王天一 祁江晗 張珊苑 何晨晨 褚劍鋒，2▲

心臟是高血壓最常見的靶器官損害之一，長期高血壓導(dǎo)致心肌細(xì)胞代償性增殖，間質(zhì)細(xì)胞分泌增多[1-2]，導(dǎo)致心肌肥厚和間質(zhì)纖維化，最終發(fā)生心室重構(gòu)[3]。因此，降低血壓、抑制心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展是防治高血壓心肌肥厚的有效途徑，是降低其他心血管疾病患病率和死亡率的關(guān)鍵所在。p38絲裂原活化蛋白激 酶（p-38 Mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK）是細(xì)胞內(nèi)的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，調(diào)控細(xì)胞增殖與肥大[4]，充當(dāng)“信息開關(guān)”的作用，對(duì)心肌肥厚有著非常重要的作用[5]。

清達(dá)顆粒由天麻、鉤藤、黃芩和蓮子心組成，全方共奏平肝潛陽、清泄心火的功效，是陳可冀院士臨床經(jīng)驗(yàn)方，主要用于治療新發(fā)1 級(jí)高血壓，臨床療效顯著。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，清達(dá)顆?？梢越档投喾N高血壓動(dòng)物模型的血壓，在改善高血壓導(dǎo)致的心肌肥厚及心肌纖維化，抑制心室重構(gòu)等方面療效顯著[6-9]，但具體機(jī)制尚未闡明。本實(shí)驗(yàn)評(píng)估了清達(dá)顆粒對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠血壓、心臟收縮功能和形態(tài)學(xué)、心臟重量指數(shù)、心肌肥厚指標(biāo)的影響，驗(yàn)證了清達(dá)顆粒通過p38 MAPK 通路抑制高血壓心肌肥厚的機(jī)制，為清達(dá)顆粒降低血壓、改善心肌肥厚提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物12 只5 w 齡無特定病原體（Specific Pathogen Free，SPF）級(jí)雄性自發(fā)性高血壓大鼠（Spontaneously Hypertensive Rat，SHR），6 只同周齡正常血壓（Wistar-Kyoto，WKY）大鼠，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司購入，動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK（京）2019-0009。動(dòng)物飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SYXK（閩）2009-0001]，自由進(jìn)食、飲水，飼養(yǎng)溫度與相對(duì)濕度恒定，晝夜交替時(shí)間各為12 h。

1.2 藥品與試劑清達(dá)顆粒由江陰天江藥業(yè)提供（批號(hào)：1704306）；蘇木素染色液（批號(hào)：G1140）、伊紅染色液（批號(hào)：G1100）購買于北京索萊寶科技有限公司；異氟烷（批號(hào)：970-00026-00）購買于深圳瑞沃德生命科技有限公司；組織總RNA 提取試劑盒（批號(hào)：RE-03011）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)：RT-01021）、qRTPCR 試劑盒（批號(hào)：QP-01011）購買于FOREGENE 公司；ANP 抗體（批號(hào)：PA5-79758）、BNP 抗體（批號(hào)：PA5-96084）、BCA 蛋白定量分析試劑盒（批號(hào)：23227）購買于美國Thermo Fisher Scientific 公司；pp38 MAPK 抗體（批號(hào)：4511S）、p38 MAPK（批號(hào)：8690S）、羊抗兔二抗（批號(hào)：7074S）購買于美國 CST 公司；GAPDH 抗體（批號(hào)：10494-1-AP）購買于美國Proteintech 公司；其他試劑購買于上海碧云天及美國MCE公司。

1.3 儀器Kent Scinetific CODA 八通道無創(chuàng)血壓測(cè)量儀（美國Kent Scientific公司）；Vero2100超高分辨率小動(dòng)物彩色超聲多普勒成像系統(tǒng)（加拿大Visual Sonics 公司）；生物自動(dòng)脫水儀及石蠟包埋機(jī)（湖北孝感亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司）；全自動(dòng)石蠟切片機(jī)（德國Leica 公司）；Nanodrop One 分光光度計(jì)（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；DM4000B顯微鏡（德國Leica 公司）；ChemiDoc MP Bio-Rad 凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司）；7500 Real time-PCR 儀（美國 ABI公司）。

1.4 動(dòng)物分組與給藥適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w 后，將自發(fā)性高血壓大鼠隨機(jī)分為模型組（SHR 組）和清達(dá)顆粒組（SHR+QDG組），每組6只；6只同周齡WKY大鼠作為對(duì)照組（WKY 組）。清達(dá)顆粒組按照0.9 g/（kg·d）將清達(dá)顆粒加入一定比例生理鹽水溶解，給予灌胃給藥；對(duì)照組和模型組給予等體積生理鹽水，每日1次，連續(xù)8 w。

1.5 無創(chuàng)尾動(dòng)脈加壓法測(cè)量血壓每周固定同一時(shí)間，采用無創(chuàng)尾動(dòng)脈加壓法測(cè)量血壓，記錄每只大鼠清醒狀態(tài)下尾動(dòng)脈的收縮壓（Systolic blood pressure，SBP）、舒張壓（Diastolic blood pressure，DBP）和平均動(dòng)脈壓（Mean arterial pressure，MAP），連續(xù)監(jiān)測(cè)8 w。

1.6 超聲心動(dòng)圖檢測(cè)末次給藥后，剔除胸部毛發(fā)，異氟烷吸入麻醉，采用Vero 2100 成像系統(tǒng)檢測(cè)大鼠心臟收縮功能變化。將探頭置于大鼠胸骨左緣，通過M 型心動(dòng)圖測(cè)量關(guān)鍵指標(biāo)，計(jì)算左心室射血分?jǐn)?shù)（left ventricle ejection fractions，LVEF）和左室短軸縮短率（left ventricle fractional shortening，LVFS），取連續(xù)3 個(gè)周期測(cè)量的平均值作為最終結(jié)果。

1.7 心臟重量指數(shù)計(jì)算經(jīng)腹主動(dòng)脈取血后取出大鼠心臟，切除心耳，清洗干凈后，水平方向橫切為三部分，中間部分置于4%多聚甲醛固定液中，心尖部分置于-80 ℃超低溫冰箱保存。稱量大鼠體重（body weight，BW），測(cè)量大鼠脛骨長度（tibial length，TL），計(jì)算得出大鼠心臟重量指數(shù)（Heart Weight Index，HWI）。計(jì)算公式：HWI=BW/TL。

1.8 HE 染色實(shí)驗(yàn)48 h 后，將放置于4%的多聚甲醛固定液中的心臟組織，經(jīng)脫水包埋后，采用全自動(dòng)石蠟切片機(jī)制備4 μm石蠟切片，將切片脫蠟，用于蘇木精-伊紅（HE）染色，封片后在顯微鏡下拍攝。

1.9 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantititive reverse transcription，qRT-PCR）檢測(cè)心臟組織心房鈉尿肽（Atrial natriuretic peptide，ANP）、腦利鈉肽（Brain natriuretic peptide，BNP）的mRNA 表達(dá)提取各組大鼠心臟組織mRNA，逆轉(zhuǎn)錄純化的mRNA，合成cDNA。根據(jù)說明書進(jìn)行qRT-PCR 分析。以GAPDH 為內(nèi)參，引物序列見表1。采用2-ΔCt相對(duì)定量方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析：ΔCt(實(shí)驗(yàn)組/對(duì)照組)=Ct(實(shí)驗(yàn)組/對(duì)照組目標(biāo)基因)-Ct(實(shí)驗(yàn)組/對(duì)照組內(nèi)參基因)。

表1 mRNA引物序列

1.10 Western Blot 檢測(cè)心臟組織ANP、BNP、p38 MPAK 以及p-p38 MPAK 蛋白的表達(dá)取出-80 ℃保存的心臟組織，每100 mg 加入1 mL Werstern 及IP裂解液（裂解液中含有1×Cocktail、1×Phosstop 和10×PMSF），震蕩渦旋、裂解、離心后，取上清液，采用BCA法定量蛋白濃度。配制SDS-PAGE凝膠，固定于電泳槽中，恒壓90 v，30 min；120 v，1 h 進(jìn)行電泳。將凝膠放入轉(zhuǎn)膜夾，在轉(zhuǎn)膜槽中恒壓110 V轉(zhuǎn)膜。封閉后按照說明書稀釋比例分別孵育一抗（ANP、BNP、p38 MPAK、p-p38 MPAK）、羊抗兔二抗后，使用Image Lab凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光，應(yīng)用Image J 軟件進(jìn)行定量分析。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，所有數(shù)值均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s），兩組比較時(shí)，首先判斷是否符合正態(tài)分布，符合時(shí)采用t檢驗(yàn)；三組比較時(shí)，同樣先判斷是否符合正態(tài)分布，符合時(shí)采用單因素方差分析。不符合正態(tài)分布時(shí)，采用非參數(shù)檢驗(yàn)。P＜0.05表明差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 清達(dá)顆粒對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠血壓和體重的影響每周血壓監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，與WKY 組相比，SHR 組SBP、DBP 和MAP 均顯著升高（P＜0.05）。給藥第3 w開始，與SHR 組相比，SHR+QDG 組SBP、DBP 和MAP均顯著降低（P＜0.05）。同時(shí)，每周稱量體重發(fā)現(xiàn)清達(dá)顆粒對(duì)大鼠體重?zé)o明顯影響（P＞0.05）。結(jié)果表明，清達(dá)顆粒降低自發(fā)性高血壓大鼠血壓且對(duì)體重?zé)o影響。見圖1。

圖1 清達(dá)顆粒對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠血壓和體重的影響

2.2 清達(dá)顆粒對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠心臟重量指數(shù)的影響計(jì)算各組大鼠心臟重量指數(shù)，即心臟重量與脛骨長度的比值。與WKY 組相比，SHR 組心臟重量指數(shù)顯著升高（P＜0.05）；與SHR組相比，SHR+QDG組心臟重量指數(shù)顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果表明，清達(dá)顆?？梢越档妥园l(fā)性高血壓大鼠心臟重量指數(shù)。見圖2。

圖2 清達(dá)顆粒對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠心臟重量指數(shù)的影響

2.3 清達(dá)顆粒對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠心臟收縮功能的影響灌胃8 w 后，超聲心動(dòng)圖顯示，與WKY 組相比，SHR組射血分?jǐn)?shù)、短軸縮短率顯著降低（P＜0.05）；與SHR組相比，SHR+QDG組可以顯著抑制射血分?jǐn)?shù)、短軸縮短率的降低（P＜0.05）。結(jié)果表明，清達(dá)顆?？梢愿纳谱园l(fā)性高血壓大鼠心臟收縮功能。見圖3。

2.4 清達(dá)顆粒對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠心臟組織病理變化的影響心臟組織HE染色可發(fā)現(xiàn)，WKY組大鼠心肌纖維排列整齊；SHR 組心肌纖維增粗腫脹、排列紊亂，心肌細(xì)胞束出現(xiàn)溶解斷裂、炎性細(xì)胞浸潤；SHR+QDG組可顯著改善上述病理形態(tài)改變。結(jié)果表明，清達(dá)顆粒可以改善自發(fā)性高血壓大鼠心臟病理形態(tài)的變化。見圖4。

2.5 清達(dá)顆粒對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠心臟組織ANP、BNP 的mRNA 及蛋白表達(dá)的影響經(jīng)qRT-PCR 和Westren Blot 檢測(cè)心臟組織ANP、BNP 的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，與WKY 組相比，SHR 組心臟組織ANP、BNP 的mRNA 和蛋白水平顯著升高（P＜0.05）；與SHR 組相比，SHR+QDG組可顯著降低ANP、BNP的mRNA和蛋白水平的表達(dá)（P＜0.05）。結(jié)果表明，清達(dá)顆?？梢越档托募》屎窕駻NP、BNP 的mRNA 和蛋白的表達(dá)。見圖5-1及圖5-2。

圖5-1 清達(dá)顆粒對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠心臟組織ANP、BNP mRNA的影響

圖5-2 清達(dá)顆粒對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠心臟組織ANP、BNP 蛋白表達(dá)的影響

2.6 清達(dá)顆粒對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠心臟組織p38 MAPK 通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響與WKY 組相比，SHR 組p-p38/p38 蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；與SHR組相比，SHR+QDG組p-p38/p38蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果表明，清達(dá)顆?？梢砸种谱园l(fā)性高血壓大鼠心臟p38 MAPK 通路相關(guān)蛋白的活化。見圖6。

圖6 清達(dá)顆粒對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠心臟組織p38 MAPK通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，高血壓心臟病的特點(diǎn)是以心肌細(xì)胞的肥大和間質(zhì)細(xì)胞的增殖為主，不僅使心肌細(xì)胞面積增大，而且激活肥厚基因，是心血管事件的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[10-12]。心肌肥厚特異性因子ANP是心肌細(xì)胞肥厚的反應(yīng)指標(biāo)[13]，在SHR心臟組織ANP的mRNA表達(dá)較WKY顯著升高，并且隨高血壓的發(fā)生、發(fā)展而相應(yīng)增加[14]，同時(shí)，胚胎基因BNP 的表達(dá)在心肌肥厚過程中也明顯增加[15]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，清達(dá)顆?？娠@著降低心臟組織ANP、BNP 的mRNA 和蛋白的表達(dá)，改善心臟功能及心臟組織病理變化，提示清達(dá)顆?？梢砸种谱园l(fā)性高血壓大鼠心肌肥厚。

絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-actived protein kinase，MAPK）是細(xì)胞內(nèi)的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，調(diào)控細(xì)胞增殖與肥大[4]。p38 MAPK作為MAPK家族的主要成員，參與細(xì)胞增殖和凋亡、心肌肥厚及能量代謝等[16]，在應(yīng)激刺激引起的心肌細(xì)胞肥大中具有重要作用[17]。一方面，活化的p38 MAPK 激活下游細(xì)胞質(zhì)蛋白和轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)而介導(dǎo)肥大信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；另一方面，p38 MAPK 的激活直接導(dǎo)致心肌肥厚標(biāo)志物如ANP、BNP 啟動(dòng)子的活化。Wu 等[18]發(fā)現(xiàn)減弱p38 MAPK 的激活可以改善壓力超負(fù)荷引起的心臟重構(gòu)和心臟功能；Hui等[19]發(fā)現(xiàn)抑制p38 MAPK可顯著改善病理性心肌肥厚；血管緊張素Ⅱ干預(yù)的大鼠心肌細(xì)胞肥厚模型中，抑制p38 MAPK 信號(hào)通路可以抑制心肌肥厚標(biāo)志物的表達(dá)水平，改善心肌肥厚[20]。

前期研究發(fā)現(xiàn)，清達(dá)顆粒對(duì)多種高血壓動(dòng)物模型作用顯著，既可以降低血壓，又可以保護(hù)高血壓導(dǎo)致的靶器官損害，在改善高血壓導(dǎo)致的心肌肥厚及心肌纖維化，抑制心室重構(gòu)等方面療效顯著[6-9]。多次重復(fù)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)清達(dá)顆粒以0.9 g/（kg·d）的給藥劑量時(shí)，對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠的降壓效果最為顯著[21-22]，因而本次實(shí)驗(yàn)選擇0.9g/（kg·d）的給藥劑量。本實(shí)驗(yàn)通過Western Blot 驗(yàn)證了清達(dá)顆粒對(duì)p38 MAPK 通路相關(guān)蛋白活化的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，清達(dá)顆?？梢燥@著降低心臟組織p-p38/p38 的表達(dá)，抑制p38 MAPK 通路的活化，初步驗(yàn)證了清達(dá)顆粒通過p38 MAPK 通路抑制高血壓心肌肥厚的機(jī)制。