＊譚新 陳迪 彭小雨 潘麗娜 李威 汪家琦

（1.湖南萬(wàn)全裕湘生物科技有限公司 湖南 411300 2.澳優(yōu)乳業(yè)（中國(guó)）有限公司 湖南 410000）

DHA甘油酯中增塑劑鄰苯二甲酸二正丁酯（DBP）的含量，是一個(gè)重要的控制指標(biāo)，DBP具有影響生殖、阻止發(fā)育等毒性[1]，由于DBP等增塑劑不會(huì)與聚合物發(fā)生化學(xué)結(jié)合，而是以自由移動(dòng)和可浸出相的形式存在，因此，DBP可能會(huì)被浸出或從封閉的材料遷移到食品和飲料中。

目前對(duì)食品中鄰苯二甲酸酯增塑劑的測(cè)定采用的是氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS），第一法是在試樣中加入氘代鄰苯二甲酸酯作為內(nèi)標(biāo)物，各類食品經(jīng)提取、凈化后進(jìn)行GC-MS測(cè)定，采用特征選擇離子監(jiān)測(cè)掃描模式（SIM），同位素內(nèi)標(biāo)法定量，第二法是采用外標(biāo)法定量；以及彭琪等[2]報(bào)道的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）法沙刺籽油中塑化劑DBP含量的測(cè)定和祝偉霞等[3]采用大氣壓化學(xué)電離-液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定油基食品中的18種鄰苯二甲酸酯類化合物等。

本文建立了電噴霧電離-HPLC-MS/MS定性定量分析DHA甘油酯中DBP的方法，并對(duì)DHA甘油酯生產(chǎn)中的各種介質(zhì)和材料中DBP的含量進(jìn)行了定量分析，探究了引起產(chǎn)品DHA甘油酯DBP含量升高的主要原因。

1.實(shí)驗(yàn)部分

（1）儀器與試劑。本實(shí)驗(yàn)所使用的主要儀器：UFLC-MS8045超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，AP124Y電子天平，日本島津公司；明杰Smart-S15UV超純水儀，湖南啟沁環(huán)保科技有限公司；KM5200FB超聲波清洗儀，昆山美美超聲儀器有限公司；TG16K-11高速離心機(jī)，長(zhǎng)沙市東旺實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；HJ-5多功能磁力攪拌器，金壇市科析儀器有限公司；DRZ-4馬弗爐，長(zhǎng)沙實(shí)驗(yàn)電爐廠；SHB-IV循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司。

實(shí)驗(yàn)所使用的主要試劑和玻璃器皿：

鄰苯二甲酸二正丁酯，99.81%，Stanford Analysis Chemicals；甲醇、乙腈，GR，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；乙醇，AR，湖南匯虹試劑有限公司；金龍魚(yú)油（1:1:1）1.8L，益海嘉里（岳陽(yáng)）糧油工業(yè)有限公司；DHA甘油酯和工藝材料等實(shí)驗(yàn)樣品，湖南萬(wàn)全裕湘生物科技有限公司。

實(shí)驗(yàn)研究中用到的容量瓶、玻璃滴管、玻璃具塞離心管、燒杯、量筒、玻璃移液管等玻璃器皿，均經(jīng)過(guò)無(wú)水乙醇清洗后，置于馬弗爐中450℃焙燒4h，消除來(lái)自實(shí)驗(yàn)、溶劑等殘留的DBP干擾。

（2）標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。使用玻璃滴管精確稱量0.0212g DBP標(biāo)準(zhǔn)品于10mL燒杯中，加入乙腈溶解后轉(zhuǎn)移至500mL容量瓶中，多次使用乙腈洗滌燒杯，將溶液轉(zhuǎn)移至500mL容量瓶中，使用乙腈稀釋，定容，配制成42.4mg/L的DBP母液，超聲10min，待用。

使用玻璃移液管移取一定體積的DBP母液，配制成濃度為21.6μg/L、43.2μg/L、86.4μg/L、216μg/L、432μg/L、648μg/L、1080μg/L、1296μg/L、1728 μg/L、2160μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行HPLC-MS/MS分析。

（3）樣品制備。使用玻璃滴管稱取約1.00g樣品于10mL玻璃離心管，加入2mL乙腈，渦旋1min，超聲提取20min，在離心機(jī)中以4000r/min的轉(zhuǎn)速離心4min，收集上清液于10mL容量瓶中。底液中加入2mL乙腈，重復(fù)提取4次，乙腈定容至刻度線，待HPLC-MS/MS分析。

（4）工藝材料處理。對(duì)DHA甘油酯生產(chǎn)工藝過(guò)程中所用到的材料，用金龍魚(yú)魚(yú)油作模擬介質(zhì)，進(jìn)行處理后得到分析樣品，以考察增塑劑DBP的帶入可能性。

①金龍魚(yú)魚(yú)油空白處理。量取6mL金龍魚(yú)油于10mL具塞玻璃離心管中，將離心管置于80℃水浴中，水浴4h。

②包裝用鋁瓶、生產(chǎn)過(guò)程中用到的膠管、濾布、墊圈、白土、溶液和酯化酶的預(yù)處理。

分別稱取一定的量，用一定量的金龍魚(yú)油浸，置于80℃水浴中，水浴4h。

③液液萃取。稱取1.00g上述處理后的魚(yú)油于10mL玻璃離心管中，加入2mL乙腈，渦旋1min，超聲提取20min，4000r/min離心4min，收集上清液。殘液中再加入2mL乙腈重復(fù)提取4次，合并上清液。將萃取溶液置于真空干燥箱，60℃濃縮至干，加入乙腈定容至2mL，待HPLC-MS/MS分析。

（5）液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜條件。液相色譜條件：Shimadzu UFLC-MS8045，配二極管陣列檢測(cè)器（DAD）；色譜柱：Shimadzu Shim-pack GIST C18（150mm×2.1mm，5μm）；流動(dòng)相：水（A）：乙腈（B），梯度洗脫程序；柱溫：40℃；流速：0.3mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：224nm；進(jìn)樣量：10μL。

質(zhì)譜條件：三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀，配電噴霧電離源（ESI），正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描（MRM）；霧化氣流量：3L/min；加熱器流量：10L/min；接口溫度：300℃；DL溫度：250℃；加熱塊溫度：400℃；干燥器流量：10L/min；檢測(cè)時(shí)間：0～15min；保留時(shí)間、離子對(duì)、碰撞能量見(jiàn)表1。

表1 質(zhì)譜保留時(shí)間、離子對(duì)、碰撞能量數(shù)據(jù)表

2.結(jié)果與討論

(1)樣品制備方法優(yōu)化

①萃取溶劑的選擇

食品中DBP的提取溶劑通常是乙腈、甲醇、正己烷、乙酸乙酯、二氯甲烷、乙醚、丙酮等?？紤]到流動(dòng)相體系，并不進(jìn)行凈化、濃縮等步驟，本實(shí)驗(yàn)考察甲醇和乙腈作為溶劑對(duì)DHA甘油酯中DBP的提取率，結(jié)果如表2所示。乙腈的提取率遠(yuǎn)高于甲醇，本實(shí)驗(yàn)選擇乙腈作為提取溶劑。

表2 甲醇和乙腈對(duì)DHA甘油酯中DBP的提取效率

②乙腈溶劑的干擾

有機(jī)溶劑中通常會(huì)存在一定量的DBP。本實(shí)驗(yàn)室考察了乙腈空白中DBP含量的影響，乙腈和濃度為4.24μg/L的DBP標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM質(zhì)譜圖如圖1所示，峰面積分別為82973和257582。因此，乙腈溶劑中DBP會(huì)對(duì)樣品中DBP的定量造成一定的干擾，本實(shí)驗(yàn)為了降低空白DBP的干擾，僅做最低限度的樣品處理，并控制所有樣品和標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣體積為10μL，穩(wěn)定空白值。

圖1 乙腈空白和DBP標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM色譜圖

圖2 塑料移液管的干擾

③萃取次數(shù)的選擇

液液萃取是利用物質(zhì)在兩種互不相溶或微溶的溶劑中溶解度或分配系數(shù)不同，是物質(zhì)從一種溶劑轉(zhuǎn)移至另外一種溶劑中。經(jīng)過(guò)多次萃取，將大部分物質(zhì)提取出來(lái)。本實(shí)驗(yàn)考察了乙腈不同萃取次數(shù)對(duì)低DBP含量（A3）和高DBP含量（A4）的DHA甘油酯的影響，結(jié)果如圖3所示。經(jīng)過(guò)3次萃取，DHA甘油酯樣品中大部分DBP被萃取出來(lái)，低含量的樣品中DBP被完全萃取?？紤]到有高含量的樣品存在，為提高數(shù)據(jù)可靠性，本實(shí)驗(yàn)選擇乙腈液液萃取5次。

圖3 乙腈萃取次數(shù)對(duì)DBP萃取率的影響

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍和檢出限。本方法采用外標(biāo)法定量，依據(jù)檢測(cè)樣品響應(yīng)值，配制一系列DBP標(biāo)準(zhǔn)樣品，按照優(yōu)化后色譜-質(zhì)譜條件進(jìn)行MRM檢測(cè)，以DBP標(biāo)準(zhǔn)品濃度（x，μg/L）對(duì)DBP響應(yīng)峰面積（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4。取DBP標(biāo)準(zhǔn)樣品逐級(jí)稀釋，按照3倍信噪比（S/N）和10倍信噪比，測(cè)定方法的DBP定性限和定量限。方法的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、定性限和定量限見(jiàn)表3。

圖4 DBP的標(biāo)準(zhǔn)曲線

表3 方法的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、定性限和定量限

（3）加標(biāo)回收率和方法精密度。量取一定體積的DBP母液稀釋成5.0880mg/L的DBP標(biāo)準(zhǔn)溶液，作為加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)溶液。精確稱取3份1.0000g已知DBP濃度的DHA甘油酯樣品于10mL玻璃離心管中，向3份樣品中分別加入5.0880mg/L的DBP標(biāo)準(zhǔn)溶液0.05mL、0.10mL、0.15mL，根據(jù)樣品制備步驟和HPLCMS/MS方法測(cè)定DBP含量，每個(gè)添加水平重復(fù)6次進(jìn)樣檢測(cè)，計(jì)算加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

（4）樣品中DBP的測(cè)定。根據(jù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化樣品制備方法和工藝材料處理方法和色譜-質(zhì)譜條件，對(duì)2個(gè)工藝中間樣品、2個(gè)酯化物樣品、7個(gè)DHA甘油酯樣品進(jìn)行DBP檢測(cè)。在排查和處理引起DBP遷移的材料，最終DHA甘油酯產(chǎn)品的DBP含量降至0.11mg/kg以下，低于我國(guó)食品中DBP允許最大殘留量為0.3mg/kg的規(guī)定。

通過(guò)模擬實(shí)驗(yàn)，對(duì)工藝材料進(jìn)行DBP遷移率探究，找到了引起DHA甘油酯樣品中DBP含量升高的主要原因。

3.結(jié)論

（1）建立了DHA甘油酯中增塑劑鄰苯二甲酸二正丁酯（DBP）的RP-HPLC-MS/MS定性定量分析方法。使用乙腈液液萃取提取樣品中的DBP，經(jīng)液相色譜分離，正離子模式下多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描（MRM）檢測(cè)，外標(biāo)法定量。液相色譜條件如下：ShimadzuUFLC-MS8045，配二極管陣列檢測(cè)器（DAD）；色譜柱：ShimadzuGISTC18（140mm×2.1mm，5μm）；流動(dòng)相：水（A）：乙腈（B），梯度洗脫；柱溫：40℃；流速：0.3mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：224nm；進(jìn)樣量：10μL。MRM質(zhì)譜條件如下：三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀，配ESI電離源，正離子多反應(yīng)檢測(cè)掃描（MRM）；霧化氣流量：3L/min；加熱器流量：10L/min；接口溫度：300℃；DL溫度：250℃；加熱塊溫度：400℃；干燥器流量：10L/min；檢測(cè)時(shí)間：0～15min。該方法建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性范圍為21.6～2160μg/L，線性相關(guān)系數(shù)為0.9994，定性限為0.18μg/L，定量限為0.59μg/L，標(biāo)準(zhǔn)加標(biāo)回收率為86.31%～114.08%，RSD為1.70%～6.10%，滿足本實(shí)驗(yàn)的DBP定量分析需求。

（2）使用本分析方法對(duì)10種樣品和29種工藝材料中DBP進(jìn)行定量分析，發(fā)現(xiàn)了引起產(chǎn)品DBP升高的原因，經(jīng)過(guò)改進(jìn)工藝，使最終DHA甘油酯產(chǎn)品中DBP含量低于0.11mg/kg，符合我國(guó)食品安全規(guī)定食品中DBP允許最大殘留量0.3mg/kg，分析方法對(duì)指導(dǎo)工藝生產(chǎn)具有重要意義。