-alanine metabolism，ko00410）、碳青霉烯生物合成（carbapenem biosynthesis，ko00332）、脂肪酸生物合成（fatty acid biosynthesis， ko00061）、 丁酸代謝（butanoate metabolism，ko00650）。

圖7 KEGG 富集圈Fig. 7 KEGG enrichment cycle chart

通過二級(jí)譜圖（MS2）匹配這些顯著差異代謝物，在正離子模式（POS）下有146 個(gè)，負(fù)離子模式（NEG）下有109 個(gè)。差異倍數(shù)（|log2FC|）最大的20 個(gè)代謝物中，只有1 個(gè)在種子打破休眠后豐度增加（圖8、表2），它們主要分布在脂肪酰基（fatty acyls）和苯及其取代衍生物（benzene and substituted derivatives）這2 個(gè)分類中，占比分別為50%和15%。而通過一級(jí)譜圖（MS1），可定性一類顯著差異代謝物——酚磷酸（phenolic phosphate）。

圖8 差異倍數(shù)（|log2FC|）Top20 的代謝物聚類熱圖Fig. 8 Differences in multiples (| log2FC |) Top20 metabolites clustering heat map

表2 差異倍數(shù)（|log2FC|）Top20 的顯著差異代謝物①Tab. 2 Different multiples (|log2FC|) Top20 significant differences metabolites

與T 相比，CK 中2-羥基辛酸（hydroxyoctanoic acid）、甲基生姜酚（methylgingerol）、黃尿酸（xanthurenic acid）、反式-2-辛烯酸（trans-2-octenoic acid）、茉莉酸（jasmonic acid）、十三碳二元酸（1,11-undecanedicarboxylic acid）和香草酸甲酯（methyl vanillate）含量在各個(gè)樣本和QC 樣本中的積分定量值均為0（表2），表明其隨著種子打破休眠而大量減少或消失。差異代謝物分析結(jié)果表明，這7 種代謝物可能對(duì)血皮槭種子的休眠起到重要作用。

3 討論

新鮮血皮槭種子堅(jiān)硬的外種皮阻礙了種胚獲得外界水分，一定程度上可能抑制了種子萌發(fā)。通過種子休眠特性試驗(yàn)和發(fā)芽試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，自然狀態(tài)下的血皮槭種子打破休眠的時(shí)間至少為29 個(gè)月，加上種子空種率高，野外環(huán)境下容易被動(dòng)物取食，種子后期腐爛率上升等多因素導(dǎo)致其發(fā)芽率低，野外更新困難。在人工干預(yù)下，不論是否經(jīng)過3 個(gè)月至12 個(gè)月的低溫層積處理，不論是否去除內(nèi)外種皮，在恒溫培養(yǎng)箱中播種后均未能發(fā)芽，不同濃度的赤霉素溶液處理對(duì)打破其種子休眠也沒有影響。而當(dāng)?shù)蜏貙臃e至6 個(gè)月左右，種子原本堅(jiān)硬的外種皮便已吸飽水分并且可以輕松剝開，可見種皮障礙并不是造成其休眠的主要原因。結(jié)合Pinfield 和Dungey 對(duì)槭屬植物種子休眠的分類以及Baskin 和Baskin 的種子休眠分類標(biāo)準(zhǔn)，血皮槭種子屬于深度生理胚休眠( Pinfieldet al., 1985；Baskinet al., 1998；Baskinet al., 2004)。

有些槭屬植物種子不僅種胚含有抑制種子萌發(fā)的物質(zhì)，內(nèi)種皮或外種皮也含有抑制種子發(fā)芽的物質(zhì)，如糖槭（Acer saccharum）(Webbet al., 1969)、歐亞槭（Acer pseudoplatanus）(Webbet al., 1972)、絨毛槭（Acer velutinum）(Pinfieldet al., 1990b)和巴爾干楓（Acer hyrcanum）(Naseriet al., 2018)等。有趣的是，通過血皮槭種子抑制物測(cè)定試驗(yàn)，筆者發(fā)現(xiàn)其外種皮和內(nèi)種皮不僅沒有抑制種子發(fā)芽的物質(zhì)，相反地，經(jīng)其種翅和外種皮浸提液處理過的小麥種子平均發(fā)芽勢(shì)和平均發(fā)芽率比超純水處理的小麥種子高。這種現(xiàn)象說明血皮槭種子的種翅和外種皮中可能含有一些對(duì)種子萌發(fā)有益的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（礦質(zhì)元素），而抑制血皮槭種子發(fā)芽的物質(zhì)都存在于種胚內(nèi)。血皮槭打破休眠后的種子種胚浸提液比休眠種子種胚浸提液處理過的小麥種子發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)分別大幅提高30.67%、22%、15.81%，可見打破休眠后，血皮槭種子種胚內(nèi)的抑制物減少。為了確認(rèn)血皮槭種子種胚內(nèi)的抑制物具體是什么，筆者通過代謝組學(xué)對(duì)比分析血皮槭休眠種子種胚和打破休眠種子種胚中的差異代謝物。經(jīng)過二級(jí)譜圖（MS2）匹配到了255 個(gè)顯著差異代謝物，其中差異倍數(shù)TOP20 的顯著差異代謝物里有50%屬于脂肪?；悾?5%屬于苯及其取代衍生物類，由此筆者推測(cè)這兩類代謝物在導(dǎo)致血皮槭種子休眠中起到重要的作用。筆者篩選分析的7 種顯著差異代謝物中有4 種屬于脂肪酰基類，它們?cè)诜N子打破休眠后含量大幅減少或消失，筆者推測(cè)這些代謝物可能對(duì)血皮槭種子的萌發(fā)起主要的抑制作用（圖9）。

圖9 血皮槭種子打破休眠的模式Fig. 9 Diagram of seed breaking dormancy pattern of A. griseum

休眠的血皮槭種子種胚內(nèi)含有大量的2-羥基辛酸、甲基生姜酚、黃尿酸、反式-2-辛烯酸、茉莉酸、十三碳二元酸和香草酸甲酯，在種子打破休眠后，它們的含量在各個(gè)樣本和QC 樣本中的積分定量值均為0。2-羥基辛酸會(huì)抑制MACS 發(fā)揮作用，筆者推測(cè)在種子打破休眠后前者的大量減少讓后者得以正常發(fā)揮作用，并使脂肪酸順利參與種子的新陳代謝，促進(jìn)種子萌發(fā)。黃尿酸在植物種子打破休眠的過程中會(huì)分解形成尿囊素和尿囊酸并積累，從而促進(jìn)種子的萌發(fā)(Mothes， 1961； Reinbothe， 1962； Fujiharaet al., 1978；Nourimandet al., 2019)，血皮槭休眠種子種胚中大量的黃尿酸在打破休眠的過程中可能也經(jīng)歷了同樣的轉(zhuǎn)化。茉莉酸已被證實(shí)能抑制一些種子的萌發(fā)(Corbineauet al., 1988； Nojavan-Asghariet al., 1998；Yanget al., 2018)，它在一些植物中的抑制作用可能也同樣發(fā)揮在血皮槭種子上，在打破休眠的代謝過程中，種胚內(nèi)大量的茉莉酸轉(zhuǎn)化成了其他對(duì)種子萌發(fā)起促進(jìn)或沒有抑制作用物質(zhì)。而筆者篩選出的另外兩種脂肪酰基類顯著差異代謝物反式-2-辛烯酸和十三碳二元酸，目前尚未見其在種子休眠或者植物新陳代謝中作用的報(bào)道，筆者推測(cè)這兩者會(huì)直接或間接抑制脂肪酸參與種子的新陳代謝，從而抑制種子萌發(fā)。

甲基生姜酚和香草酸甲酯這兩種代謝物對(duì)植物種子休眠的具體影響目前尚不清楚，但兩者都屬于酚類物質(zhì)(Ishimataet al., 2016)。筆者通過一級(jí)譜圖（MS1）在顯著差異代謝物中定性到的另一種酚類物質(zhì)——酚磷酸，它們的含量在種子打破休眠后也顯著減少。酚類物質(zhì)在以往的諸多研究中已被證實(shí)能抑制多種植物種子的萌發(fā)(Qiet al., 1993；Corbineauet al., 1986；Konget al., 2008；Lenoiret al., 2010；Kuras，1999；Phartyalet al., 2003)，休眠的血皮槭種子種胚內(nèi)含有的這些大量酚類物質(zhì)可能也抑制了種子萌發(fā)。植物中最常見的誘導(dǎo)和維持種子休眠的植物激素脫落酸（ABA）以及釋放種子休眠的植物激素赤霉素（GA）和乙烯（ETH）(Finkelsteinet al., 2008；Gaoet al.,2014； Graeberet al., 2012； Holdsworthet al., 2008；Nonogaki，2014)，筆者在差異閾值為VIP≥1 且t-testP<0.05 的顯著差異代謝物中并未找到。當(dāng)筆者忽略差異閾值時(shí)，可以篩選到脫落酸（VIP<0.5，log2FC<0.9），但它是否對(duì)血皮槭的休眠具有影響還有待論證。

4 結(jié)論

血皮槭種子存在深度生理胚休眠，抑制其種子發(fā)芽的物質(zhì)存在于種胚中。種子休眠是一個(gè)復(fù)雜的生理現(xiàn)象，血皮槭種子休眠可能并非某一種或幾種物質(zhì)造成的，而是多種物質(zhì)的互作、協(xié)作或者疊加所致。2-羥基辛酸、甲基生姜酚、黃尿酸、反式-2-辛烯酸、茉莉酸、十三碳二元酸和香草酸甲酯這7 個(gè)顯著差異代謝物在血皮槭種子打破休眠后大量減少或消失，筆者推測(cè)這些物質(zhì)可能與導(dǎo)致血皮槭種子休眠密切相關(guān)，它們通過在打破休眠的過程中調(diào)控自身或者其他物質(zhì)發(fā)生作用和轉(zhuǎn)化，從而抑制或促進(jìn)血皮槭種子萌發(fā)。