李 芳 王 利

重慶醫(yī)科大學附屬婦女兒童醫(yī)院兒科（重慶 401120）

近年來，隨著我國圍生醫(yī)學和新生兒醫(yī)學迅速發(fā)展[1]，越來越多的早產兒得以存活，早產相關疾病成為新生兒死亡的重要原因[2]。早產兒出生胎齡的不斷提前，早產相關疾病的發(fā)生風險也日益增加，如支氣管肺發(fā)育不良（bronchopulmonary dysplasia，BPD）、腦室內出血（intraventricular hemorrhage，IVH）、腦白質損傷（white matter injury，WMI)、壞死性小腸結腸炎（necrotizing enterocolitis，NEC）等，極大影響存活早產兒的遠期生存質量[3]。常規(guī)治療對于已受損組織的修復以及器官功能的恢復往往作用有限。干細胞可分化為各種組織，并具有免疫調節(jié)、改善微環(huán)境作用，還可以通過旁分泌作用產生大量有益的細胞因子、生長因子和外泌體，有助于組織修復[4]，為臨床棘手的早產兒并發(fā)癥治療帶來了新的曙光。干細胞來源廣泛，其中臍血來源的干細胞（umbilical cord blood，UCB）具有獲取方便、不損害母體與胎兒、含量豐富、分化潛能高、免疫原性低、安全性高、低溫保存時間長等優(yōu)勢[5-6]。因此，臍血來源的干細胞移植（umbilical cord blood transplantation，UCBT）長期以來成為臨床研究的重點。本文將圍繞UCBT在治療早產兒疾病的臨床研究現(xiàn)狀和面臨的挑戰(zhàn)進行探討。

1 UCB的組成和UCBT類型

1.1 UCB的組成

UCB 含有間充質干細胞（mesenchymal stem/stromal cells，MSCs）、造血干/祖細胞（hematopoietic stem/progenitor cells，HSCs）、內皮祖細胞（endothelial progenitors，EPCs）、淋巴細胞、單核細胞、自然殺傷細胞等[7-8]。MSCs 是一類多能干細胞，具有分化為成骨細胞、成軟骨細胞和脂肪細胞譜系的潛力[9]，還可分泌促進組織修復、調節(jié)免疫的生長因子、細胞因子、趨化因子和細胞外囊泡[10]。MSCs 在UCB的含量較少，要提取到適用的MSCs，至少需要采集90 mL臍帶血且自采集到細胞提取的時間間隔不能超過2 小時[11]。與骨髓或外周血來源相比，UCB 來源的HSCs 更不成熟，在接受外來抗原刺激時增殖能力更強[12]。HSCs 可進一步分化成骨髓系統(tǒng)的各種血細胞和淋巴系統(tǒng)的細胞[13]。EPCs 是血管內皮細胞的前體細胞，它們的功能主要是參與出生后缺血組織的血管生成和血管損傷后的修復[14]。淋巴細胞是免疫反應的核心。與成人外周血相比，UCB 的B淋巴細胞占比類似、T淋巴細胞占比較少[15]。UCB來源的淋巴細胞表型和功能上都不成熟。單核細胞是血液中循環(huán)的未成熟吞噬細胞[16]，單核細胞可以分化為樹突狀細胞、巨噬細胞和成骨細胞。單核細胞作為抗原呈遞免疫細胞，它們可以吞噬和降解微生物和顆粒物[17]。目前UCBT 治療新生兒疾病，根據(jù)移植成分不同分為：臍帶血間充質干細胞移植（mesenchymal stem/stromal cells，MSCs）、臍帶血單個核細胞移植（cord blood-mononuclear cells，CBMNCs）和全臍帶血移植治療。

1.2 UCBT類型

1.2.1 臍帶血間充質干細胞移植 MSCs 因易提取、體外擴增能力強、低免疫原性和強大的分化潛力而獨具優(yōu)勢[18-19]，一直是新生兒細胞治療研究的重點。目前，國外商品化的臍帶血來源MSCs已經用于臨床研究。歐盟資助的PREMSTEM 聯(lián)盟致力于對商品化的MSCs通過體內和體外篩選進行全面測試，將進一步促進臨床轉化[20]。近年來，MSCs細胞外囊泡的治療作用逐漸被發(fā)現(xiàn)[21-22]。

1.2.2 臍帶血單個核細胞移植 CB-MNCs是將人臍帶血采用密度梯度離心法分離得到單個核細胞[23]，包含豐富的造血干/祖細胞、內皮祖細胞、間充質干細胞、淋巴細胞、單核細胞等[24]。CB-MNCs 移植治療腦損傷、支氣管肺發(fā)育不良等研究較多，但究竟是哪種細胞發(fā)揮作用尚不清楚。CB-MNCs具有自我更新、多向分化為各種細胞表型的功能，其外分泌功能還參與了組織修復和免疫調節(jié)[24]。自體CB-MNCs可以在出生后數(shù)小時或數(shù)天內方便且安全地移植，其數(shù)量充足，不需要擴增即可產生治療效果。

1.2.3 全臍帶血移植 全臍帶血移植于1989年報道可用于治療兒童范可尼貧血，此后被廣泛用于造血系統(tǒng)疾病的骨髓重建[25]。臍帶血干細胞的數(shù)量異常和早產兒并發(fā)癥相關[26-27]，且臍帶血富含胎兒血紅蛋白和大量的生長因子、趨化因子，因此有學者采用全臍帶血移植以充分發(fā)揮臍帶血的優(yōu)勢。研究發(fā)現(xiàn)，對早產兒采集、制備和儲存臍帶血是方便可行的[28]，臨床上已經有應用全臍帶血移植治療早產兒貧血的I期研究。

2 UCBT在新生兒疾病治療中的臨床應用

2.1 BPD

BPD 是一種由多種因素綜合作用引起的疾病，其發(fā)病率始終居高不下。早產兒未發(fā)育成熟的肺在機械通氣、感染等因素的影響下發(fā)育受阻，導致肺泡與毛細血管數(shù)量減少、發(fā)育不良或受損傷后修復障礙。盡管肺表面活性物質使用、肺保護性通氣策略及其他藥物應用于BPD的預防和治療，但并未根本性解決導致BPD發(fā)病的肺泡和血管發(fā)育受阻和損傷后的修復障礙問題。干細胞的作用特點為UCBT 用于BPD 治療奠定基礎。近年來，各國均開展了大量UCBT 治療BPD 的臨床研究，一些研究目前已經進入III 期臨床研究階段，其安全性、可行性和有效性均得到了初步驗證。

2.1.1 UCBT 治療BPD 的安全性和可行性 韓國Chang 等[29]和杜克大學Powell 等[30]在超早產兒接受低劑量（1×107/kg）或高劑量（2×107/kg）氣管內注射人臍帶血來源的MSCs 移植，未發(fā)現(xiàn)與移植相關的不良的結局。國內重慶市兒童醫(yī)院Xia等[31]和越南Nguyen 等[32]以人源臍血MSCs靜脈注射治療重度BPD患兒，隨訪未發(fā)現(xiàn)移植相關不良事件。

2.1.2 UCBT治療BPD的有效性 Ahn等[33]2021年發(fā)表了Ⅱ期RCT臨床研究結果，33例超早產兒接受氣管內移植人臍帶血來源的MSCs 1×107/kg；和對照組相比，干細胞移植組的氣道灌洗液的炎癥因子水平顯著下降。在亞組分析中，23～24 周組的嚴重BPD發(fā)病率顯著降低，干細胞移植后的患兒計劃隨訪至糾正年齡5歲，該研究結果尚未發(fā)表。同時研究者團隊正在招募23～24 周患兒，開展更大規(guī)模的Ⅱ期RCT 試驗。廣東省婦幼保健院Ren 等[34]在早產兒生后8小時內靜脈注射自體臍帶血單個核細胞（ACBMNCs，5×107/kg），試驗組顯著減少了機械通氣時間和需氧治療時間。2023年廣東省婦幼保健院Zhuxiao等[35]在62例極早產兒生后24 h靜脈注射一劑ACBMNCs（5×107/kg），ACBMNCs注射組中重度BPD 發(fā)病率顯著降低，呼吸機拔管率更高；在校正18～24月齡時發(fā)育遲緩的發(fā)病率更低，CD4+T細胞、Treg細胞比例顯著增加，IL-10水平顯著升高，TNF-α 和CRP 水平顯著降低。該團隊旨在探索自體臍帶血單個核細胞移植預防超早產兒BPD的多中心Ⅲ期隨機對照RCT 研究（NCT 04440670）正在開展中。

2.2 新生兒神經系統(tǒng)疾病

極低出生體重兒（VLBW）救治存活率的提高使得遠期神經系統(tǒng)發(fā)育障礙問題逐漸凸顯。約10%的VLBW 患者伴隨腦癱，高達50%的VLBW 患兒存在需要干預的學習困難或者行為異常[36]。盡管亞低溫治療對HIE、IVH、WMI等常見新生兒腦損傷有效，但是亞低溫只能達到部分神經保護作用，對已造成損傷的神經系統(tǒng)無修復功能[37]，且只能用于治療（近）足月HIE。

目前應用干細胞治療新生兒腦損傷的研究主要集中于IVH 和HIE，且尚處于安全性研究階段。Ahn 等[38]研究發(fā)現(xiàn)9 例胎齡（26.1±2.1）周的患兒在診斷IVH-IV ?后1 周內腦室內接受移植單次、低劑量（5×106/kg）或高劑量（2×107/kg）人臍帶血來源的MSCs 是安全和可行的。Cotton 等[39]發(fā)現(xiàn)予以亞低溫的HIE 患兒，予以自體臍帶血細胞移植是可行的，干細胞移植+亞低溫組和僅接受亞低溫組1 歲時Bayley III 評分≥85 為13/18（74%）對19/46（41%），移植后1 年內未發(fā)生相關不良事件。日本Tsuji等[40]在發(fā)生重度窒息接受亞低溫治療的患兒中生后12～72 h 內共接受3 次靜脈輸注自體臍帶血后，未發(fā)生相關移植不良事件。目前進行中的臨床試驗NCT 01284673 研究新生兒窒息的臍帶血干細胞的特點，目前已經完成研究，尚未發(fā)表結果。ACTRN 12619001637134 旨在探索，超早產兒采集自體臍帶血和靜脈輸注單個核細胞的安全性和可行性[41]。

2.3 NEC

干細胞治療NEC 的研究目前絕大多數(shù)仍處于動物實驗階段。Akduman等[42]2019年發(fā)表1例室上性心動過速相關的新生兒壞死性小腸結腸炎患兒臨床病例報告，該患兒術中發(fā)現(xiàn)腸道廣泛壞死，切除60 cm壞死、穿孔腸道后，靜脈移植1×107/kg臍帶血來源同種異體MSCs，移植后腸道血供恢復，逐步建立全腸道喂養(yǎng)；該患兒1 歲時的體格和神經發(fā)育和同齡兒水平相當。

表1 UCBT在新生兒疾病的臨床研究

2.4 早產兒貧血

Rudnicki 等[28]開展了一項納入14例＜32周出生時貧血早產兒的臨床研究，其中5 例接受自體臍帶血移植，整個臍帶血輸注過程中和隨后的48小時內，氧飽和度顯著增加，說明早產兒中進行全自體臍帶血移植的總體安全性和耐受性。Kotowski等[43]在5 例生后貧血的早產兒在生后5 天內接受單次臍帶血輸注，15例患兒作為對照組接受同種異體的紅細胞輸注，臍帶血輸注組發(fā)生IVH 的比例是40%，低于對照組86.7%，推測自體臍帶血輸注在這個小樣本研究中是可行的、安全的。

2.5 先天性心臟異常

Burkhart等[44]對10例左心發(fā)育不良綜合征患兒接受II 期緩解手術的同時心肌內注入（1～3）×106自體臍帶血來源的MNCs，其中1例發(fā)生干細胞注射相關不良事件注射部位心外膜出血，需要簡單縫合，手術和干細胞移植后隨訪6個月，未發(fā)現(xiàn)嚴重MNCs移植不良反應，且手術+干細胞移植（7 例）的嬰兒體重增長、右心室分數(shù)面積變化和射血分數(shù)方面相較于既往單純手術對照組均有顯著改善。

3 臍血來源干細胞臨床應用面臨的挑戰(zhàn)

盡管UCBT為早產兒疾病治療帶來了新的曙光，然而迄今為止的臨床研究雖然涉及多種臍帶血來源干細胞、多種移植途徑、多種早產兒疾病，但是多為前期安全性研究，研究設計多為小樣本單中心研究。見表1。UCBT治療早產兒疾病的臨床應用中干細胞來源選擇、移植的方案包括時機、途徑、劑量、移植成分、與其他治療措施的相互作用以及潛在風險等問題亟待解決。

3.1 自體還是異體臍帶血移植

自體臍血干細胞采集是理想的移植材料，因為沒有移植物抗宿主病的風險、且通常不存在倫理問題。然而自體臍帶血移植可能存在采集量不足的問題，尤其是早產兒經延遲臍帶結扎處理后，如存在絨毛膜羊膜炎等產科并發(fā)癥將進一步限制自體UCB 輸注[45]。NetCord-FACT 建議只采集沒有并發(fā)癥的分娩時孕周＞34 周嬰兒的臍帶血。胎齡越小，自體臍帶血采集量越低。Segler 等[46]研究中42%的＜30 周早產兒無法采集到足夠的臍帶血。此外，自體干細胞的采集、制備和移植均需要時間，可能導致錯過了BPD和HIE等最佳的治療時間窗。

目前Ⅰ期和Ⅱ期的異體UC-MSCs 在新生兒疾病移植中已經證實是安全可行的。異體UCB-MNCs移植治療兒童腦癱中正在開展臨床研究[47]。臍帶血來源的其他干細胞的體外擴增和異體移植，比如臍血來源的造血干細胞、內皮祖細胞目前尚處于動物實驗階段中[48-49]。

3.2 移植的最佳方案：時機、劑量和途徑

關于移植的時機，目前僅有動物研究數(shù)據(jù)提示治療時間窗為損傷早期。研究表明，在藥物所致肺纖維化模型中，在給藥同時予以MSCs 可減輕肺纖維化，而給藥后1周作用不明顯[50]。另有研究表明，胎羊經歷缺氧缺血事件后，和晚期移植（缺氧缺血后5 d）相比，早期移植（缺氧缺血后12 h）可顯著減輕腦白質損傷[51]。關于移植的劑量，自體UCBMNCs移植治療腦癱的RCT研究發(fā)現(xiàn)：高劑量移植組（20×106/kg）的運動功能改善比低劑量移植組（10×106/kg）更好[52]。而前述多個臨床研究進行了不同劑量的研究，著重關注了高劑量的安全性，而沒有比較高低劑量之間是否存在臨床結果的差異。目前UCBT 的途徑主要包括氣管滴入、靜脈注射和腹腔注射，而治療途徑又將影響治療劑量，因為直接向損傷部位注射低劑量比靜脈注射高劑量要多出5 倍[53]。因此，在未來的臨床試驗仍需解決在特定的新生兒疾病中，最佳的移植時機、移植劑量和移植途徑。

3.3 UCBT與其他治療措施的相互作用

早產兒常常需要多種措施治療，而這些治療措施與UCB 可能存在相互作用。如一氧化氮和促紅細胞生成素與MSC 治療有協(xié)同作用[54-55]，可以增強BPD 模型中的促血管生成和抗纖維化作用。而對HIE的研究表明亞低溫和間充質干細胞可以具有協(xié)同作用[55]或拮抗作用[56]。這些研究表明，要將UCBT治療從可控制的實驗室環(huán)境轉向復雜和高度可變的臨床環(huán)境需要特別謹慎。

3.4 細胞治療的標準化

對于細胞的治療需要解決的一個重要問題是要有一個穩(wěn)定的大量細胞供應，其療效是持續(xù)一致的。由于不可能同時產生大量的細胞來滿足臨床需求，因此當細胞從不同的來源和不同的時間獲得時，保持其一致的性能將是一個挑戰(zhàn)。因此，標準化產生具有相同功效的細胞的培養(yǎng)技術是至關重要的?；贛SCs 的治療面臨的另一個挑戰(zhàn)是，確定當細胞傳代以增加細胞數(shù)量時，骨髓間充質干細胞的治療效果是否保持一致。

3.5 干細胞治療的遠期風險

由于干細胞具有多向分化潛能，干細胞治療的遠期潛在的致癌轉化一直以來是影響其臨床應用安全性的一個關鍵因素。目前有不同的研究結果，有研究表明，長期培養(yǎng)的骨髓來源的MSCs 容易發(fā)生自發(fā)性惡性轉化[57]，但最近的一項研究評估了hUBC-MSCs 在NOD SCID 小鼠模型中腫瘤發(fā)生中的作用，發(fā)現(xiàn)在NOD SCID小鼠中，hUC-MSCs沒有致瘤性，也沒有顯著促進或抑制實體或血液學腫瘤的生長或轉移[58]。因此，所有接受干細胞治療的患兒需要長期隨訪并且在治療前充分告知家屬潛在的風險。

4 結語

當前早產兒疾病，特別是超/極早產兒相關疾病的有效治療對于新生兒科醫(yī)師來說仍是巨大的挑戰(zhàn)。隨著對UCBT基礎和臨床研究的深入，大量的臨床研究已經初步證實其在一些特定早產兒疾病治療中的安全性和潛在有效性，未來還需要在細胞治療來源選擇、治療機制、細胞治療的標準化管理和精準治療方案等方面開展進一步的基礎和臨床研究以實現(xiàn)其在臨床實踐中發(fā)揮積極作用。