甄利波，王靜，劉立賓，孫亞萍，王慧杰，莫婷

聯合應用Xpert MTB/RIF、SAT-TB及MTB/NTM PCR方法檢測支氣管肺泡灌洗液對痰涂陰性肺結核的快速診斷價值

甄利波，王靜，劉立賓，孫亞萍，王慧杰，莫婷

浙江大學醫(yī)學院附屬杭州市胸科醫(yī)院（杭州市紅十字會醫(yī)院）結核內科及結核實驗室，浙江杭州 310003

評估聯合應用多色巢式熒光定量PCR（Xpert mycobacterium tuberculosis and rifampicin sensitivity test，Xpert MTB/RIF）、RNA恒溫擴增實時熒光檢測（simultaneous amplification and testing of tuberculosis，SAT‐TB）、熒光探針分枝桿菌核酸檢測（mycobacterium tuberculosis/non-mycobacterium tuberculosis polymerase chain reaction，MTB/NTM PCR）3種方法檢測疑診肺結核患者的支氣管肺泡灌洗液標本對痰涂陰性肺結核的快速診斷價值。采集2019年10月至2021年9月杭州市紅十字會醫(yī)院收治的痰涂片至少3次陰性的疑診肺結核的898例患者支氣管肺泡灌洗液，以MIGT960液體培養(yǎng)陽性為金標準，評估Xpert MTB/RIF、SAT-TB及TB/NTM PCR在檢出MTB感染、耐藥結核感染以及NTM感染中的快速診斷價值。在對MTB的檢出效能方面，Xpert MTB/RIF、SAT-TB及TB/NTM PCR對MTB的檢出率分別為87.24%、80.73%、88.02%，3者均達到80%以上，其中SAT-TB的檢出率最低，其余兩者相當，差異有統計學意義（<0.001）。而3者組合的平行試驗對MTB的檢出率最高達97.14%，差異有統計學意義（<0.001）。在對耐藥結核的檢出效能方面，MIGT960液體培養(yǎng)及Xpert MTB/RIF分別檢出8.59%及10.94%的耐藥結核，雖Xpert較高，但差異無統計學意義（=0.122）；而兩者組合的平行試驗可以檢出12.24%的耐藥結核，顯著高于單用Xpert的效能（=0.019）。在對NTM的檢出方面，MIGT960液體培養(yǎng)（14.03%）高于NTM-DNA（8.24%），差異有統計學意義（<0.001），兩者組合的平行試驗的檢出率更高（14.48%）。與傳統細菌學檢測方法相比，聯合使用Xpert MTB/RIF、SAT-TB及MTB/NTM PCR可以快速、敏感地檢測出痰涂陰性疑診肺結核患者支氣管肺泡灌洗液標本中的結核核酸，同步檢出耐藥，還同時可以鑒別MTB與NTM，縮短了確診時間，給疑診肺結核患者的早期快速診斷提供了有效的實驗室方案，值得臨床推廣應用。

核酸擴增；結核分枝桿菌；非結核分枝桿菌；支氣管肺泡灌洗液；診斷效能

結核病仍然是我國面臨的重大公共衛(wèi)生問題，世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）《全球結核病報告2022》[1]指出，我國仍然是全球22個結核病高負擔國家之一，無論是新發(fā)病例數還是患病總人數仍居全球第2位，現有結核病患者約100萬，每年死于結核病的患者約20萬人，給我國經濟和社會發(fā)展帶來巨大負擔。尤其是在新冠病毒感染此起彼伏的影響下，結核病疫情的防控局面仍受到嚴峻挑戰(zhàn)[2]。WHO在2016—2035年的工作計劃中指出，2025年結核病死亡率應在2015年的基礎上下降75%，2035年下降95%；結核病發(fā)病率分別下降50%和90%[3]。要實現這一目標目前面臨的困難很多，如2022年新發(fā)現的結核病患者中，估計被發(fā)現和報告的僅為67%左右[4]；要達到全球終止結核病的目標，需要在診斷方法和發(fā)現策略方面采取更有效的措施。在結核病的傳播研究方面，我國結核病的傳播以近期傳播為主；感染北京基因型菌株和耐多藥菌株是導致近期傳播的危險因素；而1/3的近期傳播是由涂陰培陽結核病患者所致[5]。國外研究也表明，痰涂陰性肺結核的接觸者被感染的概率為7.3%～21.0%[6]，因此，如何提高涂陰肺結核的診斷發(fā)現率，做到早期發(fā)現、早期治療，對及時截斷傳播途徑，減少播散，并最終消滅結核病具有重要意義[7]。

核酸擴增檢測技術聯合支氣管鏡下肺泡灌洗術，兩者相輔相成，相對于傳統的培養(yǎng)及涂片檢測方法，縮短了檢測周期，具有高靈敏度和準確度，已成為肺部感染病原體檢測的有效工具[8]。本研究前期聯合使用兩種分子檢測手段檢測早期痰涂陰性肺結核患者的支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF），取得了較好的臨床效果[9]，所以進一步研究支氣管鏡下靶向感染局部的支氣管肺泡灌洗術聯合多種分子生物學手段的檢測在痰涂陰性肺結核的早期診斷中具有重要的臨床意義[10]。本研究收集痰涂陰性疑診肺結核患者的BALF標本，使用多色巢式熒光定量PCR（Xpert mycobacterium tuberculosis and rifampicin sensitivity test，Xpert MTB/RIF）、RNA恒溫擴增實時熒光檢測（simultaneous amplification and testing of tuberculosis，SAT-TB）及熒光探針分枝桿菌核酸檢測（mycobacterium tuberculosis/non- mycobacterium tuberculosis polymerase chain reaction，MTB/NTM PCR）3種不同類型靶標核酸檢測方法實行聯合檢測，評估單一方法及3者任一陽性的平行試驗對痰涂陰性肺結核的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年10月至2021年9月在杭州市紅十字會醫(yī)院結核病診療中心及呼吸科就診疑診為肺結核的898例患者作為研究對象。納入標準：①年齡>12周歲；②肺部影像學提示“活動性肺結核”；③至少3次鏡檢抗酸桿菌痰涂片陰性者（簡稱“涂陰”）；④可耐受支氣管鏡下支氣管肺泡灌洗術；⑤患者及家屬同意本研究并簽署知情同意書。排除標準：①合并意識障礙、精神性疾病者；②合并嚴重心、肝、腎等器官功能不全者；③合并顏面部外傷后、畸形，或鼻咽、口咽手術等不適合行支氣管鏡檢查者；④嚴重凝血功能異常，或血流動力學不穩(wěn)定需使用血管活性藥物者。所有患者均完成電子支氣管鏡下支氣管肺泡灌洗術，BALF使用美國BD公司BactecMGIT 960專業(yè)分枝桿菌快速培養(yǎng)、鑒定和藥敏實驗系統培養(yǎng)提示分枝桿菌生長的疑診肺結核患者898例，其中培養(yǎng)提示NTM為130例，耐多藥肺結核66例，其余702例均為敏感肺結核。男535例，女363例，年齡（44.32±12.56）歲。本研究經杭州市紅十字會醫(yī)院倫理委員會批準（倫理審批號：2018研審第235號），并獲得患者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 支氣管鏡檢查 患者空腹下接受局部麻醉或靜吸復合麻醉下經鼻或經口電子支氣管鏡下常規(guī)檢查術。

1.2.2 BALF標本采集 結合患者胸部CT表現，支氣管鏡頭端吸引孔道靶向病灶局部支氣管末端，抵住末端管口，經孔道注入生理鹽水10～15ml入遠端肺泡組織，靜置5s后經孔道負壓吸引，收集BALF 5～10ml。

1.2.3 樣本液化處理和菌體富集 取5ml以上的BALF標本，視BALF清濁程度加入0.5%N‐乙酰‐L‐半胱氨酸（NALC）‐NaOH處理液漩渦震蕩混勻（液化時間不能超過5min），離心得沉渣后采用6.8% PBS洗滌后分別進行抗酸染色、Bactec‐MGIT960結核分枝桿菌快速培養(yǎng)、DNA及RNA提取。

1.2.4 萋尼氏抗酸染色 按照結核病診斷實驗室檢驗規(guī)程進行[9]。

1.2.5 Bactec MGIT 960結核分枝桿菌快速培養(yǎng) 按照試劑盒說明書進行（批號20190110和20205810等）。

1.2.6 菌型鑒定 采用德國HAIN Lifescience的The GenoType system 鑒定（簡稱HAIN試驗），按照試劑盒說明書進行（批號20191020）。

1.2.7 MTB/NTM PCR檢測 采用分枝桿菌（MTB/ NTM）核酸檢測試劑盒（PCR‐熒光探針法），購自凱杰生物工程（深圳）有限公司，按照試劑盒說明書進行（批號 20191104和 20201511等）。

1.2.8 RNA恒溫擴增實時檢測 采用結核分枝桿菌（，TB）核酸檢測試劑盒（RNA恒溫擴增），購自上海仁度公司，按照試劑盒說明書進行（批號 20192015和20201591等）。

1.2.9 多色巢式熒光定量PCR（Xpert MTB/RIF）檢測 采用賽沛公司GeneXpert分子診斷系統，標本使用2:1的試劑進行液化和滅活，然后轉入試驗盒中，然后插入MTB/RIF試驗臺，由設備自動進行標本的濾過和清洗、超聲溶解、DNA釋放，并在整合反應管里自動進行巢式實時擴增和檢測，并自動生成檢測結果。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 3種檢測方法對痰涂陰性患者BALF中MTB檢出效果分析

剔除NTM后，對液體快速培養(yǎng)提示結核分枝桿菌陽性768例患者BALF的檢測方面，Xpert MTB/RIF、SAT-TB、MTB/NTM-PCR 3種方法檢測陽性例數分別為670例、620例、676例，檢出率分別為87.24%、80.73%、88.02%，差異無統計學意義（>0.05）。3者同時為陽性的檢出例數為562例，陽性率為73.18%。如果把3者組合為一個平行試驗，即同一患者的BALF標本3種檢測方法中任一陽即認定為陽性，以此作為標準其陽性病例檢出數為746例，陽性率為97.14%，顯著高于3種方法單一使用的檢出效能（<0.001）。SAT-TB+Xpert MTB/RIF雙陽、SAT-TB+MTB/NTM-PCR雙陽的檢出的病例數分別為578例、620例，檢出率分別為75.26%、80.73%，后者的檢出率顯著高于前者，（=0.010），見表１。

表1 3種檢測方法對BALF中MTB檢出效果分析[n（%），n=768]

注：與Xpert及PCR比較，*<0.001；與SAT+Xpert雙陽比較，#=0.010

2.2 Xpert MTB/RIF與MGIT 960對痰涂陰性患者BALF耐利福平結核菌（RR-TB）檢出效果比較

BALF標本培養(yǎng)提示結核分枝桿菌陽性768例患者中，MGIT 960提示耐多藥肺結核66例，耐多藥檢出率8.59%，其中，Xpert同步提示利福平耐藥者56例，陽性率為84.85%。768例患者中，Xpert提示利福平耐藥者84例，陽性率為10.94%，同步MGIT 960檢出56例，陽性率為66.67%。Xpert MTB/RIF檢測RR-TB的敏感度為66.67%（95%：59.61～72.45），特異性為98.54%（95%：93.65～98.89）。而兩者聯用檢出耐藥共計94例，耐藥檢出率為12.24%。同時還發(fā)現，768例患者中，Xpert提示利福平耐藥且DNA陽性者78例，陽性率為10.10%，高于培養(yǎng)耐藥檢出率，見表2、3。

表2 Xpert MTB/RIF與MGIT 960對BALF中MTB耐藥情況檢出效果分析

表3 3種檢測方法對BALF中MTB耐藥情況檢出效果分析[n（%），n=768]

注：與培養(yǎng)耐藥比較，*=0.122，#=0.019

2.3 MTB/NTM-PCR與液體快速培養(yǎng)在NTM檢出方面的效果分析

因為TB/NTM-PCR同時整合了結核分枝桿菌（MTB）及NTM的特異性探針，所以可以鑒別MTB與NTM，若是MTB-DNA陽性同時NTM-DNA陰性，則明確為MTB感染；而MTB-DNA陰性同時NTM-DNA陽性，則明確為NTM感染。本研究中，在培養(yǎng)提示NTM的126份BALF標本中，NTM-DNA檢出陽性70例，檢出率為55.56%，檢出率并不高，尚不能滿足臨床對于快速診斷NTM肺病的需要。NTM-DNA檢出陽性的74例標本中，同步培養(yǎng)提示NTM者達到70例，培養(yǎng)檢出率為94.59%。960快速培養(yǎng)聯合NTM-DNA共計檢出NTM130例，在898份BALF樣本中總體檢出率為14.48%，見表4。

表4 MTB/NTM PCR聯合Bactec MGIT 960快速培養(yǎng)在NTM檢出方面的效果分析[n（%）]

注：與PCR比較，*<0.001

3 討論

我國作為全球結核病疫情第二大國，一直存在結核病的早期檢出率不高，診斷治療不及時的問題，并帶來耐藥結核檢測率及治療率低的問題[10-11]，不利于結核病疫情的防控，也給經濟社會帶來巨大負擔。隨著常規(guī)肺部影像篩查方法的日漸普及，早期痰涂陰性肺結核的檢出率越來越高，但痰涂陰性肺結核的確診比較困難，普通痰涂片病原學檢測的敏感度、陽性率太低，培養(yǎng)的周期較長，均不能滿足臨床開展病原診斷精準、快速的需求。所以在縣級及以上醫(yī)療機構針對疑診肺結核患者開展支氣管鏡下BALF進行MTB核酸的檢測開展得越來越普遍。

結核病臨床及實驗室應用較多的檢測項目包括基于DNA的Xpert MTB/RIF、MTB/NTM PCR，以及基于RNA的SAT-TB，3者無論是從技術原理還是臨床應用上均有一定差異。

基于熒光定量PCR的Xpert MTB/RIF檢測系統，為一整套全自動的結核分枝桿菌分子診斷系統，人工加樣后系統可以在2h內自動完成MTB的分子鑒定及利福平耐藥性的檢測，最低檢測限約為131CFU/ml，敏感度和固體培養(yǎng)接近，特異性接近100%，操作簡單、安全，對實驗室條件要求不高，還可以同時檢測利福平耐藥基因位點突變，是2010年到目前為止WHO強烈推薦用于結核和利福平耐藥的快速診斷技術[12]。由于其對實驗室清潔度要求不高，在縣級醫(yī)院的普通細菌實驗室就可以實現，可以極大方便偏遠地區(qū)肺結核患者的快速診斷需求。本研究發(fā)現Xpert MTB/RIF檢測BALF標本總體陽性率達到87.24%，利福平耐藥肺結核檢出陽性率為10.94%，比培養(yǎng)檢出耐藥率8.59%要高。且Xpert MTB/RIF檢測24h出結果，快速診斷價值更高。兩者聯用對于耐藥肺結核檢出共計94例，耐藥檢出率為12.24%，這與世衛(wèi)組織對我國預估耐藥率的水平相當[1]，說明聯合使用Xpert MTB/RIF和960液體快速培養(yǎng)對于早期快速檢出耐多藥肺結核意義重大。

但是基于DNA的檢測方法有不足之處，即無法區(qū)分死菌與活菌、不能區(qū)分活動性結核與非活動性結核，因為基于我國的國情，有規(guī)范抗結核治療史的非活動性肺結核患者有一個龐大的人群，這給基于DNA檢測方法的解讀帶來了極大的挑戰(zhàn)。且DNA標本之間容易交叉污染，一旦污染又難以消除，這一方面，可以提示病原轉錄活性RNA可以彌補。

SAT‐TB技術是建立在RNA恒溫擴增技術和實時熒光檢測技術基礎上的檢測技術，是以MTB特異的16S rRNA為檢測靶標，通過恒溫RNA擴增技術擴增靶標片段，從而快速準確地判斷待檢樣本中是否有MTB活菌的存在。在《肺結核活動性判斷規(guī)范及臨床應用專家共識》[13]中，強烈推薦使用基于RNA的SAT‐TB等檢測技術來判定肺結核活動性。本研究中因為納入的均為培養(yǎng)陽性的病例，故無法體現RNA診斷活動性肺結核的優(yōu)越性，但在活動性肺結核的檢出方面優(yōu)勢明顯，768例活動性肺結核患者中，SAT-TB檢出676例，檢出率為88.02%，對于快速診斷活動性肺結核價值巨大，與既往的研究也類似[14]。借助于SAT-TB區(qū)分死菌和活菌的特點，有利于肺結核治療療效的監(jiān)測和輔助判愈，為治療方案提供參考，減少過度醫(yī)療，也比培養(yǎng)法更有時效性，更具有快速診斷價值。同時，聯合使用Xpert MTB/RIF既可以明確肺結核活動性，又可以明確利福平耐藥情況，兩者雙陽病例578例，檢出率為75.26%，對于臨床的診斷價值也較高。

MTB/NTM PCR檢測同時整合了MTB與NTM的DNA靶點，對于疑診肺結核并需要鑒別NTM肺病的患者有較大價值。本研究中，MTB-DNA陽性者620例，檢出率為80.73%，與培養(yǎng)的符合率100%，與既往研究結果基本一致[14]，可見MTB/NTM PCR對MTB感染的檢出效果較為理想，具有較好的快速診斷價值。在對NTM感染的檢出方面，在培養(yǎng)提示NTM的126份BALF標本中，NTM-DNA檢出陽性70例，檢出率為55.56%，檢出率并不高，尚不能滿足臨床對于快速診斷NTM肺病的需要。NTM-DNA檢出陽性的74例標本中，同時培養(yǎng)提示NTM者達到70例，培養(yǎng)檢出率為94.59%，提示960快速培養(yǎng)在NTM的檢出方面較為優(yōu)秀。960快速培養(yǎng)聯合NTM-DNA共計檢出NTM 130例，在898份BALF樣本中總體檢出率為14.48%，與其他研究相仿[15]。另外，NTM-DNA陽性標本可以直接加做熔解曲線或基因分型從而在24h內鑒定出NTM菌種，為早期快速制定抗NTM治療方案提供依據。由于臨床致病的大部分NTM在960快速液體培養(yǎng)系統中生長速度較MTB顯著增快，所以聯合使用NTM-DNA和快速液體培養(yǎng)系統在NTM肺病的診斷中具有顯著優(yōu)勢。同時，MTB-DNA陽性者可在48h內完善熔解曲線耐藥基因檢測，同時明確異煙肼、利福平、氟喹諾酮類藥物的耐藥情況，有利于快速制定耐多藥治療方案，減少住院時間，減輕患者負擔及醫(yī)保負擔，也有利于減少耐多藥肺結核患者的社會面暴露時間，對于耐多藥肺結核疫情的防控至關重要。

在Xpert MTB/RIF、SAT-TB及MTB/NTM PCR 3種方法組合使用的平行試驗中，3者任一陽性即認定為陽，共計檢出MTB感染746例，檢出率為97.14%。可見SAT-TB、MTB/NTM PCR、Xpert MTB/RIF 組合使用的平行試驗的陽性率最高，與快速培養(yǎng)的金標準相比較也幾乎能完全覆蓋，充分體現了聯合使用3種方法檢測BALF對于快速診斷痰涂陰性肺結核患者的臨床價值。

當然，本研究的研究設計存在一定局限，未納入排除結核的患者進行統計和討論，這樣就無法進行各種方法的特異性和敏感度的精確統計和研究。本研究結果證明，支氣管鏡下肺泡灌洗術聯合3種方法聯合檢測，對不能開展結核分枝桿菌快速培養(yǎng)、NTM 鑒定的醫(yī)院或非結核病專業(yè)的呼吸科醫(yī)生而言，在結核病的快速精準診斷、耐多藥肺結核的快速早期檢出、NTM肺病的精準診療中的巨大價值應該引起足夠重視。

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Value of Xpert MTB/RIF, RNA isothermal amplification real‐time testing and MTB/NTM PCR combined with detection of bronchoalveolar lavage fluid in rapid diagnosis of sputum smear‐negative pulmonary tuberculosis

Department of Tuberculosis and Tuberculosis Laboratory, Affiliated Hangzhou Chest Hospital, Zhejiang University School of Medicine (Hangzhou Red Cross Hospital), Hangzhou 310003, Zhejiang, China

To evaluate the value in detection of bronchoalveolar lavage fluid with Xpert mycobacterium tuberculosis and rifampicin sensitivity test (Xpert MTB/RIF), RNA simultaneous amplification and testing of tuberculosis (SAT-TB) and mycobacterium tuberculosis/non-mycobacterium tuberculosis polymerase chain reaction (MTB/NTM PCR) combined in diagnosis of sputum smear‐negative pulmonary tuberculosis.From October 2019 to September 2021, the bronchoalveolar lavage fluid specimens were collected from patients with suspected pulmonary tuberculosis who were tested negative for sputum smear for at least 3 times, With Bactec MGIT 960 culture set as the golden standard, rapid diagnostic value of Xpert MTB/RIF combined with SAT‐TB and MTB/NTM PCR in testing MTB infection, drug-resistant TB infection, and NTM infection were evaluated and compared with single Xpert MTB/RIF, SAT-TB and MTB/NTM PCR.A total of 898 cases were positive cultured with Bactec MGIT 960 system, 130 specimens were NTM, others were MTB. In the detection of tuberculosis, Xpert MTB/RIF, SAT-TB and MTB/NTM PCR could detect 670 specimens, 620 specimens and 676 specimens respectively, detection rate were 87.24%, 80.73% and 88.02% respectively; there was no significant difference in the value of diagnosis between the single detection of Xpert MTB/RIF and MTB/NTM PCR; the detection rate of SAT-TB was significantly lower than other two (<0.001), detection rate of 3 combined parallel test (single positive) was significantly higher than Xpert or MTB/NTM PCR (<0.001).As compared with traditional bacteriological detection, using Xpert MTB/RIF, SAT-TB and MTB/NTM PCR in combination is rapid and sensitive in diagnosis of sputum‐negative drug-sensitive and -resistance pulmonary tuberculosis and can discriminate from MTB to NTM, shorten the diagnosis time, raise the accuracy, and offer an effective auxiliary mean for diagnosis of the sputum smear‐negative pulmonary tuberculosis, and it is worthy to be promoted in hospital.

Nucleic acid amplification; Mycobacterium tuberculosis; Nontuberculosis mycobacteria; Bronchoalveolar lavage fluid; Diagnostic efficiency

R651.15

A

10.3969/j.issn.1673-9701.2023.26.001

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計劃項目（2023KY968）；杭州市衛(wèi)生科技計劃項目（0020190112）

甄利波，電子信箱：zhenlibodoctor@163.com

（2023–02–01）

（2023–08–27）