陳科 李曉飛 王濟緯

脊髓缺血再灌注損傷（spinal cord ischemia-reperfusion injury，SCII）是脊髓缺血損傷一段時間后，相應節(jié)段血供恢復，神經(jīng)功能卻在原損傷基礎上進一步加重[1]。目前，炎癥反應被認為是造成SCII 的最重要的因素之一[2,3]。甲強龍可通過減輕損傷脊髓炎癥反應保護受損神經(jīng)，但大量使用后并發(fā)癥較多。地稔是一種傳統(tǒng)的藥用植物，其抗炎，抗氧化等作用在現(xiàn)代藥理研究中逐漸被證實，相關研究發(fā)現(xiàn)其可通過降低腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）的表達減輕缺血肢體的再灌注損傷[4,5]。本次研究建立大鼠脊髓缺血再灌注模型，探討地稔預干預對SCII大鼠脊髓組織中炎癥因子表達變化的影響。

1 資料與方法

1.1 材料與試劑 本次研究時間為2018 年6 月至2018年10 月，選擇清潔級健康成年雄性SD大鼠72只，鼠齡6～8 周，體重（138.24±11.12）g，購自上海斯萊克動物實驗中心。實驗動物許可證號為[SYXK（浙）2015-0009]。本次研究經(jīng)溫州醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會批準。

1.2 實驗分組 按照隨機數(shù)字表法將大鼠分為假手術(shù)組（Sham 組）、缺血-再灌注組（SCII 組）、地稔干預組（MD組）、甲強龍治療組（MP組），每組18只。

1.3 模型制備與標本采集 MD 組于術(shù)前7 d 開始灌胃地稔水煎液，濃度0.2 g/ml，每次劑量10 ml/kg，每日1 次，連續(xù)7 d。SCII 組、MP 組與Sham 組予等量生理鹽水灌胃，每日1 次，連續(xù)7 d。7 d 后SCII組、MD組大鼠用10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉，腹部向上固定操作臺上，常規(guī)消毒。取腹部正中切口進入腹腔，仔細暴露出腹主動脈，于左腎動脈分支上，右腎動脈分支下，用血管夾夾閉腹主動脈，顯微鏡下確認夾閉下方血管無血供。45 min 后取下血管夾，恢復血流，逐層縫合切口。MP 組予術(shù)前30 min 經(jīng)舌下靜脈注射甲強龍后同樣方法建立SCII 模型。分別在再灌注后6 h、48 h、72 h 再次將大鼠深麻醉。四組各時間點取6只大鼠深麻醉后在冰上快速取下同上位置脊髓組織，放入凍存管中于-80 ℃中保存。

1.4 觀測指標

1.4.1 大鼠后肢功能BBB 評分 三名研究者分別在SCII 建模成功后6 h、48 h、72 h 對四組大鼠后肢運動功能進行盲法評分，采用Basso、Beattie和Bresnahan（BBB）評分標準。

1.4.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）檢測脊髓組織中TNF-α、IL-6、白細胞介素10（interleukin-10，IL-10）表達水平 將脊髓組織稱質(zhì)量后置于冰上融化，取100 mg，按照RAPI 裂解液說明書按比例加入裂解液研磨，離心，取上清液待測，嚴格按ELISA試劑盒（由聯(lián)科生物生產(chǎn)）說明書操作。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（）表示。兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法。設P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 四組大鼠再灌注損傷后不同時間點后肢BBB評分比較見表1

表1 四組大鼠再灌注損傷后不同時間點后肢BBB評分比較/分

由表1可見，四組大鼠再灌注損傷后6 h、48 h、72后肢BBB評分比較，差異均有統(tǒng)計學意義（F分別=158112.03、4439.19、6363.55，P均＜0.05）。進一步兩兩比較，SCII組再灌注損傷后6 h、48 h、72 h后肢BBB 評分明顯低于Sham 組（t分別=26.78、12.54、11.59，P均＜0.05）。再灌注損傷后6 h，MD組和MP組與SCII 組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（t分別=0.75、1.14，P均＞0.05），再灌注損傷后48 h、72 h，MD 組和MP 組大鼠后肢BBB 評分均高于SCII 組（t分別=10.25、8.56；15.47、11.62，P均＜0.05）。MD 組與MP 組各時間點BBB 評分比較，差異均無統(tǒng)計學意義（t分別=0.34、0.94、1.03，P均＞0.05）。

2.2 四組大鼠再灌注損傷后不同時間點脊髓組織中TNF-α表達變化見表2

表2 四組大鼠再灌注損傷后不同時間點脊髓組織中TNF-α表達變化/ng/ml

由表2 可見，四組大鼠再灌注損傷后不同時間點脊髓組織中TNF-α表達比較，差異均有統(tǒng)計學意義（F分 別=10799.34、2224.49、8338.45，P均＜0.05）。進一步兩兩比較，SCII組各時間點TNF-α表達均高于Sham組（t分別=20.34、25.86、22.17，P均＜0.05），MD 組和MP 組各時間點TNF-α 表達低于SCII 組（t分 別=12.18、17.20、12.74；14.53、16.32、21.15，P均＜0.05），再灌注損傷后48 h、72 h，MP 組TNF-α表達均低于MD組（t分別=9.63、10.36，P均＜0.05）。

2.3 四組大鼠再灌注損傷后不同時間點脊髓組織中IL-6表達變化見表3

表3 四組大鼠再灌注損傷后不同時間點脊髓組織中IL-6表達變化/ng/ml

由表3 可見，各組大鼠再灌注損傷后不同時間脊髓組織中IL-6表達比較，差異均有統(tǒng)計學意義（F分別=628.50、1401.99、1115.35，P均＜0.05）。進一步兩兩比較，SCII組各時間點IL-6表達均高于Sham組（t分別=26.74、27.66、25.69，P均＜0.05），MD組和MP 組IL-6 表達低于SCII 組（t分別=11.79、12.35、13.41；13.14、15.66、16.77，P均＜0.05）。再灌注損傷后48 h、72 h，MP 組IL-6 表達低于MD 組（t分別=10.63、9.88，P均＜0.05）。

2.4 四組大鼠再灌注損傷后不同時間點脊髓組織中IL-10表達變化見表4

表4 四組大鼠再灌注損傷后不同時間點脊髓組織中IL-10表達變化/ng/ml

由表4 可見，四組大鼠再灌注損傷后不同時間點脊髓組織中IL-10 表達變化比較，差異均有統(tǒng)計學意義（F分別=627.34、228.75、809.65，P均＜0.05）。進一步兩兩比較，SCII 組各時間點IL-10 表達均高于Sham 組（t分別=12.40、12.96、14.27，P＜0.05），MD 組和MP 組IL-10 表達高于SCII 組（t分別=8.53、11.26、7.74；10.25、12.17、13.13，P均＜0.05），再灌注損傷后48 h、72 h，MP 組IL-10 表達高于MD組（t分別=-6.01、-8.61，P均＜0.05）。

3 討論

SCII 由一系列復雜的酶聯(lián)反應介導發(fā)生，目前相關損傷機制研究主要包括炎癥應激反應、離子環(huán)境失衡、細胞凋亡等，其中炎癥反應被視為最重要的機制之一，研究表明血流再灌注后激發(fā)黏附分子和趨化因子表達引起包括白細胞募集、血管內(nèi)皮損傷、神經(jīng)毒性等一系列炎癥反應[6～8]。

當前針對SCII 后抑制炎癥反應的治療，臨床上應用最廣的是甲強龍，但近來研究對其改善神經(jīng)功能預后存在廣泛爭議，同時大劑量甲強龍使用所帶來的一系類并發(fā)癥也限制了其應用，能否在傳統(tǒng)民族藥物中尋找新的治療契機逐漸成為新的熱點[2，3]。地稔長期被瑤族、苗族和畬族等幾個少數(shù)民族廣泛應用于治療各種不同的疾病。主要以全草煎熬口服為主，從地稔水煎液中分離出109 種化合物，包括有機酸、黃酮類、多糖、氨基酸和類固醇，現(xiàn)代藥理研究中逐漸證實其具有止血、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗氧化和抑制高級糖基化終產(chǎn)物的形成等作用[9,10]。既往研究顯示經(jīng)過地稔水煎液預處理可以降低大鼠肢體缺血再灌注損傷后炎癥因子TNF-α和IL-6的表達水平，從而達到減輕炎癥反應，保護缺血肢體的作用[5]?；谝陨献C據(jù)，本次研究進一步探討地稔對SCII損傷神經(jīng)組織炎癥因子表達的影響，結(jié)果顯示，SCII 組、MD 組、MP 組大鼠后肢BBB 評分均低于Sham 組（P均＜0.05），另外再灌注后48 h、72 h MD組、MP 組大鼠后肢BBB 評分均高于SCII 組（P均＜0.05），而MP組各時間點BBB評分并未明顯高于MD組（P＞0.05），表明地稔與甲強龍預處理均可減輕SCII 損傷引起的雙下肢神經(jīng)功能障礙，且地稔治療效果與甲強龍治療效果相當。

TNF-α是嗜中性粒細胞有效的激活劑，通常與細胞膜上的p55與p75兩個受體結(jié)合，不論在大鼠、新西蘭兔亦或是豬的SCII 模型研究中均可觀察到再灌注損傷后TNF-α增高，不同模型呈現(xiàn)不同的增高幅度，大體呈現(xiàn)一個雙向趨勢[11]。IL-6可由單核-巨噬細胞、內(nèi)皮細胞、成纖維細胞等多種細胞產(chǎn)生，其通過產(chǎn)生急性期反應蛋白參與炎癥反應，而在不同的SCII 損傷模型中均可發(fā)現(xiàn)再灌注損傷后IL-6呈現(xiàn)高表達趨勢[12]。IL-10是一種有效的抑炎因子，研究表明在大鼠SCII損傷后48 h IL-10在脊髓灰質(zhì)呈現(xiàn)出高表達狀態(tài)，IL-10 可以通過抑制髓過氧化物酶表達減輕炎癥反應[13]。本次研究結(jié)果顯示，與Sham 組比較，其余三組脊髓組織中TNF-α、IL-6 和IL-10表達均出現(xiàn)增高趨勢，MD組、MP組促炎因子TNF-α、IL-6表達較SCII組低，MP組表達相對最少；MD 組、MP 組抑炎因子IL-10 均高于SCII 組，MP 組表達最高，以上結(jié)果表明地稔及甲強龍預干預在SCII 后均可抑制炎癥過度表達，起到保護脊髓組織的作用，但地稔對于脊髓組織內(nèi)炎癥反應抑制水平不及甲強龍，如何提高地稔療效有待進一步研究。

綜上所述，地稔可以通過抑制促炎癥因子、提高抑炎因子的表達，減少中性粒細胞浸潤等減輕炎癥反應，從而對大鼠SCII 損傷產(chǎn)生保護作用，但整體療效不如甲強龍。另外，本次研究僅是研究預處理，有待開展SCII 損傷后地稔治療的進一步研究，同時本次研究地稔為中藥制劑，其中成分未經(jīng)提純，如何提高地稔藥效有待進一步研究。