顏賽娜，楊岸奇，唐湘薇，陳楚杰，尹艷飛，向嬌嬌，馬佳佳，冉茂良*，陳斌*

(1. 湖南農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，湖南 長沙 410128；2. 畜禽遺傳改良湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128)

支持細胞(Sertoli cells)分布于睪丸曲細精管上皮細胞管壁上偏基膜側(cè)，在睪丸細胞中體積最大且形狀不均勻[1]。該細胞最明顯特征是可以通過分泌繆勒管激素抑制因子(mullerian inhibiting factor)，在胚胎確定為雄性后阻礙雌性器官發(fā)育[2]。此外，支持細胞具有分泌抑制素B(inhibin b)、活化素(activin)、雄激素結(jié)合蛋白(androgen binding protein，ABP)的功能[3-5]，這些物質(zhì)對于睪丸發(fā)育和性成熟具有重要作用。睪丸中每個成熟的支持細胞可以為30～50個生殖細胞提供營養(yǎng)支持[6]。哺乳動物睪丸體積大小及產(chǎn)生精子能力與睪丸支持細胞的數(shù)量呈正相關(guān)[7]。成熟的支持細胞不具備增殖能力，在成熟睪丸中數(shù)量相對穩(wěn)定[8]，其最終數(shù)量取決于未成熟時的增殖活性。說明睪丸未成熟支持細胞的增殖活性對種公畜繁殖性能和養(yǎng)殖效益具有重要影響。

未成熟支持細胞的增殖受到激素、信號通路、基因等多方面的調(diào)控。本課題組前期研究鑒定出在睪丸發(fā)育過程中受3′UTR甲基化水平正向調(diào)控的樞紐基因，如INHBA(inhibin subunit beta A)、SMAD6和TGFB3(transforming growth factor beta 3)等，其中INHBA基因已被驗證能影響支持細胞增殖活性[9]。但SMAD6在睪丸發(fā)育過程中的生物學功能尚未被發(fā)掘。因此，本研究旨在探明SMAD6對豬未成熟支持細胞增殖及凋亡的影響，為睪丸發(fā)育和精子生成中的分子調(diào)控作用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)

豬睪丸細胞系(ST)ATCC?CRL-1746TM購自上海安為生物科技有限公司，已證實為純度接近100%的豬未成熟支持細胞[10]，并已應(yīng)用于相關(guān)研究[11-12]。細胞完全培養(yǎng)基為：高糖DMEM∶胎牛血清∶雙抗(Penicillin-Streptomycin)=10∶1∶0.1，各成分均來自美國Gibco公司。細胞培養(yǎng)條件為：在有一定濕度、溫度為37 ℃及含5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 SMAD6過表達載體構(gòu)建和SMAD6干擾RNA合成

SMAD6過表達質(zhì)粒(OE-SMAD6)以NheⅠ和KpnⅠ為酶切位點、以pcDNA3.1(+)-EGFP為載體(氨芐抗性)在武漢金開瑞生物工程有限公司設(shè)計并合成。SMAD6干擾RNA(SMAD6 siRNA)由廣州銳博生物技術(shù)有限公司設(shè)計并合成，干擾序列見表1。

表1 SMAD6 siRNA序列

1.3 細胞轉(zhuǎn)染

細胞接種于6孔板中，融合度達60%～80%時，吸棄完全培養(yǎng)基，每孔加入1 mL的PBS潤洗2遍；向每孔加入1 mL不含血清和雙抗的高糖DMEM，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h。OE-SMAD6組和對照組(NC)每孔準備2管125 μL的DMEM，一管加入9 μL Lipofectamine?2000(美國Invitrogen公司)，另一管分別加入OE-SMAD6和pcDNA3.1(+)-EGFP空載(NC)質(zhì)粒，2管分別充分混勻后，室溫靜置5 min；將2管試劑混合成1管并充分混勻，室溫靜置30 min后加入細胞培養(yǎng)液中。干擾SMAD6表達組和對照組每孔準備1管120 μL的DMEM，分別加入5 μL的SMAD6 siRNA和siRNA NC，充分混勻后室溫靜置5 min；加入12 μL Lipofectamine?2000，充分混勻，室溫靜置30 min后加入細胞培養(yǎng)液中。以上每組設(shè)置3個重復(fù)，每個重復(fù)1個孔，轉(zhuǎn)染培養(yǎng)6 h后更換為完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至一定狀態(tài)后進行后續(xù)試驗。

1.4 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)

細胞在6孔板中轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，采用TRIzol(美國Thermo公司)提取細胞總RNA，核酸/蛋白濃度測定儀(Nan Drop ND-2000，美國Themo Scientific公司)測定RNA濃度并檢測總RNA質(zhì)量；使用Prime ScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒(日本TaKaRa公司)進行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA；引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物信息見表2。使用SYBR?PremixExTaqTMⅡ試劑盒(日本TaKaRa公司)進行RT-qPCR；配制RT-qPCR反應(yīng)液，反應(yīng)體系為：7.5 μL TB-GreenⅡ?PremixExTaqTM(2×)、0.6 μL上游引物、0.6 μL下游引物、1 μL cDNA和5.3 μL ddH2O；CFX Connect實時熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)上進行RT-qPCR反應(yīng)，反應(yīng)程序為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，39次循環(huán)；95 ℃ 10 s；65～95 ℃ 每0.5 ℃進行1次熒光監(jiān)測。ACTB為內(nèi)參基因，每個樣品設(shè)置3個重復(fù)孔。采用2-ΔΔCt公式計算基因的相對表達水平。

表2 引物信息

1.5 細胞增殖檢測

細胞轉(zhuǎn)染后按照CCK-8試劑盒和EdU試劑盒(上海百賽生物技術(shù)股份有限公司)說明書操作，接種于96孔板，檢測細胞增殖情況。CCK-8檢測：分別于0、24、48、72 h向每孔加入10 μL CCK-8試劑，置于培養(yǎng)箱孵育4 h，在450 nm波長下檢測每孔細胞的吸光度值，以0 h作為對照，計算24、48、72 h各組細胞的相對增殖率。EdU檢測：96孔板培養(yǎng)24 h后，每孔加入50 μmol/L EdU試劑100 μL，置于培養(yǎng)箱孵育2 h，按照EdU試劑盒使用說明書進行細胞固定、Apollo染色和DNA染色，隨后熒光顯微鏡下拍照。

1.6 細胞ATP水平測定

細胞在6孔板中轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，吸棄培養(yǎng)基，1 mL PBS清洗2次，每孔加入200 μL ATP試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)中的ATP裂解液，冰上裂解5 min，收集裂解產(chǎn)物，4 ℃、15 000 r/min離心5 min，后續(xù)按試劑盒說明書進行操作。

1.7 流式細胞凋亡檢測

細胞在6孔板中轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)12～24 h，用不含EDTA的胰酶消化并收集細胞沉淀于1.5 mL離心管中；使用Annexin V-Alexa Flour 647/PI Kit凋亡檢測試劑盒(北京四正柏生物科技有限公司)對細胞沉淀進行染色：Binding Buffer、Annexin V-FITC和Propidium Iodide按比例混合，每管細胞沉淀加入200 μL混合液，渦旋混勻，室溫下避光孵育20 min；流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.8 Western blot檢測

細胞在6孔板中轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細胞；加入含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)裂解細胞獲取蛋白；用Bradford蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)測定蛋白濃度；蛋白樣品變性后按照12 μg每孔加入10%的SDS-PAGE凝膠[翌圣生物科技(上海)股份有限公司]中進行電泳；200 mA轉(zhuǎn)膜1 h；PVDF膜置于孵育盒中，加入10 mL快速封閉液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)封閉30 min；去除封閉液，加入10 mL一抗室溫孵育2 h，4 ℃孵育過夜，一抗包括：β-actin(1∶2 000，美國Proteintech Group公司)，SMAD6(1∶500，北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，BAX(1∶1 000，美國Proteintech Group公司)，Caspase3(1∶1 000，美國Cell Signaling Technology公司)；回收一抗，加入10 mL二抗室溫孵育2～4 h，二抗包括辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(1∶1 000，上海碧云天生物技術(shù)有限公司)和辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG(1∶1 000，上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；去除二抗，ECL化學發(fā)光液(成都正能生物技術(shù)有限責任公司)孵育PVDF膜1 min后進行顯影。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有試驗中每個處理組各3個生物重復(fù)，即統(tǒng)計結(jié)果的每組樣本數(shù)為3。Image J軟件進行細胞計數(shù)；IBM SPSS Statistics 25進行統(tǒng)計分析，顯著性差異分析用t檢驗，數(shù)據(jù)以“均值±標準差”形式表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 OE-SMAD6和SMAD6 siRNA的轉(zhuǎn)染效果

為確定OE-SMAD6的轉(zhuǎn)染量和SMAD6 siRNA的轉(zhuǎn)染序列，分別將不同含量的OE-SMAD6、NC、3條不同序列的SMAD6 siRNA和siRNA NC轉(zhuǎn)染至豬未成熟支持細胞中，采用熒光激發(fā)觀察OE-SMAD6轉(zhuǎn)染情況，結(jié)果顯示，3 000 ng OE-SMAD6組中有較強熒光(圖1A)；采用RT-qPCR檢測SMAD6表達情況，結(jié)果顯示，3 000 ng OE-SMAD6的SMAD6相對表達量較高且極顯著高于NC組(P<0.01)(圖1B)，SMAD6 siRNA-1組的SMAD6相對表達量最低且極顯著低于siRNA NC組(P<0.01)(圖1C)；采用Western blot檢測SMAD6蛋白的表達情況，結(jié)果顯示，3 000 ng OE-SMAD6組的SMAD6蛋白相對表達量顯著高于NC組(P<0.05)(圖1D)，SMAD6 siRNA-1組的SMAD6蛋白相對表達量極顯著低于siRNA NC組(P<0.01)(圖1E)。以上結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染3 000 ng OE-SMAD6和SMAD6 siRNA-1后有效影響了豬未成熟支持細胞中SMAD6的表達，后續(xù)試驗將選擇3 000 ng作為OE-SMAD6的轉(zhuǎn)染量，選擇SMAD6 siRNA-1進行SMAD6 siRNA的轉(zhuǎn)染。

A. 轉(zhuǎn)染不同含量OE-SMAD6后細胞熒光圖(綠色為OE-SMAD6載體上EGFP在細胞內(nèi)的表達，標尺=100 μm)；

2.2 SMAD6促進豬未成熟支持細胞的增殖

為明確SMAD6對進豬未成熟支持細胞增殖的作用，在豬未成熟支持細胞中分別過表達SMAD6和干擾SMAD6的表達后檢測細胞增殖情況。采用RT-qPCR檢測周期相關(guān)基因(CCND1、CCNE1、CDK4和MYC)和增殖相關(guān)基因(EGF、FGF2、PCNA、和GDNF)的表達，結(jié)果顯示，過表達SMAD6后周期相關(guān)基因和增殖相關(guān)基因的相對表達水平均顯著或極顯著升高(P<0.05或P<0.01)(圖2A和B)，干擾SMAD6的表達后周期相關(guān)基因和增殖相關(guān)基因的相對表達水平均極顯著降低(P<0.01)(圖2C和D)；用CCK-8試劑盒檢測細胞增殖情況，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染OE-SMAD6后24 h時細胞增殖活性顯著升高(P<0.05)，轉(zhuǎn)染OE-SMAD6后48 h時極顯著升高(P<0.01)(圖2E)，轉(zhuǎn)染SMAD6 siRNA后48 h和72 h時細胞增殖活性均極顯著下降(P<0.01)(圖2F)；用EdU試劑盒對細胞進行染色，結(jié)果顯示，過表達SMAD6后EdU陽性細胞率極顯著升高(P<0.01)(圖2G)，干擾SMAD6的表達后EdU陽性細胞率則極顯著下降(P<0.01)(圖2H)。以上結(jié)果表明，SMAD6有促進豬未成熟支持細胞增殖的作用。

A、B. 轉(zhuǎn)染OE-SMAD6，RT-qPCR檢測細胞周期相關(guān)基因和增殖相關(guān)基因的相對表達量；C、D. 轉(zhuǎn)染SMAD6 siRNA，RT-qPCR檢測細胞周期相關(guān)基因和增殖相關(guān)基因的相對表達量；E、F. 分別轉(zhuǎn)染OE-SMAD6和SMAD6 siRNA，CCK-8試劑盒檢測細胞增殖倍數(shù)；G、H. 分別轉(zhuǎn)染OE-SMAD6 和SMAD6 siRNA 24 h后，EdU試劑盒檢測細胞增殖情況及統(tǒng)計結(jié)果(標尺=1 000 μm)。

2.3 SMAD6抑制豬未成熟支持細胞的凋亡

為明確SMAD6對進豬未成熟支持細胞凋亡的作用，在豬未成熟支持細胞中分別過表達SMAD6和干擾SMAD6的表達后檢測細胞凋亡情況。采用ATP檢測試劑盒測定細胞ATP水平，結(jié)果顯示，過表達SMAD6后細胞ATP水平極顯著升高(P<0.01)(圖3A)，干擾SMAD6的表達后細胞ATP水平則極顯著下降(P<0.01)(圖3B)；采用Western blot檢測促凋亡相關(guān)蛋白BAX和Caspase3的表達水平，結(jié)果的顯示，過表達SMAD6后BAX的表達顯著降低(P<0.05)，Caspase3的表達有所降低但不顯著(P=0.08)(圖3C)，干擾SMAD6表達后BAX和Caspase3的表達均顯著升高(P<0.05)(圖3D)；用流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡情況，結(jié)果顯示，過表達SMAD6后細胞凋亡率顯著下降(P<0.05)(圖3E)，干擾SMAD6表達后細胞凋亡率則顯著上升(P<0.05)(圖3F)。以上結(jié)果表明，SMAD6有抑制豬未成熟支持細胞凋亡的作用。

A、B. 分別為轉(zhuǎn)染OE-SMAD6和SMAD6 siRNA后細胞ATP水平；

3 討論

SMAD家族蛋白是由一系列SMAD家族基因編碼且結(jié)構(gòu)類似的功能性蛋白，主要作用為將TGF-β信號由細胞表面受體傳導至細胞核內(nèi)[13]。SMAD蛋白主要分為3類：①由SMAD1、SMAD2、SMAD3、SMAD5、SMAD8和SMAD9組成的通路限制性或受體活化型SMAD(R-SMAD)，其中SMAD2和SMAD3由TGF-β信號激活又稱為AR-SMAD，而其他R-SMAD由BMP(bone morphogenetic protein)信號激活可歸類為BR-SMAD[14]；②共同通路型SMAD(Co-SMAD)，目前已知的Co-SMAD僅包括SMAD4，主要作用為與R-SMAD共同招募調(diào)節(jié)因子，也是各類TGF-β家族信號傳導所必需的共同介質(zhì)[15]；③由SMAD6和SMAD7組成的抑制性SMAD(I-SMAD)[16]。 I-SMAD可以通過多種途徑以破壞TGF-β/BMP信號傳統(tǒng)，如I-SMAD保守MH2結(jié)構(gòu)域與1型受體結(jié)合而減少R-SMAD對上游信號的傳導，或者與激活的R-SMAD形成異構(gòu)復(fù)合物而抑制R-SMAD與Co-SMAD結(jié)合；另外I-SMAD還可以通過招募泛素連接酶以靶向降解激活的R-SMAD[17]。SMAD7能對各類TGF-β信號起到抑制作用，SMAD6則主要是對BMP信號進行抑制進而影響體內(nèi)多種細胞的增殖、分化與凋亡[18]。

眾多研究表明，SMAD6對細胞增殖有重要影響。Wang等[19]的研究表明，與正常細胞相比，視網(wǎng)膜母細胞瘤(retinoblastoma，RB)中SMAD6基因表達量顯著上調(diào)，但通過干擾BR細胞中SMAD6后發(fā)現(xiàn)BR細胞的增殖速度顯著降低。Lu等[20]發(fā)現(xiàn)在前列腺癌中HNF1B基因可以直接抑制SMAD6表達進而抑制細胞周期蛋白D1，造成癌細胞增殖速度下降。Wang等[21]使用BMP抑制劑LDN-193189 (LDN)處理胚胎生殖細胞后，細胞中SMAD6基因的表達被完全抑制，并且細胞停滯在有絲分裂期。以上研究說明SMAD6對某些細胞的增殖具有促進作用。本研究也出現(xiàn)類似的結(jié)果，在體外培養(yǎng)的豬未成熟細胞中分別過表達SMAD6和干擾SMAD6表達后檢測細胞增殖情況，發(fā)現(xiàn)SMAD6對豬未成熟支持細胞的增殖有正向促進作用。

SMAD6對細胞凋亡有重要影響。Jeon等[22]研究表明，SMAD6的敲低激活了c-Jun NH2末端激酶途徑并減少了Rb-1的磷酸化，導致肺癌細胞系H1299凋亡增加。Wu等[23]研究發(fā)現(xiàn)，miR-186靶向SMAD6通過絲裂原活化蛋白激酶 (MAPK)激活誘導人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)的凋亡。Xu等[24]同樣研究發(fā)現(xiàn)，SMAD6作為miR-186的靶標其表達受到抑制而促進膠質(zhì)瘤U87細胞的凋亡。上述研究結(jié)果表明，SMAD6對某些細胞的凋亡具有抑制作用。本研究結(jié)果也與之一致，即在體外培養(yǎng)的豬未成熟細胞中分別過表達SMAD6和干擾SMAD6表達后檢測細胞凋亡情況，發(fā)現(xiàn)SMAD6對豬未成熟支持細胞的凋亡有抑制作用。