丁瑞豐， 朱嗣博， 周新麗*

（1. 上海理工大學(xué)健康科學(xué)與工程學(xué)院，上海 200093；2. 復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)院，上海 200438）

高血壓是導(dǎo)致心血管疾病和腎臟疾病的主要因素，造成的死亡人數(shù)占全球所有死亡人數(shù)的5.8%[1]。心臟、腎臟是主要靶器官，在高血壓的長期影響下將破壞這些器官的正常結(jié)構(gòu)和功能，最終導(dǎo)致功能衰竭[2-3]。 高鹽飲食已被確定為引起高血壓的獨立危險因素，長期的高鹽飲食會導(dǎo)致體內(nèi)鈉潴留、外周血管阻力增大和血容量升高[4]。 隨著我國經(jīng)濟的發(fā)展，居民飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變，食鹽的攝入量提高到了約10 g/d，遠高于世界衛(wèi)生組織推薦的5 g/d的攝鹽量[5]。 研究表明，攝鹽量每增加2 g/d，可使血壓升高1～2 mmHg[6]。 除此之外，過量的膳食鹽攝入會導(dǎo)致腎臟肥大和腎臟小動脈、冠狀動脈血管周圍纖維化，雙心室缺血和心室舒張功能異常等一系列器官功能障礙[7-9]。

腸黏膜是吸收過量鹽分的主要部位，過多的攝鹽量會破壞腸道微生物群的穩(wěn)態(tài)并上調(diào)高血壓特征菌群等有害菌豐度[10-12]。 一項臨床研究發(fā)現(xiàn)，減少膳食鹽的攝入會增加高血壓患者體內(nèi)與血壓下降有關(guān)的短鏈脂肪酸（short-chain fatty acid，SCFA）水平，而大部分SCFA 都來源于腸道微生物代謝，間接說明了鹽的攝入對于腸道菌群組成及功能的影響[13]。 一些研究則發(fā)現(xiàn)在高鹽飲食及高血壓的作用下，腎臟損傷和心血管疾病的發(fā)展受到了來自腸道微生物群通過免疫、代謝和神經(jīng)調(diào)控等一系列途徑的影響[14-17]。

高通量測序技術(shù)的發(fā)展為揭示疾病的分子機制提供了新的途徑。 然而，高鹽飲食引起的高血壓靶器官損傷的潛在機制和對腸道微生物群的影響仍少有探究。 因此，作者通過高鹽飲食的方式構(gòu)建了高血壓大鼠模型，基于基因組和微生物組全面探討了高鹽誘導(dǎo)的高血壓大鼠靶器官損傷的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（12 只，4周齡，體質(zhì)量（170±5） g）：上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司提供。 實驗中對實驗動物的處置均遵守《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》規(guī)定（動物實驗倫理審核編號：SZY-201601007）。

普通標(biāo)準(zhǔn)飼料（SFS9112）、定制高鹽飼料（普通標(biāo)準(zhǔn)飼料基礎(chǔ)上含質(zhì)量分數(shù)8%NaCl）：江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2D 雙人單面凈化垂直送風(fēng)工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司產(chǎn)品；Ultra Pure UF 除熱源型超純水機：上海和泰儀器有限公司產(chǎn)品；Sorvall ST 8臺式離心機、NanoDropTM2000 分光光度計： 北京賽默飛科技有限公司產(chǎn)品；Agilent 2100 Bioanalyzer 生物分析儀：美國Agilent 公司產(chǎn)品；BP98A 無創(chuàng)血壓儀：日本Softron 產(chǎn)品。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗設(shè)計 實驗采用12 只健康4 周齡雄性SD 大鼠，在適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后隨機分成兩組，每組6 只：NC 組（空白對照組，喂養(yǎng)普通標(biāo)準(zhǔn)飼料）、HSD組（高鹽飲食組，喂養(yǎng)含質(zhì)量分數(shù)8%NaCl 定制高鹽飼料）。 所有大鼠允許自由飲水，并放置于晝夜光照條件為12 h 光照/12 h 黑暗、環(huán)境溫度（22±2） ℃、相對濕度（30±2）%的實驗動物房環(huán)境下，每4 周于同一時間測量大鼠體質(zhì)量和動脈血壓。 連續(xù)喂養(yǎng)12 周后，腹腔注射戊巴比妥鈉（50 mg/kg）對動物實施安樂死，待大鼠完全麻醉后放血處死。 收集腎臟的皮質(zhì)和髓質(zhì)組織、心臟的心房和心室組織、結(jié)腸組織和糞便樣本，并立即放于液氮中速凍，隨后儲存在-80 ℃冰箱用于后續(xù)高通量測序， 實驗總體設(shè)計和分析流程如圖1 所示。

圖1 實驗總體設(shè)計和分析流程Fig. 1 Experimental overall design and analytical procedures

1.3.2 大鼠血壓測量 使用無創(chuàng)血壓儀測量大鼠尾部的收縮壓和舒張壓，并根據(jù)如下公式計算平均動脈壓作為大鼠血壓測量結(jié)果。 測量前讓大鼠自由飲水并在籠中休息15 min 以保持冷靜。隨后將大鼠的尾巴放在溫度合適的尾套中，將其充氣和釋放多次，讓動物適應(yīng)這個過程。 通過3～5 次連續(xù)成功的血壓讀數(shù)獲得平均動脈壓。

式中：pMAP為平均動脈壓 （mean arterial pressure），mmHg；pDBP為舒張壓 （diastolic blood pressure），mmHg；pSBP為收縮壓 （systolic blood pressure），mmHg。

1.3.3 組織RNA 提取和高通量測序 根據(jù)TRIzol試劑盒操作說明分別提取各器官組織的總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢查RNA 的完整性，NanoDropTM2000分光光度計測定RNA 純度和濃度， 并用Agilent 2100 Bioanalyzer 生物分析儀測定RNA 完整值（RNA integrity number，RIN）。 RNA 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)為：OD260nm/280nm為1.8～2.2、 ρRNA≥200 ng/μL、RIN 值≥8。通過質(zhì)控的RNA 樣本使用SmartScribeTMReverse Transcriptase 試劑盒進行cDNA 擴增和文庫制備，隨后用TruePrep?DNA Library Prep Kit V2 for Illumina 試劑盒對DNA 進行片段化、加接頭和擴增反應(yīng)，使用VANTS DNA Clean Beads 對各階段產(chǎn)物進行分選， 使用Agilent 2100 Bioanalyzer 生物分析儀對獲得的文庫樣品進行定量分析， 最終獲得250～1 000 bp 文庫片段。 根據(jù)定量分析結(jié)果，構(gòu)建好的文庫樣品按照體積比1∶1 比例混合， 送交北京貝瑞和康生物技術(shù)有限公司通過Illumina NextSeq 500 平臺進行高通量測序。 測序下機原始數(shù)據(jù)使用Fastqc（v0.11.9）和Multiqc（v1.11）軟件進行質(zhì)控統(tǒng)計， 采用Trimmomatic （v0.39） 軟件過濾低質(zhì)量reads， 序列過濾后得到的高質(zhì)量reads， 利用HiSat（v2.1.0）軟件比對到Ensemble 基因組數(shù)據(jù)庫發(fā)布的大鼠參考基因組和基因序列Rnor6（release 102）上，比對結(jié)果利用featureCounts（v1.6.5）進行基因水平定量，得到各樣本的基因表達矩陣。 通過每個組織的NC 組和HSD 組之間的基因表達譜差異倍數(shù)（fold change）來鑒定差異表達基因，差異表達基因使用R 包DESeq2 進行篩選，差異倍數(shù)大于1.3 或小于0.77，P＜0.05 作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，隨后通過比對AnimalTFDB（v3_20210214）數(shù)據(jù)庫進一步識別出差異表達基因中的轉(zhuǎn)錄因子，并進行深入挖掘分析。 最后，通過R包clusterProfiler 分析差異表達基因列表， 根據(jù)GO數(shù)據(jù)庫和KEGG 數(shù)據(jù)庫來探索其生物學(xué)功能。

1.3.4 糞便16S rRNA 基因測序與分析 使用糞便DNA 基因組提取試劑盒從冷凍糞便樣本中提取細菌基因組，經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳檢查合格后，采用16S rRNA 基因V3～V4 區(qū)引物（338F：F5′-TCGTCG GCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGG GNGGCWGCAG-3′;806R：R5′-GTCTCGTGGGCTCG GAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTAT CTAATCC-3′） 進行DNA 提取和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR） 擴增， 擴增采用KAPA HiFi HotStart Ready Mix 試劑盒。擴增產(chǎn)物隨后采用瓊脂糖凝膠電泳檢測， 合格的樣品使用TruePrep?DNA Library Prep Kit V2 for Illumina 試劑盒構(gòu)建基因文庫，VANTS DNA Clean Beads 回收各階段目標(biāo)片段擴增產(chǎn)物。 使用Agilent 2100 Bioanalyzer 生物分析儀對獲得的文庫樣品進行定量，最終獲得630 bp 附近的文庫片段。 根據(jù)定量結(jié)果，構(gòu)建好的文庫樣品按照體積比1∶1 比例混合，送交晶能生物技術(shù) （上海） 有限公司通過Illumina Novaseq 6000 平臺進行高通量測序。 下機測序數(shù)據(jù)采用QIIME（v1.9.1）軟件進一步處理，以97%的相似性分類閾值來進行不同操作分類單元（operational taxonomic units，OTUs）的聚類和物種注釋，比對參照數(shù)據(jù)庫為Greengenes 數(shù)據(jù)庫（2013 release）。使用R 包vegan 進行腸道菌群數(shù)據(jù)的多樣性分析和主坐標(biāo)分析（principal coordinates analysis，PCoA）。 采用線上工具Galaxy（http：//huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/）的線性判別分析（linear discriminant analysis effect size，LEfSe）工具分析組間菌群差異。腸道菌群的KEGG 功能預(yù)測使用 PICRUSt（phylogenetic investigation of communities by reconstruction of unobserved states） 軟件進行分析。

1.3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 使用GraphPad Prism（v8.4.2）和R 統(tǒng)計軟件（v3.6.2）進行統(tǒng)計學(xué)分析。組間差異顯著性檢驗采用Mann-Whitney-Wilcoxon 檢驗，采用Spearman 進行相關(guān)性分析，差異比較結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD），P＜0.05 作為統(tǒng)計學(xué)意義篩選標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 高鹽飲食對大鼠血壓和體質(zhì)量的影響

本研究的目的是根據(jù)長期高鹽飲食誘導(dǎo)的高血壓大鼠組織和腸道微生物的差異來表征高血壓的潛在分子機制。 在實驗過程中，各組大鼠均未出現(xiàn)死亡；NC 組的大鼠活動情況正常， 精神狀態(tài)良好；HSD 組大鼠活動減少，精神狀態(tài)萎靡。 各組大鼠的體質(zhì)量和血壓變化情況如圖2 所示，與正常飲食（空白對照組）的大鼠相比，高鹽喂養(yǎng)的大鼠體質(zhì)量顯著降低，由（468.00±13.53）g 降至（411.67±31.82）g。在高鹽飲食的作用下，HSD 組的血壓顯著高于NC 組，在高鹽飲食喂養(yǎng)8 周后已經(jīng)觀察到了差異，并且在整個研究過程中都保持了顯著差異， 由NC 組（112.67±5.13） mmHg 升至HSD 組 （143.00±4.58）mmHg。 高鹽飲食造成了大鼠的體質(zhì)量增長減緩和血壓顯著升高，與Bier 等的研究結(jié)果[18]一致。

圖2 大鼠的體質(zhì)量、血壓變化情況Fig. 2 Changes in body weight and blood pressure of rats

2.2 高血壓靶器官的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)分析

為了明確長期高鹽飲食所導(dǎo)致的高血壓靶器官損傷機制，對上述兩組大鼠腎臟的皮質(zhì)和髓質(zhì)組織、 心房和心室組織和結(jié)腸組織共30 個組織樣本進行了高通量測序，共測定了20 207 個基因的表達量。 無監(jiān)督學(xué)習(xí)中的主成分分析（PCA） 和層次聚類分析（HCA）是轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)分析前質(zhì)量控制的常用方法之一，通過二維坐標(biāo)或聚類樹查看樣本之間的聚類情況， 以判定樣本的組間差異和組內(nèi)差異。 PCA 的結(jié)果如圖3（a）所示，第一主成分的貢獻度為36.12%，第二主成分的貢獻度為12.77%，相同器官組織樣本聚集在一起。 從HCA 的結(jié)果可以看出（見圖3（b）），每個器官組織中的樣本大致分成2個大類，大多數(shù)高鹽飲食組單獨形成一類，空白對照組形成另一大類?？傮w來說，PCA 和HCA 結(jié)果相互印證，均證實樣本的組間差異大于組內(nèi)差異。 本研究比較了每個組織的基因表達譜差異以表征由高鹽高血壓引起的分子變化。 根據(jù)基因表達譜差異倍數(shù)和顯著性對基因進行篩選比較，各個器官組織的差異表達基因數(shù)如表1 所示。

表1 各組織差異表達基因的數(shù)量Table 1 Numbers of differentially expressed genes in each tissue

圖3 器官組織基因表達譜差異分析圖Fig. 3 Gene expression profile analysis of organs and tissues

為了更好地闡明高鹽飲食對高血壓靶器官損傷的潛在機制，進一步篩選了差異表達基因中的轉(zhuǎn)錄因子，如圖4 所示。 結(jié)果表明，HSD 組中結(jié)腸中的基因Irf1 和心室中的基因Irf7 的表達量高于NC組，而心房中的基因Zfp91、心室中的基因Epas1 表達量低于NC 組。 除此之外，HSD 組中Id 基因家族在多個器官組織中的表達量均低于NC 組， 如腎髓質(zhì)中的基因Id1、Id2、Id3，腎皮質(zhì)的基因Id2、Id3、Id4。

圖4 各組織的差異轉(zhuǎn)錄因子Fig. 4 Differential transcription factors in each tissue

為了解高鹽飲食可能影響的細胞功能與代謝過程，本研究中對各個器官組織的組間差異表達基因分別采用了GO 和KEGG 進行富集分析，結(jié)果如圖5 和圖6 所示。 GO 分類結(jié)果表明，高鹽飲食所導(dǎo)致的差異表達基因在心房主要參與前體代謝產(chǎn)物和能量產(chǎn)生，在心室和腎皮質(zhì)則主要與ATP 代謝過程有關(guān)，結(jié)腸和腎皮質(zhì)組織的差異表達基因分別與細胞修飾的氨基酸代謝過程和線粒體呼吸鏈復(fù)合體組裝過程有關(guān)。 KEGG 富集結(jié)果表明各器官組織的差異表達基因與多種代謝過程密切相關(guān)，在心房和腎皮質(zhì)主要與三羧酸循環(huán)有關(guān)，腎皮質(zhì)和髓質(zhì)的差異表達基因主要與丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝有關(guān)， 心房和結(jié)腸的差異表達基因與膽固醇代謝有關(guān)。

圖5 各組織的差異表達基因GO 分類Fig. 5 GO classification of differentially expressed genes in each tissue

圖6 各組織的差異表達基因KEGG 富集Fig. 6 KEGG enrichment analysis of differentially expressed genes in each tissue

2.3 高鹽飲食對大鼠腸道菌群組成及多樣性的影響

為了明確高鹽飲食對腸道微生物群組成的影響， 本研究中通過16S rRNA 基因測序分析了各組大鼠腸道微生物群結(jié)構(gòu)組成情況。 如圖7（a）所示，兩組大鼠腸道菌群在門水平上主要由擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）和藍細菌門（Cyanobacteria）構(gòu)成。Yang 等的研究結(jié)果表明，厚壁菌門和擬桿菌門豐度的比值（F/B 值）升高是高血壓腸道菌群失調(diào)的標(biāo)志[19]。 如圖7（b）所示，在本研究中高鹽飲食組大鼠相比于空白對照組大鼠的厚壁菌門和擬桿菌門豐度的比值顯著升高，反映了在高鹽飲食及高血壓的影響下大鼠腸道菌群組成結(jié)構(gòu)的改變。

圖7 門水平上大鼠微生物菌群的物種組成分析Fig. 7 Rat microbial species composition analysis on the phylum level

α-多樣性能夠反映出樣品中微生物群落的豐富度和均勻程度。 Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)可定量評估樣本中菌群豐富度和均勻程度，Shannon指數(shù)越大或者Simpson 指數(shù)越小則代表樣本菌群多樣性越高。 ACE 指數(shù)與Chao1 指數(shù)類似，通過統(tǒng)計樣本中OTUs 數(shù)量來對樣本多樣性進行評估，其值越大，代表樣本菌群多樣性越豐富。 樣本的α-多樣性指數(shù) （ACE 指數(shù)、Chao1 指數(shù)、Shannon 指數(shù)、Simpson 指數(shù)）具體數(shù)值如表2 所示，高鹽飲食會使大鼠的腸道菌群豐富度和均勻程度略微降低，但是Shannon 指數(shù)、Simpson 指數(shù)、ACE 指數(shù)與NC 組差異不顯著，Chao1 指數(shù)顯著下降（P＜0.05），本研究結(jié)果表明了高鹽飲食對大鼠的腸道菌群豐富度和均勻程度有影響。

表2 大鼠腸道菌群α-多樣性指數(shù)Table 2 α-Diversity index of rat intestinal microflora

進一步比較高鹽飲食對大鼠腸道菌群組成的影響，本研究中采用PCoA 比較了兩個實驗組在門、屬水平上微生物組成的菌群多樣性差異。 如圖8 所示， 在門水平上PC1 坐標(biāo)軸貢獻率占總成分的94.67%，在屬水平上為89.98%，符合PCoA 要求。分析結(jié)果表明了本研究中兩實驗組各自的樣本都能顯著分為一個群體，并且微生物群落結(jié)構(gòu)和豐度都有自己明顯的特征。

圖8 大鼠腸道菌群的PCoA 分析結(jié)果Fig. 8 PCoA analysis of rat intestinal microflora

2.4 高鹽飲食對特定菌群和功能的影響

為了明確高鹽飲食造成的關(guān)鍵差異菌群，為相關(guān)疾病的分類、檢測和機理研究等臨床應(yīng)用提供參考。 本研究中采用了LEfSe 方法分析了不同樣本組別間的菌群差異，通過計算LDA 分數(shù)來區(qū)分兩個實驗組中對菌群結(jié)構(gòu)差異貢獻較大的標(biāo)志性微生物。如圖9 所示， 兩組樣本的腸道菌群存在一定的差異，NC 組中對菌群結(jié)構(gòu)差異影響較大的微生物主要來自擬桿菌門（Bacteroidetes）、梭菌綱（Clostridia）和瘤胃球菌科（Ruminococcaceae），而高鹽飲食組中對菌群結(jié)構(gòu)差異影響較大的微生物主要來自厚壁菌門（Firmicutes）、β-變形菌綱（Betaproteobacteria）、伯克氏菌目 （Burkholderiales）、 放線菌目（Actinomycetales）和費克藍姆菌屬（Facklamia）等。本研究結(jié)果說明了高鹽飲食能夠改變大鼠腸道中特定菌群的相對豐度，對大鼠的腸道菌群結(jié)構(gòu)組成有顯著影響。 PICRUSt 可以用于樣本腸道微生物群的基因功能預(yù)測。 如圖10 所示，結(jié)果顯示高鹽飲食影響了多個微生物組代謝途徑，下調(diào)較大的途徑為初級膽汁酸生物合成，次級膽汁酸生物合成，果糖和甘露糖代謝，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝；上調(diào)途徑主要為脂肪酸代謝和賴氨酸降解。 總之，上述結(jié)果表明高鹽飲食改變了大鼠腸道微生物群的組成和功能。

圖9 基于LEfSe 分析大鼠腸道菌群組成結(jié)構(gòu)差異Fig. 9 Analysis of differences in the composition and structure of rat intestinal microflora based on LEfSe

圖10 基于PICRUSt 的大鼠腸道菌群基因功能預(yù)測Fig. 10 Genomic functional prediction of rat intestinal microflora based on PICRUSt

2.5 高鹽飲食影響下大鼠基因表達和腸道菌群的串?dāng)_

腸道屏障作為一個通道，通過跨細胞和細胞旁轉(zhuǎn)運機制，使大量代謝產(chǎn)物和免疫信號在腸道和循環(huán)系統(tǒng)之間雙向傳遞[20]。目前的研究發(fā)現(xiàn)，高鹽飲食會損害腸道屏障功能，最終導(dǎo)致細菌內(nèi)毒素進入循環(huán)系統(tǒng)從而引發(fā)免疫反應(yīng)和促炎細胞因子的產(chǎn)生[14]。為了揭示在高鹽飲食的作用下腸道菌群影響靶器官組織基因表達的潛在機制，采用了Spearman 相關(guān)性分析探索了靶器官組織的差異轉(zhuǎn)錄因子與腸道菌群OTUs 之間的共表達關(guān)系。 如圖11 所示，5 個器官組織共有23 個差異轉(zhuǎn)錄因子的表達與9 個微生物群菌屬具有顯著相關(guān)性。 薩特氏菌屬（Sutterella） 主要與結(jié)腸中 Nr0b2、Atf3、Hopx、Hmgb2、Irf1 和Crebrf 的表達高度相關(guān)（見圖11，粉色節(jié)點），乳酸桿菌屬（Lactobacillus）則與多個組織中轉(zhuǎn)錄因子的表達相關(guān)， 如心房的Ciz1 基因 （圖11，藍色節(jié)點）、結(jié)腸的Irf1 和Atf3 基因（見圖11，粉色節(jié)點）、腎髓質(zhì)的Id2 和Zfp91 基因（見圖11，黃色節(jié)點）。

圖11 差異轉(zhuǎn)錄因子與腸道菌群的共表達分析Fig. 11 Co-abundance analysis between differential transcription factors and the gut microbiome

2.6 討論

作者成功構(gòu)建了高鹽飲食誘導(dǎo)的高血壓大鼠模型，與空白對照組相比，高鹽飲食組大鼠的血壓在第8 周開始至第12 周實驗結(jié)束時均顯著升高。為了揭示在高鹽飲食影響下產(chǎn)生高血壓的潛在分子機制，本研究中基于高通量測序技術(shù)探索了高鹽飲食對大鼠模型高血壓靶器官以及腸道微生物群的影響。 本研究中所發(fā)現(xiàn)的一系列差異轉(zhuǎn)錄因子有助于解釋高血壓疾病發(fā)展過程中分子機制，高鹽飲食造成的大鼠腸道菌群組成的改變與微生物組代謝功能失調(diào)密切相關(guān)，并基于多組學(xué)數(shù)據(jù)整合分析為高鹽飲食誘導(dǎo)的高血壓及其靶器官心-腎-腸軸損傷的分子機制提供了新的認識。

轉(zhuǎn)錄因子是細胞對外界環(huán)境刺激和微生物群信號等胞外信號調(diào)節(jié)變化的關(guān)鍵響應(yīng)節(jié)點[21]，明確高鹽飲食所導(dǎo)致的靶器官差異轉(zhuǎn)錄因子有助于更好地理解疾病發(fā)展的分子機制。 通過對高血壓靶器官進行轉(zhuǎn)錄組測序，發(fā)現(xiàn)了一系列失調(diào)的差異轉(zhuǎn)錄因子。 有研究表明，高鹽飲食會導(dǎo)致腸道和血管炎癥，并驅(qū)動T 細胞產(chǎn)生γ 干擾素（IFN-γ）和白細胞介素17A（IL-17A）[22-23]。Irf1 是IFN-γ 介導(dǎo)Th1 細胞炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因[24]。 既往研究表明，Irf1 能夠特異性抑制Foxp3 的表達，負向調(diào)節(jié)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細胞（regulatory T cell，Treg）的發(fā)育和功能，從而破壞宿主免疫穩(wěn)態(tài)[25]。 本研究中發(fā)現(xiàn)了Irf1在高鹽飲食組的結(jié)腸組織中上調(diào)，提示了高鹽飲食造成的腸黏膜損傷和腸道炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵基因。 Id基因家族能夠拮抗堿性-螺旋-環(huán)-螺旋（basic helix-loop-helix，bHLH）轉(zhuǎn)錄因子的表達，抑制上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transformation，EMT）[26-27]。 有研究表明，高鹽飲食會激活大鼠腎小管細胞EMT 過程， 并導(dǎo)致鈣黏蛋白和α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）的異常表達[28]。本研究中，高鹽飲食組中腎臟Id 基因家族的基因表達均降低，高鹽飲食造成的EMT 異常激活可能與Id 基因家族的抑制作用減弱有關(guān)。 Wu 等的研究發(fā)現(xiàn)Zfp91 基因調(diào)控多個與心臟舒張功能相關(guān)基因的表達[29]。 Tanaka 等的研究發(fā)現(xiàn)Epas1 能夠響應(yīng)環(huán)境刺激進而誘導(dǎo)腎上腺髓質(zhì)素的表達，抑制心肌細胞的炎癥反應(yīng)[30]。在本研究中，Zfp91 和Epas1 在高鹽飲食誘導(dǎo)的高血壓大鼠心臟中表達顯著下調(diào)，提示高鹽飲食造成的心臟損害和血壓升高可能與一系列心肌穩(wěn)態(tài)以及炎癥反應(yīng)相關(guān)的基因功能失調(diào)有關(guān)。 高血壓常伴有代謝異常，一些研究發(fā)現(xiàn)機體的能量代謝和鹽的攝入量顯著相關(guān)[6，18，31-32]。 本研究中的GO 分類結(jié)果表明，高鹽飲食組中多個組織的線粒體功能發(fā)生了改變。KEGG 富集表明高鹽飲食造成的功能差異還集中在三羧酸循環(huán)，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，膽固醇代謝等代謝相關(guān)途徑。 Binger 等研究發(fā)現(xiàn)高鹽飲食會抑制巨噬細胞的活化，并通過AKT/mTOR 信號通路破壞線粒體功能[33]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)三羧酸循環(huán)途徑受損與高鹽攝入導(dǎo)致的ATP 生成減少以及氧消耗降低有關(guān)[34-35]。 而脂質(zhì)代謝紊亂將直接導(dǎo)致過量飲食但體質(zhì)量增長緩慢[36]，多種代謝途徑紊亂可能是本研究中高鹽飲食組大鼠體質(zhì)量低于空白對照組的關(guān)鍵原因。

多項研究發(fā)現(xiàn)了長期高鹽飲食改變宿主腸道微生物群的組成[18，37-38]。 最近的研究發(fā)現(xiàn)，失調(diào)的腸道微生物群會產(chǎn)生血管活性激素并促進高血壓的發(fā)生[39-40]。 本研究中發(fā)現(xiàn)在長期高鹽飲食的影響下大鼠的腸道Actinomycetales 水平升高，這與之前一項針對高鹽飲食喂養(yǎng)的小鼠腸道微生物群組成分析結(jié)果一致，這項研究還發(fā)現(xiàn)了腸道放線菌門與保護性SCFA 丁酸呈負相關(guān)， 腸道處于慢性炎癥狀態(tài)[18]。 而本研究中發(fā)現(xiàn)了高鹽飲食組中丁酸的主要產(chǎn)生菌Ruminococcaceae 的相對豐度減少， 進一步驗證了高鹽飲食造成了保護性SCFA 丁酸含量的降低。 SCFA 在人類正常生理過程中起著關(guān)鍵作用，例如丁酸能夠通過抑制IFN-γ/STAT1 信號通路、促進Foxp3 基因表達從而減弱組織炎癥反應(yīng)[41-43]。 此外，在一項針對高血壓患者的腸道微生物群臨床分析研究中發(fā)現(xiàn)，Betaproteobacteria 和Burkholderiales菌群豐度的降低與運動能力減弱顯著相關(guān)[44]，這與本研究中高鹽飲食組大鼠的腸道菌群改變情況以及活動與精神狀態(tài)表現(xiàn)一致，提示了一種新的高鹽飲食所造成的高血壓損傷表型，并可能與腸道菌群的改變密切相關(guān)。 除此之外，本研究中發(fā)現(xiàn)高鹽飲食影響了多個微生物組代謝途徑， 這與Miranda 等的研究結(jié)果[38]一致。 正常情況下，大約有5%的膽汁酸將在腸肝循環(huán)中作為腸道微生物群的轉(zhuǎn)化底物參與體內(nèi)循環(huán)，這些膽汁酸的正常代謝對維持結(jié)腸轉(zhuǎn)錄因子RORγ 和Treg 細胞的穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要[45-47]。此外，在多項關(guān)于高血壓的研究中發(fā)現(xiàn)腸道微生物群的氨基酸代謝途徑異常[38，48-49]，這與本研究中高鹽飲食所導(dǎo)致的高血壓大鼠腸道菌群氨基酸代謝異常的結(jié)果一致。 作者探索了在高鹽飲食影響下腸道微生物群的變化，這些潛在生物途徑以及標(biāo)志物對高鹽飲食造成的腸道損傷以及微生物靶向治療具有重要參考價值。

一些研究發(fā)現(xiàn)了腸道微生物群與炎癥性腸病[50-51]、心血管疾病[52]和腎臟疾病[53-54]等多種疾病都存在一定的聯(lián)系。 高鹽飲食會破壞腸道屏障，導(dǎo)致腸道黏膜滲漏性增高，從而導(dǎo)致內(nèi)毒素等細菌物質(zhì)進入血液參與全身循環(huán)[55-57]。 本研究中發(fā)現(xiàn)，一些腸道微生物群與多個器官組織的基因表達具有顯著相關(guān)性。比如，Sutterella 與結(jié)腸中Nr0b2、Hopx 的表達高度相關(guān)，這些基因主要與代謝功能以及IFN-γ 的轉(zhuǎn)錄激活密切相關(guān)[58-60]。 有多個研究證實，Sutterella 與血壓獨立相關(guān)，并影響腸道免疫調(diào)節(jié)功能[61-63]。 此外，本研究發(fā)現(xiàn)Lactobacillus 與多個組織中的差異轉(zhuǎn)錄因子表達高度相關(guān)。 目前的證據(jù)表明，Lactobacillus與腸道黏膜免疫和屏障功能密切相關(guān)[38]。 目前宿主基因與腸道微生物群的相互作用機制尚不完全清楚，了解微生物與基因組之間的共表達關(guān)系有助于解釋高血壓復(fù)雜的病因和發(fā)病機制。 本研究為揭示高鹽飲食引起的宿主-菌群串?dāng)_提供了可靠的參考依據(jù)。

本研究的局限性在于沒有對大鼠代謝組學(xué)進行進一步檢測，基因組、微生物組以及代謝組的聯(lián)合分析能夠提供更加完備的參考依據(jù)。 此外，本研究中微生物組檢測樣本來源于大鼠糞便，進一步采用結(jié)腸內(nèi)容物進行分析能夠更有效地避免相關(guān)干擾因素。 總之，基于多組學(xué)分析揭示了在高鹽飲食作用下高血壓靶器官基因表達和腸道微生物群的變化。

3 結(jié) 語

本研究中發(fā)現(xiàn)的一系列失調(diào)差異轉(zhuǎn)錄因子和腸道菌群有助于解釋高鹽飲食在高血壓疾病發(fā)展過程中的分子調(diào)控機制，高鹽飲食造成的大鼠腸道菌群組成和功能的顯著變化與多種微生物代謝功能失調(diào)密切相關(guān)。 創(chuàng)新的多組學(xué)關(guān)聯(lián)分析為探索高血壓及其相關(guān)疾病的分子機制提供了理論和實驗基礎(chǔ)，并為腸道菌群的靶向治療提供了實驗依據(jù)。