張萬(wàn)巧 閆 磊 朱麗娜 馬秀偉

中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院第七醫(yī)學(xué)中心兒科醫(yī)學(xué)部 1.兒科研究所，2.兒內(nèi)科，3.出生缺陷防控關(guān)鍵技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，4.兒童器官功能衰竭北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（北京 100700）

基于串聯(lián)質(zhì)譜（tandem mass spectrometry，MS/MS）的?；鈮A分析可用于輔助診斷有機(jī)酸血癥、脂肪酸氧化異常等多種遺傳代謝病[1]（inherited metabolic diseases，IMD）。參與支鏈氨基酸及奇數(shù)碳脂肪酸代謝的多種羧化酶功能障礙導(dǎo)致體內(nèi)3 羥基異戊酰輔酶A 和3 羥基2 甲基丁酰輔酶A 的累積，二者通過肉堿酰基轉(zhuǎn)移酶酯化為3 羥基異戊酰肉堿（3-hydroxyisovalerylcarnitine，C5OH）[2]。據(jù)報(bào)道C5OH 是篩查多種羧化酶缺乏（multiple carboxylase deficiency，MCD）、3-甲基巴豆酰輔酶A 羧化酶缺乏（3-methylcrotonyl-coenzyme A carboxylase deficiency，3MCCD）、3 羥基3 甲基戊二酸尿癥（hydroxymethylglutaric aciduria，HMGA）、β-酮硫解酶缺乏（beta-ketothiolase deficiency，BKT）等多種疾病的有效標(biāo)志物，在新生兒篩查中得到廣泛應(yīng)用[3]。由于C5OH 相關(guān)疾病眾多，臨床表現(xiàn)及干預(yù)治療差異巨大，如何快速有效地對(duì)篩查異常患兒進(jìn)行鑒別、診斷十分關(guān)鍵。為探討中國(guó)北方臨床高危兒中C5OH 指標(biāo)的異常情況及對(duì)后續(xù)診斷的貢獻(xiàn)，本研究綜合利用基于MS/MS、氣相質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）的 代謝分析以及基于外顯子組測(cè)序的遺傳分析，通過研究C5OH 異?；純旱募膊∽V、代謝表型與變異基因型的關(guān)系，以期為優(yōu)化臨床診斷及干預(yù)決策提供參考和依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

回顧性分析2012年11月至2021年10月中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院第七醫(yī)學(xué)中心所有行MS/MS 篩查的0～7歲住院患兒的臨床資料。

本研究獲得患兒家長(zhǎng)的知情同意和醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（No.2018-1）。

1.2 方法

1.2.1 血/尿遺傳代謝病篩查 干血斑樣本采用非衍生化的方法，在Xevo TQD 串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)（美國(guó)Waters 公司）上，使用氨基酸和脂酰肉堿同位素內(nèi)標(biāo)NSK-A、NSK-B（美國(guó)劍橋同位素實(shí)驗(yàn)室）進(jìn)行檢測(cè)分析[4]。對(duì)初檢陽(yáng)性患兒進(jìn)行召回，重新采血樣復(fù)查?；鈮A譜并接受尿液GC-MS 檢測(cè)。尿液樣本采用尿素酶前處理，經(jīng)三甲基硅烷衍生化通過TRACE GC ULTRA-ISQ 氣相色譜質(zhì)譜儀（美國(guó)Thermo Fisher 公司）進(jìn)行分析[5]；尿素酶、甲基硅烷化試劑BSTFA+TMCS(99:1)為美國(guó)Sigma 公司產(chǎn)品。所用化學(xué)試劑為色譜級(jí)純的甲醇、甲酸（美國(guó)Fisher Scientific 公司），分析級(jí)純的丙酮、正己烷、無(wú)水乙醇（北京化工廠）。質(zhì)譜檢測(cè)各代謝物指標(biāo)的切值，參考國(guó)家臨檢中心2019 版專家共識(shí)[6]，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室質(zhì)控優(yōu)化確定[7]。指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果超出切值上限或下限之外的認(rèn)定為指標(biāo)異常（升高或降低）。在疾病判斷時(shí)，某指標(biāo)異常直接提示某種IMD 的被歸為篩查該病的主要指標(biāo)；某指標(biāo)異常與某種IMD 相關(guān)，但需與主要指標(biāo)結(jié)合才能做出判斷的被歸為次要指標(biāo)[8]。

1.2.2 基因變異分析及診斷標(biāo)準(zhǔn) 采集患兒及其父母EDTA 抗凝外周血，提取血液基因組DNA。采用Nimblegen 全外顯子芯片進(jìn)行捕獲，利用Illumina Hiseq 測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序分析（北京智因東方轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心）。所得疑似致病變異采用Sanger 測(cè)序驗(yàn)證，并參考美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）分類標(biāo)準(zhǔn)對(duì)可疑變異進(jìn)行致病性評(píng)估[9]。患者在同一致病基因上存在純合或復(fù)合雜合變異，且變異評(píng)估為“致病或可能致病”，結(jié)合血、尿代謝篩查結(jié)果及臨床表現(xiàn)給予診斷[10-11]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料以例（%）表示。非正態(tài)分布計(jì)量資料以中位數(shù)M（P25～P75）表示。

2 結(jié)果

2.1 血/尿樣本代謝分析結(jié)果

共檢測(cè)患兒53 119 例，檢測(cè)年齡3.0（2.0～3.7）天，男31 087 例、女22 032 例，男女比例1.41:1.53 119 例患兒中檢出C5OH 增高48 例，其中伴有其他指標(biāo)升高的共12 例，包括：?jiǎn)伟?-羥基丁酰肉堿（3-hydroxybutyryl carnitine，C4OH）升高4 例，單伴丙酰肉堿（propionyl carnitine，C3）升高4 例，同時(shí)伴C4OH、C3 升高2 例，同時(shí)伴甲基巴豆酰肉堿（methyl butyl carnitine，C5:1）、C4OH 升高2例。通過尿液GC-MS 檢測(cè)，其中9 例檢出C5OH相關(guān)疾病代謝異常，生化診斷為有機(jī)酸血癥：包括MCD 4 例（血中C5OH、C3 同時(shí)增高），MCD 或3MCCD 2 例（血中僅見C5OH 升高，但部分MCD病例C3 可正常），BKT 2 例，HMGA 1 例。

2.2 患者血?；鈮A水平分析

生化診斷IMD 的9 例患兒的異常酰基肉堿水平分析見表1。C5OH 指標(biāo)在其余未診斷的53 110 例住院患兒干血斑樣本中的檢測(cè)濃度為0.13（0.10～0.18）μmol/L；在2 例診斷BKT（ACAT1變異）的患兒中僅輕度升高（平均濃度為切值上限的1.5倍），且同時(shí)伴有C5:1、C4OH 升高；在6 例診斷MCD（HLCS或BTD變異）的患兒中顯著升高（平均濃度為切值上限的9.6 倍）；4 例（66.7%）伴C3升高；其中2 例（33.3%）還同時(shí)伴有C3/乙酰肉堿（C2）升高。

表1 各基因型診斷病例的血液?；鈮A分析結(jié)果(μmol·L-1）

2.3 確診患者基因檢測(cè)結(jié)果

提示MCD 的4 例患兒中，2 例檢出HLCS變異，確診為全羧化酶合成酶缺乏（holocarboxylase synthetase deficiency，HLCSD）；2 例檢出BTD變異，確診為生物素酶缺乏（biotinidase deficiency，BTD）。提示BKT 的2 例均檢出ACAT1變異；提示HMGA的1 例檢出HMGCL變異。生化診斷未分型疑似MCD 或3MCCD 的2 例，1 例檢出HLCS 變異，另1 例檢出BTD變異，最終確診MCD。

9 例患兒的基因診斷均與生化診斷相符，MCD或3MCCD 的6 例患兒的變異檢出情況見表2，共檢出2 種變異基因，5 例為復(fù)合雜合，1 例為純合；共檢出9 種變異型，其中3 種為新發(fā)現(xiàn)的，分別為c.1313delC（HLCS）、c.172T＞C（BTD）、c.491dupG（BTD）。HLCS病例1 和3 為滿族、同胞姐弟。

2.4 代謝指標(biāo)診斷效率

本研究干血斑M(jìn)S/MS 檢測(cè)中C5OH 單一指標(biāo)篩查陽(yáng)性率0.090%（48/53119），最終診斷IMD 9 例，陽(yáng)性檢出率1: 5902，假陽(yáng)性率0.073%（39/53110），陽(yáng)性預(yù)測(cè)值18.75%（9/48）；C5OH 合并多指標(biāo)（C4OH、C3、C5:1）篩查陽(yáng)性率0.022%（12/53119），其中7例確診，假陽(yáng)性率0.009%（5/53110）顯著降低，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值升高（58.33%，7/12）。另一血篩主要指標(biāo)C5:1 在53 119 例住院兒中升高的例數(shù)為92例，篩查陽(yáng)性率0.173%，高于C5OH，但C5OH合并C5:1 升高僅2 例，且后續(xù)均確診為BKT，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值達(dá)100%。C5OH 異?；純赫倩貜?fù)查并行GC-MS 檢測(cè)時(shí)，C5OH 升高合并尿代謝物異常9 例，后續(xù)全部確診，無(wú)一假陽(yáng)性，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值100%。

3 討論

基于MS/MS 的IMD 篩查指標(biāo)的設(shè)置既要盡量避免陽(yáng)性患兒的漏診、誤診，又要將陽(yáng)性召回率、假陽(yáng)性率控制在可接受的范圍，以避免不必要的入院、檢查、隨訪以及家屬的焦慮。目前關(guān)于MS/MS 篩查指標(biāo)的陽(yáng)性率、假陽(yáng)性率以及陽(yáng)性患兒疾病譜等，國(guó)內(nèi)鮮見報(bào)道。C5OH 是MS/MS檢測(cè)的重要指標(biāo)，已列入包括我國(guó)在內(nèi)的多個(gè)國(guó)家、地區(qū)的新生兒IMD 篩查項(xiàng)目[12]。由于該指標(biāo)與MCD 等多個(gè)有機(jī)酸血癥相關(guān)，僅憑單一指標(biāo)難以實(shí)現(xiàn)分型鑒別。另外，嚴(yán)重感染、腦梗、腦出血、早產(chǎn)、營(yíng)養(yǎng)不良等因素也可繼發(fā)血中C5OH 的增高[13-14]，造成假陽(yáng)性的增加[15]。目前，可利用臨床表現(xiàn)、GC-MS 尿代謝譜分析、酶學(xué)檢測(cè)和基因分析等多種手段來(lái)實(shí)現(xiàn)后續(xù)的確診。為考察C5OH 指標(biāo)的診斷效能，以及如何綜合利用各手段以優(yōu)化診斷程序，本研究在53 119 例0～7 歲的高危兒中進(jìn)行了為期9 年的觀察，發(fā)現(xiàn)C5OH 單一指標(biāo)的假陽(yáng)性率為0.073%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為18.75%。與梅奧醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室提出的MS/MS 新生兒篩查指標(biāo)的推薦要求（假陽(yáng)性率＜0.3%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值＞20.0%）[16]大致相當(dāng)。本研究利用C5OH 合并多指標(biāo)C4OH、C3、C5:1 綜合分析，可顯著降低假陽(yáng)性率，并提高陽(yáng)性預(yù)測(cè)值，C5OH 合并C5:1 升高確診BKT 的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值達(dá)100%。

尿GC-MS 代謝分析是降低MS/MS 篩查假陽(yáng)性的重要手段。本研究在對(duì)C5OH 異?；純翰裳獜?fù)查的同時(shí)，采集尿樣進(jìn)行GC-MS 檢測(cè)。通過血、尿代謝譜綜合分析，生化診斷IMD 9 例。其中7 例，包 括4 例MCD、2 例BKT、1 例HMGA 可根據(jù)異常代謝物明確分型；另外2 例疑似診斷MCD 或3MCCD，未得到分型。后續(xù)對(duì)9 例生化診斷病例，利用全外顯子組測(cè)序技術(shù)進(jìn)行遺傳分析，2 例疑診病例均明確為MCD；全部遺傳診斷結(jié)果均與生化診斷相符。血MS/MS 聯(lián)合GC-MS 尿檢測(cè)可生化確診HMGA、BKT 等疾?。磺液罄m(xù)基因測(cè)序驗(yàn)證中，未出現(xiàn)假陽(yáng)性病例，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值高達(dá)100%。本研究未觀察到MS/MS 篩查陰性患兒出現(xiàn)C5OH 相關(guān)IMD 的疑似癥狀。由于隨訪時(shí)間較短，難以獲得篩查陰性患兒的基因信息，存在缺乏篩查假陰性相關(guān)結(jié)果等局限。

本研究中C5OH 代謝異常的主要疾病類型為MCD。MCD 是由于患者不能利用生物素所導(dǎo)致的可引發(fā)包括神經(jīng)系統(tǒng)在內(nèi)的多系統(tǒng)異常的有機(jī)酸血癥，包括HLCS和BTD兩種基因變異類型[16]。根據(jù)基因分析，本研究中HLCS和BTD缺陷占C5OH異常病因的66.7%（各為33.3%）。上述結(jié)果與南方浙江地區(qū)針對(duì)新生兒人群的發(fā)現(xiàn)不同。浙江新生兒篩查的C5OH 異常病例除3MCCD 外，未檢出其他疾病類型，致病主要遺傳原因?yàn)镸CCC1、MCCC2基因變異[17]。本研究結(jié)果提示了中國(guó)北方C5OH異?；純旱倪z傳特點(diǎn)，并在此基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)了MCD相關(guān)的3 種新變異型：HLCS（c.1313delC）、BTD（c.172T＞C）和（c.491dupG）。

本研究結(jié)果顯示MS/MS 篩查單一指標(biāo)異常存在較高的假陽(yáng)性，可通過結(jié)合多指標(biāo)聯(lián)合分析、GC-MS 尿代謝檢測(cè)以及遺傳分析降低假陽(yáng)性率，提高診斷特異性和準(zhǔn)確性。MS/MS 聯(lián)合GC-MS 的血尿代謝分析可快速、有效獲得C5OH 相關(guān)異常的生化診斷，于明確分子診斷前及時(shí)指導(dǎo)臨床干預(yù)?；驒z測(cè)對(duì)鑒別HLCSD、BTD 等類型，以及后續(xù)進(jìn)行遺傳咨詢、產(chǎn)前診斷仍具有重要意義。