孫瓊瑛 鄔賢鳳 羅慧琴

早期復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（early recurrent spontaneous abortion，ERSA）病因非常復(fù)雜，目前的主流研究認為自身免疫失衡導(dǎo)致母體對胎盤產(chǎn)生排斥反應(yīng)是關(guān)鍵因素，因此母胎界面的某些免疫因子與ERSA的關(guān)系引發(fā)關(guān)注[1,2]。血紅素加氧酶-1（heme oxygenase，HO-1）屬微粒體酶，其產(chǎn)生是機體對非正常狀態(tài)刺激的一種反應(yīng)[3]。研究發(fā)現(xiàn)從胚胎植入到分娩整個妊娠過程中單核細胞趨化因子-1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）均發(fā)揮重要作用，而核轉(zhuǎn)錄因子（nuclear factor-kappa B，NF-κB）則是TLR 下游信號通路里的一種核轉(zhuǎn)錄因子，參與胚胎早期發(fā)育及著床過程[4,5]。本次研究對HO-1、MCP-1和NF-κB 在ERSA 患者中的表達進行分析，探討它們在ERSA發(fā)生過程中的作用?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年5 月至2021年5 月浙江省舟山醫(yī)院收治的30 例ERSA 患者納入ERSA組，30 例正常妊娠期因非計劃妊娠要求終止而就診的患者納入對照組。ERSA 組患者需滿足ERSA 診斷標(biāo)準(zhǔn)，即既往有兩次或以上無誘因自然流產(chǎn)史，就診時B 超確診胚胎停育[6]；同時子宮解剖結(jié)構(gòu)正常，抗心磷脂抗體陰性，無TORCH 感染和生殖道感染，甲狀腺功能、凝血功能無異常，近期生活中未發(fā)生重大事件[7]。對照組需要滿足子宮及附件的檢查正常，入組前已有一次或以上正常妊娠史，且既往無病理學(xué)流產(chǎn)史。所有患者均簽署知情同意書，本次研究已獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，ERSA組和對照組年齡、體重指數(shù)、流產(chǎn)孕周、孕次、產(chǎn)次、收縮壓和舒張壓等一般資料見表1。兩組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05）。

表1 兩組一般資料比較

1.2 方法 人工流產(chǎn)術(shù)后，分離孕囊的絨毛和蛻膜組織，生理鹽水清洗后浸泡在10%福爾馬林中。石蠟包埋，切片備用。

1.2.1 絨毛蛻膜組織中HO-1、MCP-1、NF-κB mRNA的表達 采用qPCR法檢測，從組織中抽提總RNA，取適量組織樣本加入1 ml Trizol（由Takara 生產(chǎn)），分離核酸蛋白復(fù)合物，加入250 μl 氯仿，劇烈震蕩EP 管，靜置3～5 min 后離心（12 000 r/min，15 min），將上層RNA 移至新的EP 管沉淀RNA，再次離心10 min。收集RNA沉淀，去除上清，用5%乙醇洗滌兩次，離心5 min風(fēng)干，加入適量DEPC水，溶解沉淀，將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。設(shè)計RT-qPCR 引物（見表2）。調(diào)配合適的引物退火溫度和模板量進行預(yù)實驗。使用2×SYBR Green Mix 配制qPCR Mix，按照實際檢測的樣品數(shù)和重復(fù)量，調(diào)配適當(dāng)?shù)膓PCR Mix。分裝至AXYGEN qPCR8 連管，微型離心機瞬時離心混勻qPCR 體系。將上述樣品放入IQ5 熒光定量qPCR 儀，SYBR Green 法熒光定量qPCR以分析各基因的表達。采用2-△△Ct法進行各基因表達的相對定量。

表2 RT-qPCR檢測引物信息

1.2.2 絨毛蛻膜組織中HO-1、MCP-1、NF-κB 蛋白的表達 采用Western blot 檢測：將組織稱重后粉碎，加入RIPA緩沖液和PMSF，4 ℃下1 500 r/min勻漿，加入PMSF，冰上孵育，離心。取上清液保存，進行Bradford 比色法進行蛋白質(zhì)定量檢測。SDSPAGE 電泳，將蛋白凝膠中的蛋白通過電流作用轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)印膜上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，先用筆標(biāo)記marker，再將NC膜置于立春紅染色液中，室溫5～10 min即可見紅色條帶，用洗滌緩沖液洗數(shù)次后洗掉紅色條帶，拍照，根據(jù)marker 剪膜。封閉雜交膜，首先孵育一抗，4 ℃孵育過夜或（22 ℃～25 ℃）搖動孵育2 h。用1×PBST/TBST 液洗膜3 次×10 min，孵育二抗，4 ℃孵育2 h 或室溫（22 ℃～25 ℃）搖動孵育1 h。顯影，以目的蛋白與β-actin的積分吸光度比值檢測結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。組間計量資料比較采用t檢驗；計數(shù)資料比較采用χ2檢驗。診斷效能以受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線研究。設(shè)P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組絨毛蛻膜組織中HO-1、MCP-1、NF-κB mRNA水平見表3

表3 兩組絨毛蛻膜組織中HO-1、MCP-1、NF-κB mRNA比較

由表3 可見，ERSA 組絨毛蛻膜組織中HO-1 mRNA、MCP-1mRNA、NF-κB mRNA 水平均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t分別=43.22、43.43、8.28，P均＜0.05）。

2.2 兩組絨毛蛻膜組織中HO-1、MCP-1、NF-κB蛋白表達比較見表4

表4 兩組絨毛蛻膜組織中HO-1、MCP-1、NF-κB 蛋白表達比較

由表4 可見，ERSA 組絨毛蛻膜組織中HO-1、MCP-1、NF-κB 蛋白的表達均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t分別=28.35、13.37、9.54，P均＜0.05）。

2.3 絨毛蛻膜組織中HO-1、MCP-1、NF-κB mRNA水平預(yù)測ERSA的價值分析見表5

表5 絨毛蛻膜組織中HO-1、MCP-1、NF-κB mRNA水平預(yù)測ERSA的價值分析

由表5 可見，絨毛蛻膜組織中HO-1mRNA、MCP-1mRNA、NF-κB mRNA 水平聯(lián)合檢測ERSA的靈敏度和特異度最高，分別為72.41%和90.00%，AUC為0.84。

2.4 絨毛蛻膜組織中HO-1、MCP-1、NF-κB蛋白表達情況預(yù)測ERSA的價值分析見表6

表6 絨毛蛻膜組織中HO-1、MCP-1、NF-κB蛋白表達情況預(yù)測ERSA的價值分析

由表6可見，絨毛蛻膜組織中HO-1蛋白、MCP-1蛋白、NF-κB 蛋白水平聯(lián)合檢測ERSA 的靈敏度和特異度最高，分別為86.67%和86.66%，AUC為0.85。

3 討論

在妊娠進程中，胎兒的生長發(fā)育依賴母體與胎盤間的血液循環(huán)[8,9]。因此血管的形成是胚胎著床與妊娠成功的基礎(chǔ)，而研究認為胎盤血管發(fā)育不良和內(nèi)皮功能障礙也是誘導(dǎo)ERSA發(fā)生的重要原因[10,11]。

本次研究結(jié)果顯示，ERSA組HO-1 mRNA和蛋白水平均高于對照組（P均＜0.05），表明HO-1 與ERSA 的發(fā)病間存在顯著相關(guān)性。HO-1 基因表達的調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平，而HO-1 蛋白主要存在于胎盤滋養(yǎng)細胞與絨毛間質(zhì)[12]。HO-1 參與胎盤血管化，并能通過調(diào)節(jié)平滑肌細胞的收縮調(diào)節(jié)血管張力，維持母體與胎盤、胎兒間的循環(huán)[13]。同時其可阻止游離血紅素參與氧化反應(yīng)，具有抗氧化功能。而機體在多種因素刺激下均可誘導(dǎo)HO-1 的表達，包括熱休克、缺血、缺氧、氧化應(yīng)激過氧亞硝基和細胞運轉(zhuǎn)障礙等等。多項體內(nèi)外研究證實，HO-1 表達下調(diào)或缺失可加速脂質(zhì)在血管壁的沉積，導(dǎo)致更多的泡沫細胞形成，造成內(nèi)皮功能障礙[14]。

本次研究結(jié)果顯示，ERSA 組MCP-1mRNA 和蛋白表達均高于對照組（P均＜0.05），表明MCP-1與ERSA 的發(fā)病間存在顯著相關(guān)性。與陳慧等[15]研究結(jié)果基本一致。在妊娠期中，母體血進入絨毛間隙后絨毛組織由低灌注低氧環(huán)境向高灌注高氧環(huán)境轉(zhuǎn)變，導(dǎo)致細胞內(nèi)會形成大量活性氧。若氧化自由基劇增，即可誘發(fā)嚴(yán)重氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致ERSA。MCP-1 正是與氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)相關(guān)的因子[16，17]。人MCP-1基因定位于17號染色體，在子宮內(nèi)膜、蛻膜、絨毛膜和胎盤中均有表達，一般情況下，將在母體激素分泌調(diào)控下與其受體相結(jié)合，促進胚胎植入子宮內(nèi)膜。而過高的MCP-1 水平有極大可能激活單核巨噬細胞，使之分泌前列腺素E2，引起宮縮增加，導(dǎo)致流產(chǎn)。

正常情況下，NF-κB 存在于胞漿內(nèi)，由p65 和p50 組成，與抑制因子IκB-a 和IκB-b 相互結(jié)合，對相關(guān)的靶基因進行調(diào)控。當(dāng)細胞受到氧化反應(yīng)等刺激，IκB 磷酸化，NF-κB 激活并進入細胞核，與靶基因結(jié)合后產(chǎn)生大量的炎癥介質(zhì)，引起炎癥反應(yīng)爆發(fā)[18]。并且基因的產(chǎn)物也會刺激大量NF-κB 生成，加重病變部位炎癥反應(yīng)。本次研究結(jié)果顯示，ERSA組NF-κB mRNA 和蛋白表達均高于對照組（P均＜0.05），表明NF-κB與ERSA的發(fā)病間存在顯著相關(guān)性。馮曉玲等[19]研究也證實了NF-κB 在抗心磷脂抗體陽性復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者的蛻膜、血清中表達比正常孕婦顯著升高，認為其可能參與了血栓、炎性進程，并與流產(chǎn)發(fā)生相關(guān)。

既往鮮有研究分析HO-1、MCP-1、NF-κB 表達變化在ERSA中的臨床意義，在驗證ERSA患者絨毛蛻膜組織中的HO-1、MCP-1、NF-κB 表達異常后，本次研究進一步利用ROC 曲線分析了三者的臨床意義。結(jié)果顯示，三種指標(biāo)聯(lián)合檢測靈敏度、特異度和AUC最高，表明聯(lián)合檢測三種指標(biāo)能夠提高診斷效能。

綜上所述，ERSA患者絨毛蛻膜組織中的HO-1、MCP-1、NF-κB 表達與正常妊娠婦女存在明顯差異，其可作為預(yù)測ERSA發(fā)生的重要因子，且三者聯(lián)合檢測診斷效能更高。