甘源，蘇麗娟，韋艷娜，武昱孜，林昌華，覃秀珍，黃海權(quán)，白昀，邵國青，熊祺琰，馮志新*

(1. 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用生物制品工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210014；2. 廣西桂墾西江牧業(yè)有限公司，廣西 貴港 537100)

豬肺炎支原體(Mycoplasmahyopneumoniae，Mhp)是引起豬支原體肺炎(mycoplasmal pneumonia of swine，MPS)的主要病原，不同品種、不同日齡的豬群均可感染，主要表現(xiàn)為咳嗽、氣喘、消瘦和生長遲緩等臨床癥狀，也是豬呼吸道綜合征(porcine respiratory disease complex，PRDC)[1-3]的主要病原體之一。Mhp主要定殖在氣管、支氣管和細(xì)支氣管的黏膜表面[4]，通過破壞上皮表面的纖毛，影響?zhàn)つさ那宄到y(tǒng)和呼吸道免疫系統(tǒng)功能，導(dǎo)致豬群的免疫力下降和飼料轉(zhuǎn)化效率的降低，嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。因此，在豬群感染早期，活體檢測豬肺炎支原體對于及時(shí)實(shí)施控制措施至關(guān)重要。然而在實(shí)際的生產(chǎn)中，由于豬肺炎支原體主要定殖在下呼吸道，進(jìn)行活體采樣操作和早期的診斷會更為復(fù)雜，部分臨床樣品無法實(shí)現(xiàn)活體采樣或在活體狀態(tài)下樣品采集不易操作導(dǎo)致樣品可靠性難保證，其檢測結(jié)果還可能受豬群的感染背景、檢測方法、樣品類型和采集時(shí)間等因素的影響[5-7]，基于ELISA技術(shù)的血清抗體檢測法雖然是一種經(jīng)濟(jì)且常用的方法，但由于Mhp感染后血清抗體轉(zhuǎn)陽較遲，且無法區(qū)分所檢測的血清抗體是疫苗抗體還是野毒抗體，以及在哺乳與保育早期也無法區(qū)分母源抗體還是感染抗體，故臨床上對血清抗體的檢測不能準(zhǔn)確用于Mhp感染的診斷[8-9]。課題組曾建立了特異性黏膜sIgA抗體檢測技術(shù)[10-11]，可區(qū)別母源抗體、滅活疫苗抗體和感染抗體，已用于Mhp的感染診斷。在分子檢測方面，實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)是目前Mhp感染診斷的主要方法[1，12]，可從豬肺炎支原體的靶組織，如氣管[7]、支氣管[13]和肺臟[14]，以及運(yùn)用臨床拭子樣品，如喉拭子[5]、鼻拭子[15]、氣管拭子和咽拭子[13]進(jìn)行豬肺炎支原體檢測。然而，喉拭子只是在試驗(yàn)感染條件下評估過[5，16-17]，在臨床條件下鮮見報(bào)道[6]。另外，相較于氣管拭子樣本，來源于自然感染Mhp的育肥豬場的咽拭子樣本存在較低的抗原陽性率[13]。鼻拭子樣本具有采集簡單易操作、對機(jī)體損傷較小等優(yōu)點(diǎn)，可通過檢測鼻拭子樣品的Mhp sIgA黏膜抗體和抗原來評估實(shí)際生產(chǎn)中不同生產(chǎn)階段豬群的免疫和感染狀況[18]。

由于受豬群的感染背景、檢測方法、樣品類型和采集時(shí)間等因素的影響，不同樣品的檢測結(jié)果往往缺乏一致性。目前尚缺乏活體采集的鼻拭子、喉拭子和咽拭子樣品中Mhp黏膜sIgA抗體和抗原檢測結(jié)果的系統(tǒng)比較數(shù)據(jù)，對于Mhp感染的檢測缺乏統(tǒng)一的方法與標(biāo)準(zhǔn)。本研究針對以上問題，通過ELISA和實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測來源于某大型養(yǎng)殖場不同生產(chǎn)階段豬群的鼻拭子、喉拭子和咽拭子樣品中Mhp黏膜sIgA抗體和抗原，并對數(shù)據(jù)加以比較分析，以探求在自然感染情況下，在不同檢測方法、感染時(shí)間和樣本類型中Mhp黏膜sIgA抗體分泌和抗原留存規(guī)律，為Mhp在流行病調(diào)查和凈化策略的實(shí)施過程中如何選擇可靠有效的臨床樣品提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

鼻拭子、喉拭子和咽拭子樣品全部來源于廣西某大型養(yǎng)殖場的斷奶仔豬群、保育豬群(60日齡)、育肥豬群(120日齡)、屠宰豬群、后備豬群和種豬群，每頭豬均采集2～3種樣品(具體品種及數(shù)量見表1)，樣品采集遵循全覆蓋、隨機(jī)性、可靠性的原則。

表1 不同生產(chǎn)階段豬群3種樣品中Mhp sIgA抗體檢測結(jié)果

1.2 主要試劑

豬肺炎支原體sIgA黏膜抗體檢測試劑盒由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所提供；豬肺炎支原體qPCR檢測試劑盒購自麥諾迪(上海)生物科技有限公司；拭子浸泡液由江蘇省農(nóng)科院獸醫(yī)研究所提供。

1.3 樣品采集及處理

1.3.1 鼻拭子

參照馮志新等[19]方法采集鼻拭子，體型較大豬群需借助保定器，鼻拭子樣品采集完成后將拭子插回裝有拭子浸泡液的樣品收集管中并做好標(biāo)記。樣品處理：將收集的鼻拭子樣品在2～8 ℃浸泡2 h以上，在渦旋振蕩器上震蕩5 s 后，用1 mL移液器盡量吸出鼻拭子浸液，12 000 r/min離心10 min，取上清液用于Mhp黏膜sIgA抗體檢測，取沉淀用于Mhp抗原檢測。

1.3.2 咽拭子

采樣前停水2 h，采樣時(shí)先打開豬用一次性咽拭子采樣器(50 cm長)，注意采樣器頭部不能隨意碰觸其他物品，手部握住咽拭子采樣器最末端，沿著上顎緩慢伸入至雙側(cè)咽扁桃體和咽后壁處，至手部不能再進(jìn)入為準(zhǔn)，輕輕拭擦2～3次后抽出，將采樣器頭部折斷至裝有拭子浸泡液的樣品收集管中并做好標(biāo)記。樣品處理參照鼻拭子樣品的處理方法。

1.3.3 喉拭子

根據(jù)動物的體重選擇人工或保定器將豬固定后，一人使用開口器打開豬的上下顎，另一人左手使用喉鏡的葉片固定舌頭，右手握住加長的咽拭子采樣器(70 cm)的末端，沿著上顎緩慢伸入至手部不能再進(jìn)入為準(zhǔn)，上下滑動2～3次和左右旋轉(zhuǎn)2～3次后緩慢取出，將采樣器頭部折斷至裝有拭子浸泡液的樣品收集管中并做好標(biāo)記。樣品處理參照鼻拭子樣品處理方法。

1.4 Mhp黏膜sIgA檢測方法

參照Feng等[10]建立的豬肺炎支原體sIgA檢測方法，用豬肺炎支原體sIgA-ELISA抗體檢測試劑盒，檢測鼻拭子、喉拭子和咽拭子樣品上清液中的Mhp特異性sIgA抗體。在酶標(biāo)儀上讀取OD450 nm值，S/P值=(樣品OD450 nm平均值-陰性對照OD450 nm平均值)/(陽性對照OD450 nm平均值-陰性對照OD450 nm平均值)。

1.5 Mhp抗原含量檢測方法

用柱式或磁珠提取法提取樣品中的DNA后，參照豬肺炎支原體熒光PCR檢測試劑盒操作流程進(jìn)行熒光PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系20 μL：PCR反應(yīng)液15 μL，P溶液2 μL，待檢DNA溶液3 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，進(jìn)行45個(gè)循壞。Ct值≤38的樣本判定為陽性。利用豬肺炎支原體熒光定量PCR方法檢測鼻拭子、喉拭子和咽拭子樣品沉淀中Mhp抗原的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生產(chǎn)階段豬群3種樣品中Mhp黏膜sIgA抗體陽性率的比較

檢測了不同生產(chǎn)階段豬群的鼻拭子、喉拭子和咽拭子樣品中Mhp sIgA抗體，共計(jì)872份，3種樣品的總體黏膜抗體陽性率為57.34%(表1)，其中鼻拭子、喉拭子、咽拭子的陽性率分別為63.23%、62.55%、47.27%(圖1)，且針對同一頭豬的鼻拭子、喉拭子和咽拭子的檢測結(jié)果在屠宰豬表現(xiàn)出較高的符合率(符合率指同一頭豬不同樣品檢測均為陰性或者陽性數(shù)與總樣品數(shù)的比值)，而在斷奶仔豬、保育豬及后備豬的檢測符合率較低，尤其是咽拭子的陽率性普遍較低(表1)。從不同的生產(chǎn)階段看，保育豬和屠宰豬群中Mhp黏膜sIgA抗體陽性率較高，而斷奶仔豬群中Mhp黏膜sIgA抗體陽性率最低。鼻拭子樣品相較喉拭子和咽拭子樣品，Mhp黏膜sIgA抗體的檢出率更高(圖2)。

圖1 3種樣品的Mhp sIgA抗體檢測結(jié)果

圖2 不同生產(chǎn)階段豬群3種樣品的Mhp sIgA抗體檢測

2.2 不同生產(chǎn)階段豬群3種樣品中Mhp抗原陽性率的比較

將不同生產(chǎn)階段豬群的鼻拭子、喉拭子和咽拭子樣品按照樣品種類進(jìn)行隨機(jī)混樣檢測Mhp抗原，共計(jì)286份混合樣品，3種樣品的總體抗原陽性率為68.18%(表2)。其中鼻拭子、喉拭子、咽拭子的陽性率分別為74.75%、65.91%、63.64%(圖3)。

圖3 3種樣品的Mhp抗原檢測結(jié)果

表2 不同生產(chǎn)階段豬群3種樣品中的Mhp抗原檢測結(jié)果

從不同的生產(chǎn)階段看，斷奶仔豬階段的鼻拭子和咽拭子均未檢出Mhp抗原，Mhp抗原的檢出率隨著豬群生產(chǎn)日齡的增加而增加，屠宰豬群和后備豬群鼻拭子和喉拭子中Mhp抗原陽性率達(dá)到峰值，種豬群的抗原檢測率出現(xiàn)了下降(圖4)。鼻拭子相較喉拭子和咽拭子樣品，Mhp抗原的檢出率在育肥豬群、屠宰豬群、后備豬群和種豬群均更高。

圖4 不同生產(chǎn)階段豬群3種樣品的Mhp抗原檢測

2.3 不同生產(chǎn)階段豬群鼻拭子樣品中Mhp黏膜sIgA抗體和抗原陽性率的比較

由圖5可見，在斷奶仔豬群的鼻拭子中可檢出Mhp黏膜sIgA抗體，但Mhp抗原未檢出；在保育豬、屠宰豬、后備豬和種豬群階段的鼻拭子中既可檢出Mhp黏膜sIgA抗體，也可檢出Mhp抗原。其中，斷奶仔豬、保育豬至屠宰豬階段的鼻拭子Mhp黏膜sIgA抗體陽性率均高于Mhp抗原陽性率，而后備豬群的鼻拭子Mhp抗原陽性率高于Mhp黏膜sIgA抗體陽性率，種豬群的鼻拭子樣品中Mhp黏膜sIgA抗體和Mhp抗原陽性率相當(dāng)。

圖5 鼻拭子的Mhp抗原和抗體陽性率對比

3 討論

黏膜和黏膜免疫系統(tǒng)共同構(gòu)成了機(jī)體抵抗病原體入侵的重要屏障。目前的研究結(jié)果表明，絕大多數(shù)的病原感染或感染初期發(fā)生在黏膜表面[20]。黏膜免疫產(chǎn)生的抗體主要以sIgA為主[21]。sIgA抗體的分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，能夠適應(yīng)黏膜表面復(fù)雜的環(huán)境，豬肺炎支原體特異性sIgA抗體在感染后可持續(xù)9～19周[22]。鼻拭子樣本已被應(yīng)用于早期感染的黏膜病原和抗體檢測[23-24]。本次研究結(jié)果顯示，Mhp感染后各生產(chǎn)階段豬群鼻拭子中黏膜sIgA抗體檢出率最高，喉拭子樣品次之，咽拭子最低。這可能與3種樣品中內(nèi)容物的組成差異有關(guān)，鼻拭子樣品主要以呼吸道分泌液為主，而咽拭子樣品中以唾液為主。研究結(jié)果說明，鼻拭子樣品對于檢測Mhp黏膜sIgA抗體具有普遍適用性，可用于各個(gè)生產(chǎn)階段豬群的監(jiān)測。對于不同生產(chǎn)階段的豬群，鼻拭子與喉拭子樣品中Mhp黏膜sIgA抗體陽性檢出率也有所不同，從斷奶仔豬到保育、屠宰階段持續(xù)上升，隨著日齡上升，后備、種公母豬陽性率逐漸下降，這與以前我們對Mhp人工感染條件下黏膜sIgA抗體分泌規(guī)律研究結(jié)論一致[22]。這種現(xiàn)象與臨床上Mhp自然感染后的流行動態(tài)也基本一致，提示臨床上規(guī)模豬場對于豬肺炎支原體的感染控制需結(jié)合科學(xué)的飼養(yǎng)管理模式，如通過早期斷奶減少由母豬傳染至仔豬的機(jī)率，或通過全進(jìn)全出的生產(chǎn)體系以及在斷奶轉(zhuǎn)群等節(jié)點(diǎn)增加藥物控制策略等方式減少陽性生長豬水平傳播的機(jī)率。本研究結(jié)果提示，臨床上采用黏膜sIgA抗體檢測技術(shù)對Mhp的感染進(jìn)行監(jiān)測時(shí)，保育及生長育肥豬群是最理想的檢測對象，而鼻拭子樣品是最佳的檢測樣品。

在分子診斷方面，國外用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測了不同感染時(shí)間點(diǎn)的鼻拭子、喉拭子、支氣管灌洗液和血液樣品中的Mhp抗原，喉拭子被證明作為一種微創(chuàng)、高敏感性的臨床樣本，其具有較高的抗原靈敏度[5]。Moiso等[6]人采用巢式PCR方法檢測了3周齡、6周齡、10周齡、16周齡和22周齡豬群的鼻拭子和喉拭子樣品，證明喉拭子樣品比鼻拭子具有更高的Mhp抗原檢測率。然而本次的研究結(jié)果顯示，在臨床條件下豬鼻拭子樣品中Mhp抗原的檢出率高于喉拭子的檢出率，在3種樣品中是最高的，這與以往文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果不一致。對臨床樣品采集的回溯性調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在大量樣品采集的情況下，喉拭子樣品的采集具有較大的難度與不確定性，這可能是導(dǎo)致喉拭子樣品Mhp檢出率下降的主要原因。對于不同生產(chǎn)階段的豬群，從斷奶仔豬到保育豬、育肥豬、屠宰豬、后備豬，鼻拭子樣品的抗原陽性率從0逐步提升至100%，隨后到種豬有所下降，這與Mhp的感染規(guī)律與動力學(xué)是一致的[25]。本研究結(jié)果提示，臨床上用定量PCR方法對Mhp的感染進(jìn)行活體監(jiān)測時(shí)，考慮樣品采集的便利性與穩(wěn)定性，鼻拭子樣品是最理想的檢測樣品，育肥后期至屠宰階段以及后備階段是豬群檢出率最高的時(shí)期。

根據(jù)鼻拭子樣品中Mhp黏膜sIgA抗體與抗原的分泌規(guī)律來看，斷奶仔豬或小日齡豬群、保育豬直至屠宰豬群的Mhp黏膜sIgA抗體檢出率要高于抗原檢出率，而后備豬群中Mhp抗原檢出率要高于Mhp黏膜sIgA抗體的檢出率。該研究結(jié)果說明，黏膜sIgA抗體轉(zhuǎn)陽要顯著早于排毒，但黏膜sIgA抗體在后備豬中持續(xù)性較弱。由此可建議，在針對養(yǎng)殖場的Mhp感染率監(jiān)測時(shí)，推薦商品豬群以檢測Mhp黏膜sIgA抗體為主，后備和種豬群以檢測Mhp抗原為主。

綜上，考慮到在實(shí)際生產(chǎn)的大群體采樣中，喉拭子和咽拭子樣本由于受到輔助采樣裝備缺乏、采集人員的熟練程度、采樣時(shí)效性及拭子材料不同等因素的影響和限制，可能會帶來檢測結(jié)果的偏差。鼻拭子樣品在本研究中被證明可實(shí)現(xiàn)不同生產(chǎn)階段豬群的Mhp黏膜sIgA抗體和抗原通用性檢測，同時(shí)具有樣品易采集、采樣簡單、樣品可靠等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)已形成了標(biāo)準(zhǔn)化的采樣操作程序，在實(shí)際生產(chǎn)中更具臨床可操作性。為了提高檢測敏感性與準(zhǔn)確度，對于不同生產(chǎn)階段的豬群應(yīng)選擇性采用抗原或黏膜sIgA抗體的檢測手段。