方劍玉，張青嫻，郎利敏，徐 彬，2，王改利，2，席燕燕，2，馮現(xiàn)明，王克領(lǐng)，李紹鈺，2

（1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，河南 鄭州 450002；2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜禽繁育與營養(yǎng)調(diào)控河南省重點實驗室，河南 鄭州 450002；3.林州市動物疫病預(yù)防控制中心，河南 林州 456550）

我國是世界生豬第一生產(chǎn)與消費大國，豬的規(guī)模化養(yǎng)殖在我國呈現(xiàn)持續(xù)穩(wěn)步增長，隨之而來的豬病毒性傳染病也成為困擾我國養(yǎng)豬業(yè)的一大難題，嚴(yán)重威脅著養(yǎng)豬業(yè)的健康、綠色、可持續(xù)發(fā)展。豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征 病 毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的以母豬流產(chǎn)和仔豬呼吸道癥狀為主要特征的高度接觸性傳染病[1]。PRRSV 屬于尼多病毒目（Nidovirales）、動脈炎病毒科（Arteriviridae）、動脈炎病毒屬（Arterivirus），該病毒感染后可破壞豬的肺泡巨噬細(xì)胞（Porcine alveolar macrophages，PAM），造成豬的免疫抑制，極易引起其他病原體的繼發(fā)感染[2-3]。目前，PRRS 已成為危害我國養(yǎng)豬業(yè)的重要動物疫病之一，而且目前預(yù)防該病的商品疫苗效果并不理想。因此，研發(fā)低毒高效且無生物殘留的新型抗PRRSV藥物，已經(jīng)成為目前養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的當(dāng)務(wù)之急。

干擾素（Interferon，IFN）是一種由細(xì)胞產(chǎn)生的具有抗病毒、抗細(xì)胞增殖及免疫調(diào)節(jié)作用的分泌性糖蛋白。干擾素可用于多種病毒病的治療，如乙型肝炎[4]、丙型肝炎[5]、人免疫缺陷病[6-7]、豬流行性腹瀉[8]、非洲豬瘟[9]等。病毒感染機體后誘導(dǎo)干擾素產(chǎn)生，識別細(xì)胞干擾素受體后，通過一系列信號級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)數(shù)百個干擾素下游基因（ISG）轉(zhuǎn)錄，從而發(fā)揮其抗病毒作用[10]。根據(jù)干擾素的分子結(jié)構(gòu)與受體相結(jié)合的方式，可將其分為Ⅰ型（IFN-α、FN-β、IFN-ε、FN-κ和IFN-ω）、Ⅱ型（IFN-γ）和Ⅲ型（IFNλ）[11]。其中IFN-α 是最重要的Ⅰ型干擾素，研究證明，IFN-α 干擾素抗病毒活性最強。豬干擾素α（poIFN-α）包括17 個亞型，且不同亞型poIFN-α 的抗病毒活性差異較大[12-13]。有研究報道，poIFN-α能有效抑制PRRSV的感染和復(fù)制，但具體到各個亞型對PRRSV 感染的抑制效果，目前尚未見報道。因此，明確不同亞型poIFN-α 對PRRSV 的抗病毒活性，篩選對PRRSV 具有最強抗病毒活性的poIFN-α亞型，在PRRS 預(yù)防和治療上具有重要意義。前人研究表明，真核系統(tǒng)表達(dá)的重組豬干擾素α8（poIFN-α8）在牛腎細(xì)胞（Bovine kidney cell，MDBK）上對豬偽狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）具有較好的抗病毒活性[14]。采用基因工程方法制備的重組干擾素，克服了傳統(tǒng)干擾素表達(dá)量低、時間長等缺點。與真核表達(dá)系統(tǒng)相比，原核表達(dá)系統(tǒng)具有培養(yǎng)方法簡單迅速、經(jīng)濟、適合大規(guī)模生產(chǎn)工藝等優(yōu)點，商業(yè)化的干擾素產(chǎn)品多采用原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行生產(chǎn)。目前，采用原核系統(tǒng)表達(dá)重組IFN-α8 的抗病毒活性研究未見報道。鑒于此，首次采用原核表達(dá)系統(tǒng)對poIFN-α8 進(jìn)行表達(dá)，用Ni-瓊脂糖凝膠純化柱純化后，在豬肺泡巨噬細(xì)胞（PAM）細(xì)胞上測定重組蛋白對PRRSV 的抗病毒活性及其對ISG 的誘導(dǎo)水平，旨在為新型抗PRRSV藥物的研發(fā)提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要材料

PAM 分 離 自4～6 周 齡 的SPF 仔 豬，PRRSV BB0907 株由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院惠贈，含His-Tag的溫控型原核表達(dá)載體pCSMH和重組豬干擾素α2（poIFN-α2）蛋白、豬干擾素α5（poIFN-α5）蛋白由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所獸醫(yī)實驗室制備并保存[15]。

1.2 主要試劑

預(yù)染蛋白質(zhì)Marker、氨芐青霉素（Ampicillin）、DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)液、Ni-NTA 瓊脂糖凝膠、尿素、鹽酸胍購自北京索萊寶科技有限公司；DH5α 感受態(tài)細(xì)胞、XhoⅠ和BamH Ⅰ限制性內(nèi)切酶、Ni-瓊脂糖凝膠純化柱購自TAKARA 生物工程有限公司；核酸提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑HiScriptⅢRT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）、SYBR Green Real-time PCR Master Mix 試劑盒、T4 連接酶均購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；鼠源抗豬IFN-α 多克隆抗體購自武漢云克隆科技股份有限公司；羊抗鼠熒光二抗（IRDye?680RD）購自美國LI-COR 公司；BCA 蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術(shù)公司；蛋白質(zhì)濃縮柱購自LABSELECT 公司；RNA 提取試劑盒購自O(shè)MIGA公司。

1.3 重組表達(dá)質(zhì)粒pCSMH-poIFN-α8的構(gòu)建

poIFN-α8基因序列（GenBank ID:GQ415068）用DNAStar 軟件分析后，去掉N 端69 bp 的信號肽序列，由浙江尚亞生物技術(shù)有限公司進(jìn)行合成。將合成的poIFN-α8基因和pCSMH 空載體用XhoⅠ和BamH Ⅰ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，經(jīng)膠回收純化后，用T4 連接酶在16 ℃連接15 min。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒，用XhoⅠ和BamH Ⅰ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切鑒定，將雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。將鑒定的陽性質(zhì)粒送浙江尚亞生物工程有限公司進(jìn)行測序，將重組質(zhì)粒命名為pCSMH-poIFN-α8。

1.4 重組IFN-α8蛋白的表達(dá)及分離純化

將陽性單克隆菌落接種至含50 μg/mL 氨芐青霉素的LB 培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)，30 ℃條件下180 r/min振蕩培養(yǎng)至菌液OD600在0.6～0.8。進(jìn)一步將菌液轉(zhuǎn)移至42 ℃條件下，進(jìn)行溫度誘導(dǎo)，200 r/min 振蕩培養(yǎng)6 h；收集菌體，6 000 r/min 離心15 min，棄上清，加入PBS 緩沖液（pH=7.0）洗滌菌體，重復(fù)清洗一次；按照菌體∶溶解Buffer（50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，pH=8.0）=1∶10 將菌體懸浮混勻，加入1 mmol/L PMSF 和0.2～0.4 mg/mL 溶菌酶，冰上孵育20 min。將菌體用超聲破碎儀破碎25 min，超聲5 s 間歇5 s，至菌液澄清。將破碎后菌液轉(zhuǎn)移至離心管中，4 ℃條件下12 000 r/min離心20 min，棄上清，用菌體裂解液（50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，6 mol/L guanidine hydrochloride，pH=8.0）將包涵體進(jìn)行溶解變性，采用Ni-瓊脂糖凝膠純化柱按照說明書對重組poIFN-α8 蛋白進(jìn)行分離純化，采用濃縮柱進(jìn)行脫鹽復(fù)性處理后，用BAC 蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒測定目的蛋白濃度，最后采用SDSPAGE電泳對純化后的目的蛋白進(jìn)行檢測。

1.5 Western blot 試驗鑒定重組poIFN-α8反應(yīng)原性

采用Western blot 試驗鑒定純化后的重組poIFN-α8 蛋白，將純化后的重組poIFN-α8 蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，將電泳后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印醋酸纖維素膜（NC），23 V 電壓轉(zhuǎn)印30 min。NC 膜用含10%脫脂乳的PBST（10 mmol/L Na2HPO4，2 mmol/L KH2PO4，137 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，0.5%吐溫-20）過夜封閉后，加入1∶1 000 稀釋的鼠源抗豬干擾素的抗體進(jìn)行特異性反應(yīng)，用TBST 洗膜3 次，加入羊抗鼠熒光二抗（IRDye?680RD），進(jìn)行顯色反應(yīng)。

1.6 重組poIFN-α8抗PRRSV活性測定

1.6.1 實時熒光定量PCR 引物的設(shè)計及合成 根據(jù)GenBank 中 登 錄 的OSA1、ISG15、MX1、PRRSVORF7、β-actin基因序列，利用軟件Oligo 7 設(shè)計實時熒光定量PCR 引物，其引物序列信息見表1，引物由浙江尚亞生物技術(shù)有限公司進(jìn)行合成。

表1 實時熒光定量PCR引物序列Tab.1 Sequences of the primers used in real-time fluorescence quantitative PCR

1.6.2 重組poIFN-α8抑制PRRSV 增殖試驗 用含2%胎牛血清（Fatal bovine serun，F(xiàn)BS）的DMEM 將獲得的重組干擾素稀釋成相應(yīng)質(zhì)量濃度[12]。將PAM 細(xì)胞接種至24 孔板，每孔2×105個細(xì)胞，待細(xì)胞鋪滿單層后，分別加入0.01、0.05、0.1、1 ng/mL 的重組poIFN-α8，同時設(shè)置未處理對照組（CK）。24 h后接種1 000 TCID50的PRRSV，感染24 h 后收集細(xì)胞，采用實時熒光定量PCR方法檢測細(xì)胞內(nèi)PRRSV的RNA 水平。首先采用OMIGA 公司的RNA 提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，利用HiScript ⅢRT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄體系：8 μL 提取的RNA（總RNA 不超過500 ng）及2 μL 5×qRT SuperMix Ⅱ。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)過程：25 ℃10 min，50 ℃30 min，85 ℃5 min。合成的cDNA 用SYBR Green Real-time PCR Master Mix預(yù)混酶在ABI公司7300型全自動熒光定量PCR儀上進(jìn)行實時熒光定量PCR 擴增反應(yīng)，同時β-actin基因作為內(nèi)參。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃5 min；95 ℃10 s，60 ℃30 s，共40個循環(huán)；反應(yīng)結(jié)束后利用ABI 7300 軟 件 分 析 數(shù) 據(jù)，采 用2-ΔΔCt法 進(jìn) 行 相 對 定量[16]。同時，收集細(xì)胞上清，檢測上清中PRRSV 的TCID50[17]。進(jìn)一步比較poIFN-α8 與poIFN-α2、poIFN-α5在PAM 上 的 抗PRRSV 活 性，將0.05 ng/mL 的poIFN-α2、poIFN-α5、poIFN-α8 分別處理PAM（未處理組為CK），24 h 后接種1 000 TCID50PRRSV，感染24 h 后，收集細(xì)胞，采用熒光定量PCR 方法檢測細(xì)胞內(nèi)PRRSV 的RNA 水平。同時，收集細(xì)胞上清，檢測細(xì)胞上清中PRRSV的TCID50。

1.6.3 重組poIFN-α8 對細(xì)胞ISG 的激活作用試驗 將PAM 細(xì)胞接種24 孔板，每孔2×105個細(xì)胞，24 h 待細(xì)胞長成單層后，加入0.1 ng/mL 的重組poIFN-α8處理PAM細(xì)胞，同時設(shè)置空白對照（CK）。24 h 后收集細(xì)胞，采用實時熒光定量PCR 的方法檢測細(xì)胞內(nèi)干擾素刺激基因Mx1、OAS1、ISG15的mRNA水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒pCSMH-poIFN-α8的鑒定

將poIFN-α8基因序列合成后，克隆入含His-Tag 的真核表達(dá)載體pCSMH，獲得重組質(zhì)粒pCSMH-poIFN-α8，經(jīng)XhoⅠ和BamH Ⅰ雙酶切鑒定，結(jié)果如圖1 所示，在大小3 800 bp 和545 bp 位置有特異性條帶，與預(yù)期目的片段大小相符，對酶切產(chǎn)物進(jìn)行測序，采用DNAStar軟件進(jìn)行比對分析，結(jié)果證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2 重組poIFN-α8蛋白在大腸桿菌的誘導(dǎo)表達(dá)和純化

離心收集溫度誘導(dǎo)后的菌體，隨后使用Ni-瓊脂糖凝膠純化柱純化poIFN-α8 蛋白，樣品經(jīng)SDSPAGE 分析后，結(jié)果如圖2 所示。從圖2 可以看出，在19.1 ku 的位置可觀察到高純度的重組蛋白目的條帶，與預(yù)期相符。

圖2 純化后的poIFN-α8蛋白SDS-PAGE電泳結(jié)果Fig.2 SDS-PAGE analysis of purified poIFN-α8 protein

2.3 Western blot鑒定重組poIFN-α8蛋白

從圖3 可以看出，poIFN-α8 重組蛋白在預(yù)期位置出現(xiàn)了相應(yīng)的特異性條帶，poIFN-α8重組蛋白可與鼠源抗豬干擾素的抗體進(jìn)行特異性反應(yīng)，證明本試驗表達(dá)蛋白具有良好的反應(yīng)原性。

圖3 重組poIFN-α8蛋白Western blot鑒定結(jié)果Fig.3 Western blot identification of recombinant poIFN-α8 protein

2.4 重組poIFN-α8蛋白活性測定結(jié)果

2.4.1 重組poIFN-α8 抑制PRRSV 增殖試驗結(jié)果

從圖4A 可以看出，0.05 ng/mL 重組poIFN-α8 處理PAM 細(xì)胞，顯著抑制了PRRSV 的RNA 復(fù)制。而0.01 ng/mL重組poIFN-α8處理細(xì)胞后，PRRSV RNA在細(xì)胞內(nèi)仍維持較高水平。同時，從圖4B 可以看出，在 接 種1 000 TCID50的PRRSV 24 h 后，0.05 ng/mL 重組poIFN-α8 處理細(xì)胞，細(xì)胞上清中病毒拷貝數(shù)相比對照組顯著下降，而0.01 ng/mL 重組poIFN-α8 處理細(xì)胞，細(xì)胞上清中PRRSV 的病毒拷貝數(shù)相比對照組下降較少。同時比較0.05 ng/mL的重組poIFN-α2、poIFN-α5、poIFN-α8 在PAM 上的抗PRRSV 復(fù)制作用（圖4C、D），poIFN-α8 的抗PRRSV 效果顯著優(yōu)于poIFN-α2、poIFN-α5，0.05 ng/mL 重組poIFN-α8 在PAM 細(xì)胞上對PRRSV 具有最優(yōu)的抑制活性。

圖4 重組蛋白poIFN-α8抑制PRRSV復(fù)制效果Fig.4 Antiviral effect of recombinant poIFN-α8 against PRRSV

2.4.2 重組poIFN-α8 蛋白對細(xì)胞ISG 的激活試驗結(jié)果 圖5 結(jié)果顯示,與未處理細(xì)胞組相比，0.1 ng/mL poIFN-α8 處理組Mx1、OAS1、ISG15基因mRNA 水平顯著升高，證明重組蛋白poIFN-α8誘導(dǎo)了PAM 內(nèi)干擾素下游基因的上調(diào)表達(dá)，從而發(fā)揮抑制PRRSV復(fù)制的作用。同時，對比了重組poIFN-α2、poIFN-α5、poIFN-α8 對下游基因的誘導(dǎo)活性，結(jié)果顯示，重組poIFN-α8在細(xì)胞上誘導(dǎo)ISG 的水平高于poIFN-α2、poIFN-α5處理組。

圖5 重組poIFN-α8處理PAM細(xì)胞后ISG基因上調(diào)結(jié)果Fig.5 Up-regulation of ISGs gene induced by recombinant poIFN-α8 in PAM cells

3 結(jié)論與討論

天然免疫系統(tǒng)是宿主抵抗病原體感染的第一道防線。當(dāng)病毒感染動物機體后，干擾素作為抗病毒因子之一，在很短時間內(nèi)便可迅速達(dá)到峰值[18]。已有研究證明豬的Ⅰ型干擾素在針對PRRSV 感染的抗病毒免疫中發(fā)揮了重要的作用，poIFN-α 已應(yīng)用于PRRSV 感染的臨床治療[19-21]。poIFN-α 干擾素具有17個亞型，各亞型針對不同病毒的抗病毒活性差異較大[14，22]。有研究報道，真核系統(tǒng)表達(dá)的poIFN-α8 對豬偽狂犬病毒（PRV）有較好的抗病毒活性[14]，但真核表達(dá)系統(tǒng)由于表達(dá)量低、成本高等特點，較難應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。此外，前期研究結(jié)果也表明，原核表達(dá)的重組poIFN-α2 蛋白能有效抑制PRRSV 在Marc-145 和PAM 細(xì)胞上的復(fù)制[15]。為了明確原核表達(dá)的poIFN-α8蛋白對PRRSV 的抗病毒活性，比較不同亞型poIFN-α對PRRSV 的抑制作用。本研究采用原核表達(dá)系統(tǒng)溫度誘導(dǎo)表達(dá)poIFN-α8 蛋白，處理PAM 細(xì)胞后，采用實時熒光定量PCR 的方法檢測細(xì)胞內(nèi)PRRSV 病毒的RNA 水平，與無干擾素處理感染組相比，poIFN-α8 處理細(xì)胞內(nèi)PRRSV RNA水平顯著下降，結(jié)果證明poIFN-α 8 顯著抑制了PRRSV 在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制。此外，從本研究結(jié)果來看，poIFN-α8 的抗病毒活性高于poIFN-α2、poIFN-α5 等 亞 型 的 干 擾 素。盡 管poIFN-α8 與poIFN-α2、poIFN-α5 等亞型的核苷酸和氨基酸序列同源性高達(dá)95%以上，但其在細(xì)胞上抑制PRRSV復(fù)制的能力卻存在較大差異，分析該差異可能與不同亞型poIFN-α 誘導(dǎo)ISG 的水平和與受體結(jié)合的能力相關(guān)。

與真核和酵母表達(dá)系統(tǒng)相比，原核表達(dá)系統(tǒng)具有表達(dá)量高、表達(dá)蛋白活性好、成本低、易于純化、便于工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點[23-24]，本研究獲得的原核表達(dá)重組poIFN-α8 的抗病毒效價為0.05 ng/mL，高于HUANG 等[25]用酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的poIFN-α 的抗病毒效價，低于SANG 等[26]以真核系統(tǒng)表達(dá)的poIFN-α6 在Marc-145 細(xì)胞上針對PRRSV 的抗病毒效價（0.02 ng/mL）。本研究結(jié)果表明，原核表達(dá)的poIFN-α8 對PRRSV 具有較好的抗病毒效果，為抗PRRSV藥物的篩選提供了數(shù)據(jù)。

IFN識別細(xì)胞上的干擾素受體，誘導(dǎo)ISG的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，從而發(fā)揮抗病毒作用。本研究將poIFN-α2、poIFN-α5、poIFN-α8接種PAM 細(xì)胞，檢測了不同亞型poIFN-α 干擾素誘導(dǎo)下游基因Mx1、OAS1、ISG15轉(zhuǎn)錄的水平，研究結(jié)果表明，poIFN-α2、poIFN-α5、poIFN-α8 在PAM 細(xì)胞上誘導(dǎo)下游ISG 轉(zhuǎn)錄的水平與其抑制PRRSV復(fù)制的效果基本一致?？梢姡煌瑏喰蚿oIFN-α 誘導(dǎo)細(xì)胞ISG 轉(zhuǎn)錄的能力與其抗PRRSV 的效果具有重要的相關(guān)性。以前對于不同亞型poIFN-α 抗病毒活性差異的研究相對較少，在臨床上盲目用一種亞型poIFN-α 治療病毒感染的效果并不理想。明確不同亞型poIFN-α 的抗病毒活性，對于提高干擾素臨床治療PRRS 的效果具有重要意義。

本研究結(jié)果表明，通過原核表達(dá)系統(tǒng)制備的重組poIFN-α8 蛋白活性高、易于純化生產(chǎn)、成本低，對PRRSV 具有較好的抗病毒活性，為PRRS 的防治提供了新的數(shù)據(jù)和資料。