李艷肖,朱貴爽,張宏宇,向殿軍*,劉 鵬

(1 內(nèi)蒙古民族大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,內(nèi)蒙古通遼 028000;2 內(nèi)蒙古民族大學(xué) 科爾沁沙地生態(tài)農(nóng)業(yè)國家民委重點實驗室,內(nèi)蒙古通遼 028000;3 通遼市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心,內(nèi)蒙古通遼 028000)

轉(zhuǎn)錄因子(transcription factors,TFs)作為調(diào)控基因表達(dá)的蛋白質(zhì)分子,在動植物體內(nèi)通常有著重要的功能,例如在調(diào)控植物的生長發(fā)育、逆境脅迫響應(yīng)、信號傳導(dǎo)和生理代謝等過程[1-2]。而1個結(jié)構(gòu)完整的TFs編碼蛋白質(zhì)通常由4部分組成:DNA結(jié)合域(DNA binding domain)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)域(transcription regulation domain)、寡聚位點(oligomerization site)和核定位域(nuclear localization signal)[3]。一般情況下,TFs并不是獨立發(fā)揮作用的,而是通過DNA結(jié)合域的作用,與其轉(zhuǎn)錄起始上游的啟動子區(qū)域的順式作用元件結(jié)合,并通過與其他蛋白質(zhì)的相互作用共同調(diào)控植物的生長[4]。

目前,在植物中至少已鑒定出64種轉(zhuǎn)錄因子家族[5]。其中,堿性亮氨酸拉鏈(basic leucine zipper,bZIP)基因家族是TFs家族中成員數(shù)量最多的[6]。其特征在于高度保守的bZIP結(jié)構(gòu)域,該結(jié)構(gòu)域由60～80個氨基酸殘基組成,包括堿性區(qū)域和亮氨酸拉鏈(Leu)區(qū)域,這2個功能區(qū)域由鉸鏈區(qū)域連接[3]。其中堿性區(qū)域是高度保守的,大約由16個氨基酸殘基組成,高度保守的N-x7-R/K-x9基序的功能是負(fù)責(zé)核定位和DNA結(jié)合[7];Leu拉鏈區(qū)域則主要由Leu的幾個重復(fù)序列或其他疏水性氨基酸(如Ile、Val、Phe或Met)組成,具有控制轉(zhuǎn)錄激活或轉(zhuǎn)錄抑制的功能[8]。bZIPTFs編碼基因目前已在植物中被廣泛鑒定,包括擬南芥(Arabidopsisthaliana)[9]、水稻(Oryzasativa)[10]、大麥(Hordeumvulgare)[11]、高粱(Sorghumbicolor)[12]、蓖麻(Ricinuscommunis)[13]和葡萄(Vitisvinifera)[14]等植物。

研究表明,bZIP基因參與植物生長發(fā)育的重要調(diào)控過程,如調(diào)節(jié)根系發(fā)育[15]、促進(jìn)花青素積累[16]、整合脫落酸和葡萄糖信號[17]。同樣,bZIP基因也參與調(diào)節(jié)植物在脅迫下的生理反應(yīng)[18-23]。bZIP基因影響許多物種的耐鹽性和耐旱性,例如番茄(Solanumlycopersicum)[18]、大豆(Glycinemax)[19]和人參(Panaxginseng)[20]等植物。朱蕓曄等[21]研究發(fā)現(xiàn)番茄在鹽、干旱和細(xì)菌等脅迫條件下,43個SlbZIP基因能夠被誘導(dǎo)表達(dá),積極參與番茄的逆境反應(yīng);才華等[22]發(fā)現(xiàn)野生大豆(Glycinesoja)GsbZIP33基因響應(yīng)干旱、低溫和鹽脅迫,并且在根和葉片組織中有著不同的表達(dá)模式;人參的157個bZIP基因中,PgbZIP99和PgbZIP78在鹽脅迫下被誘導(dǎo)表達(dá),PgbZIP131在干旱脅迫下表達(dá)值最高[23]。

目前,在蓖麻中共發(fā)現(xiàn)了49個RcbZIP基因[13],但僅對少數(shù)基因的功能進(jìn)行了研究。其中RcbZIP11基因參與非生物脅迫應(yīng)答的研究鮮見報道。鑒于蓖麻優(yōu)良的抗旱和耐鹽堿能力及bZIP基因在植物逆境脅迫中的作用,對蓖麻bZIP基因資源的挖掘是必要的。本研究基于‘通篦5號’葉片轉(zhuǎn)錄組信息,克隆出1個蓖麻的RcbZIP家族成員,對其編碼氨基酸進(jìn)行生物信息學(xué)分析和蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位分析,研究基因在不同逆境脅迫下的表達(dá)特性,包括干旱、鹽、低溫和脫落酸脅迫,以期為蓖麻RcbZIP11基因響應(yīng)環(huán)境脅迫壓力的分子機(jī)制和對基因功能的研究提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗材料及處理

‘通篦5號’由通遼市農(nóng)牧研究所提供;野生型擬南芥種子(Columbia生態(tài)型)保存于實驗室。蓖麻種子經(jīng)75%的酒精消毒后于28 ℃催芽,發(fā)芽后均勻地擺放在發(fā)芽盒中進(jìn)行水培,2片子葉展開后澆灌1/2霍格蘭營養(yǎng)液,至四葉齡對其分別進(jìn)行干旱脅迫(10% PEG 6 000)、高鹽脅迫(300 mmol/L NaCl)、冷脅迫(4 ℃)和脫落酸脅迫(100 μmol/L ABA);擬南芥種子消毒后種植在3∶1比例的花土∶蛭石的花盆中。培養(yǎng)條件是(25±1) ℃/16 h光照和(20±1) ℃/8 h暗處理交替培養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑及儀器

2 x KOD MasterMix高保真酶和DNA提取試劑盒購買于庫萊博;第一鏈cDNA合成試劑盒購自莫納生物公司;SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒、SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒和SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒購買于生工公司;T-載體、載體連接試劑盒、SacⅠ和XbaⅠ內(nèi)切酶購自Takara公司;pCAMBIA2300-GFP載體和大腸桿菌感受態(tài)(TOP10)購于青島艾迪特生物科技公司。植物原生質(zhì)體分離試劑盒Plant Protoplasts Isolation Kit和轉(zhuǎn)染試劑盒Plant Protoplasts Transfection Kit購買于Beyotime生物公司。儀器設(shè)備由內(nèi)蒙古民族大學(xué)農(nóng)學(xué)院和生命科學(xué)與食品學(xué)院提供。本試驗所需引物均使用Snapgene軟件設(shè)計,生工公司合成,序列見表1。

表1 引物序列

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA的提取

將蓖麻真葉放入滅菌后提前預(yù)冷的研缽中,加入液氮研末至粉末狀。使用TransZol法提取總RNA作為模板,使用第一鏈cDNA合成試劑盒合成模板cDNA。

1.2.2RcbZIP11基因全長的克隆及驗證

參考蓖麻轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中RcbZIP11基因的序列信息,設(shè)計特異性引物(表1)。使用上述模板cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增體系包括酶25 μL,上下游引物各2 μL,模板5 μL和dd H2O定容至50 μL,輕柔吹打混勻后,按照95 ℃ 6 min;95 ℃ 15 s,53 ℃ 15 s,72 ℃ 10 s,35個循環(huán);72 ℃ 7 min進(jìn)行反應(yīng),將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%電泳檢測,符合目標(biāo)片段后進(jìn)行膠回收、末端加A及純化。使用載體連接試劑盒將純化產(chǎn)物連接至T載體,熱擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中,經(jīng)菌液PCR檢測合格后進(jìn)行保菌,并將菌液送至生工公司進(jìn)行測序。

1.2.3RcbZIP11基因的生物信息學(xué)分析

在ExPASy(https://web.expasy.org/translate/)網(wǎng)站推導(dǎo)RcbZIP11基因的編碼氨基酸序列;并將氨基酸序列提交至NCBI conserved domain search(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)預(yù)測其結(jié)構(gòu)域;借助ExPASy-ProtParam tool(https://web.expasy.org/protparam)在線工具預(yù)測RcbZIP11蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)和親疏水性;用SOPMA(https://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl)工具預(yù)測蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu);在Phyre2(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)網(wǎng)站預(yù)測RcbZIP11蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu),并對預(yù)測結(jié)果在SAVES v6.0(https://saves.mbi.ucla.edu/)網(wǎng)站進(jìn)行打分,下載拉式構(gòu)象打分圖。將RcbZIP11蛋白質(zhì)序列作為探針,使用在線工具NCBI-Protein Blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome)進(jìn)行序列對比并下載,使用GENEDOC軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)多序列比對分析,在MEGA 11.0軟件上進(jìn)行進(jìn)化樹繪制。

1.2.4 RcbZIP11啟動子序列的克隆及分析

使用DNA提取試劑盒提取蓖麻葉片組織的DNA,1%瓊脂糖電泳檢測合格后將其作為模板,按照1.2.2節(jié)中的擴(kuò)增體系對RcbZIP11基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)上游2 000 bp的啟動子序列進(jìn)行擴(kuò)增,條帶符合預(yù)期大小后,對其進(jìn)行膠回收、末端加A、純化、連接T載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài),操作步驟同1.2.2節(jié),測序由生工公司完成。測序比對結(jié)果正確后,將序列提交至Plant CARE(https://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html)網(wǎng)站預(yù)測啟動子區(qū)域中可能存在的順式作用元件。

1.2.5 RcbZIP11蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位分析

對1.2.2節(jié)中測序正確的菌液進(jìn)行質(zhì)粒提取,以其作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增(引物見表1),將產(chǎn)物進(jìn)行膠回收及純化,片段檢測正確后克隆至pCAMBIA2300-GFP載體的SacⅠ和XbaⅠ酶切位點處,構(gòu)建重組質(zhì)粒pCAMBIA2300-GFP-RcbZIP11,熱擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞,測序正確后提取重組質(zhì)粒。

使用Plant Protoplasts Isolation Kit制備擬南芥原生質(zhì)體,按照Plant Protoplasts Transfection Kit操作步驟分別將pCAMBIA2300-GFP空載體和融合表達(dá)載體pCAMBIA2300-GFP-RcbZIP11轉(zhuǎn)化至原生質(zhì)體中,使用DAPI(4′,6二脒基-2-苯吲哚)對細(xì)胞核進(jìn)行染色,在22 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h。使用激光共聚焦顯微鏡(FV1000)觀察RcbZIP11蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞位置。

1.2.6RcbZIP11基因的時空表達(dá)特性分析

在1.1.1節(jié)中,取未處理幼苗的根、莖、真葉和子葉組織進(jìn)行RcbZIP11的組織表達(dá)模式分析;取脅迫處理0,6,12,24,36 h的真葉和根組織檢測RcbZIP11在脅迫處理下的表達(dá)模式。同1.2.1節(jié)操作步驟提取植物組織的總RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,RcbZIP11-Q-F和RcbZIP11-Q-R為基因的熒光表達(dá)擴(kuò)增引物(表1)。反應(yīng)體系為正反向引物各0.2 μL,模板1 μL,SybrGreen qPCR Master Mix 5 μL和ddH2O定容至10 μL。每組處理進(jìn)行3次生物學(xué)和技術(shù)性重復(fù)以保證結(jié)果準(zhǔn)確。根據(jù)公式2-ΔΔCT計算RcbZIP11的相對表達(dá)量[24],并使用SPSS和Excel軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,使用TBtools軟件的fancy heatmap程序繪制圖片。

2 結(jié)果與分析

2.1 RcbZIP11基因的克隆

RcbZIP11基因全長的克隆結(jié)果如圖1所示,擴(kuò)增片段大小在500～750 bp之間,符合預(yù)期片段,測序后發(fā)現(xiàn)其cDNA全長643 bp,其中CDS有492 bp,CDS區(qū)內(nèi)無內(nèi)含子的存在,共編碼163個氨基酸,序列信息見圖2。將序列提交至GenBank,將其命名為RicinuscommunisbZIP11(RcbZIP11),登錄號為OQ506490。

2.2 RcbZIP11基因的生物信息學(xué)分析

2.2.1 RcbZIP11蛋白質(zhì)的保守域分析

如圖3,經(jīng)NCBI-CD Search預(yù)測后發(fā)現(xiàn),RcbZIP11蛋白質(zhì)有1個保守的bZIP_plant_GBF1結(jié)構(gòu)域,是bZIP超家族的一員。

圖3 RcbZIP11蛋白質(zhì)的保守域分析

2.2.2 RcbZIP11蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)及親疏水性分析

RcbZIP11蛋白質(zhì)的分子式為C787H1271N243O262S10,相對分子質(zhì)量是18.65 kD,理論總原子數(shù)是2 573個,理論等電點是6.14。

組成RcbZIP11蛋白質(zhì)的163個氨基酸殘基中,Ser和Leu含量最高,分別有13.5%和10.4%,含量最低的是Phe,有1.8%;帶正電的氨基酸殘基(Arg+Lys)少于帶負(fù)電的氨基酸殘基(Asp+Glu),分別為15個和18個。脂肪系數(shù)是77.24,總平均疏水性是-0.722,說明RcbZIP11是1個親水性蛋白質(zhì)(圖4)。

圖4 RcbZIP11蛋白質(zhì)的親疏水性分析

2.2.3 RcbZIP11蛋白質(zhì)的序列分析

將RcbZIP11蛋白質(zhì)同其他植物的bZIP氨基酸序列進(jìn)行比對(圖5),發(fā)現(xiàn)不同物種的bZIP氨基酸的序列一致性是68.37%,在bZIP_plant_GBF1結(jié)構(gòu)域內(nèi)氨基酸的一致性較高,而C端保守性很弱。在NCBI數(shù)據(jù)庫種下載了銀白楊(Populusalba,XP_034931683.1)、毛果楊(Populustrichocarpa,XP_002306888.1)、麻風(fēng)樹(Jatrophacurcas,XP_012071923.1)、可可樹(Theobromacacao,XP_007017624.1)、桃(Prunuspersica,XP_007223601.1)、黃瓜(Cucumissativus,XP_004152685.1)、葡萄(Vitisvinifera,XP_003634372.1)、番木瓜(Caricapapaya,XP_021905988.1)、擬南芥(NP_195185.1)和水稻(XP_015622690.1)等10個物種的bZIP蛋白質(zhì)序列文件,并與蓖麻RcbZIP11蛋白質(zhì)進(jìn)行進(jìn)化樹構(gòu)建,發(fā)現(xiàn)RcbZIP11與麻風(fēng)樹JcbZIP11因緣關(guān)系最近(圖6)。

顏色越深代表序列一致性越高;AtbZIP11.擬南芥(NP_195185.1); CcbZIP11.黃瓜(XP_004152685.1); GmbZIP11.大豆(KAH1220101.1); CabZIP11.辣椒(XP_016539772.1); NtbZIP11-like.煙草(XP_009619503.1)。黑色橫線是bZIP_plant_GBF1結(jié)構(gòu)域。

圖6 RcbZIP11蛋白質(zhì)的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析

2.2.4 RcbZIP11蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

RcbZIP11蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果(圖7)顯示,其包含98個α螺旋、2個β折疊、57個隨機(jī)線圈和6個延伸鏈,分別占總氨基酸殘基的60.12%、1.23%、34.97%和3.68%。二級結(jié)構(gòu)進(jìn)一步卷曲折疊形成了RcbZIP11蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)(圖8,A),與模型c1gd2G的一致性高達(dá)99.3%(一致性>60%為準(zhǔn)確),c1gd2G模型是pop1蛋白bZIP結(jié)構(gòu)域的典型結(jié)構(gòu),再次在結(jié)構(gòu)上驗證了RcbZIP11蛋白質(zhì)屬于bZIP家族;此外,RcbZIP11蛋白質(zhì)的拉式構(gòu)象圖預(yù)測結(jié)果(圖8,B)顯示,氨基酸殘基在最佳允許區(qū)(紅色區(qū)域:A、B和L區(qū))的數(shù)量占比是100%,說明RcbZIP11蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果是非?？煽康?。

藍(lán)色.α螺旋;綠色.β折疊;紫色.隨機(jī)線圈;紅色.延伸鏈。

A. RcbZIP11蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu);B.拉式構(gòu)象圖。

2.3 RcbZIP11啟動子序列的克隆及分析

如圖9,經(jīng)PCR法克隆出RcbZIP11的啟動子片段,測序結(jié)果與RcbZIP11啟動子預(yù)測序列結(jié)果一致,表明成功克隆出RcbZIP11啟動子序列。

M. DL 2 000 DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn); 1. RcbZIP11啟動子克隆產(chǎn)物。

Plant CARE數(shù)據(jù)庫預(yù)測結(jié)果(表2)顯示,該序列除了核心元件(TATA-box和CAAT-box)外,還存有光響應(yīng)元件(GT1-motif和G-box)、激素響應(yīng)類元件(GARE-motif、TCA-element、CGTCA-motif和TGACG-motif)和脅迫響應(yīng)類元件(GC-motif、MBS和CCAAT-box),說明RcbZIP11啟動子可能受到非生物脅迫和激素脅迫的誘導(dǎo),參與植物的逆境脅迫響應(yīng)。

2.4 RcbZIP11蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位分析

如圖10,激光共聚焦顯微鏡下的空載體(對照,pCAMBIA2300-GFP)綠色熒光在細(xì)胞核和細(xì)胞膜均有顯示,而轉(zhuǎn)入融合表達(dá)載體pCAMBIA2300-GFP-RcbZIP11的擬南芥原生質(zhì)體的綠色熒光與細(xì)胞核特意標(biāo)記位置重疊,說明RcbZIP11蛋白質(zhì)定位在細(xì)胞核,可能在細(xì)胞核中發(fā)揮作用。

2.5 RcbZIP11基因的時空表達(dá)特性分析

2.5.1 組織表達(dá)模式

圖11顯示,在蓖麻的不同組織中RcbZIP11基因的表達(dá)量不同,RcbZIP11基因在各個組織中均有表達(dá),其中在子葉中RcbZIP11基因的表達(dá)量最高,其次是真葉組織;在根中表達(dá)量最低,其次是莖組織;RcbZIP11基因在子葉中的相對表達(dá)量是根中表達(dá)量的3.28倍。

圖11 RcbZIP11基因的組織表達(dá)模式

2.5.2 非生物脅迫表達(dá)模式

圖12顯示,RcbZIP11基因的時空表達(dá)模式會受到干旱脅迫(PEG)、高鹽脅迫(NaCl)、冷脅迫(4 ℃)和脫落酸脅迫(ABA)的誘導(dǎo),且每個時段RcbZIP11基因的表達(dá)量均高于0 h。

組織內(nèi)不同字母表示脅迫時間之間在0.05水平差異顯著(P<0.05)。

在干旱脅迫下(圖12,A),RcbZIP11基因在真葉和根中均呈現(xiàn)雙峰表達(dá)模式,并且分別在第12 h和第6 h首次出現(xiàn)表達(dá)峰值;在高鹽脅迫下(圖12,B),RcbZIP11基因在真葉和根中呈現(xiàn)出先上升后下降的表達(dá)趨勢,除在第12 h時RcbZIP11基因在根中的表達(dá)量高于真葉組織,在其余時間點RcbZIP11基因均在葉片中高表達(dá);在低溫脅迫下(圖12,C),RcbZIP11基因在真葉組織中呈現(xiàn)出雙峰表達(dá)模式,且分別在第6 h和第36 h出現(xiàn)表達(dá)峰值,在根中呈現(xiàn)出先上升后下降的表達(dá)模式,且在第24 h出現(xiàn)表達(dá)峰值;在ABA脅迫下(圖12,D),RcbZIP11基因在根和葉片中表現(xiàn)出相似的時空表達(dá)模式,但RcbZIP11基因在葉片中的表達(dá)量要遠(yuǎn)高于根組織。

綜上,RcbZIP11基因能夠迅速響應(yīng)非生物脅迫,積極地參與蓖麻的非生物脅迫調(diào)控模式。

3 討 論

bZIP基因在高等植物中普遍存在,積極參與調(diào)節(jié)著植物的生物和非生物脅迫應(yīng)答及生長發(fā)育[1-2,25]。本研究從蓖麻品種‘通篦5號’中克隆到RcbZIP11基因,并對該基因或其所編碼的氨基酸序列進(jìn)行了理化性質(zhì)分析、表達(dá)特性研究和亞細(xì)胞定位分析,還克隆了RcbZIP11轉(zhuǎn)錄起始上游2 000 bp的啟動子序列,分析該區(qū)域的順式作用元件。RcbZIP11蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)分析結(jié)果顯示,與橡膠草(Taraxacumkok-saghyz)[26]、馬鈴薯(Solanumtuberosum)[27]和白桑(Morusalba)[28]的bZIP11蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)不同,說明bZIP11蛋白質(zhì)在不同物種間的進(jìn)化存有差異,這可能與其編碼基因響應(yīng)不同的逆境有關(guān)[26-28]。研究表明,蓖麻的49個RcbZIP蛋白質(zhì)共分為9個亞簇,分別是A～I(xiàn)簇,其中E、G和H亞簇所含蛋白質(zhì)數(shù)量最多,分別有11,9,7個[13]。RcbZIP30/4/16/37/48/11/44/17/19隸屬于G亞簇,該簇的特征結(jié)構(gòu)域是bZIP_plant_GBF1結(jié)構(gòu)域[7,13,18]。本研究結(jié)果顯示,RcbZIP11基因所推導(dǎo)的氨基酸序列中擁有bZIP_plant_GBF1結(jié)構(gòu)域,推測其屬于GBF1類bZIP轉(zhuǎn)錄因子,與蓖麻G亞簇的RcbZIP30/4/16/37/48/44/17/19蛋白質(zhì)可能存在功能上的冗余[13]。研究發(fā)現(xiàn),bZIP轉(zhuǎn)錄因子的在細(xì)胞中的位置主要定位于細(xì)胞核[29]。辣椒(Capsicumannuum)的CAbZIP1-GFP融合蛋白瞬時轉(zhuǎn)化擬南芥原生質(zhì)體,結(jié)果顯示該蛋白定位于細(xì)胞核[30];小麥(Triticumaestivum)的TabZIP1-GFP融合蛋白在洋蔥表皮細(xì)胞中瞬時表達(dá)也得了相同結(jié)論,TabZIP1蛋白質(zhì)同樣是1個核蛋白[31]。筆者構(gòu)建了RcbZIP11蛋白質(zhì)的融合蛋白pCAMBIA2300-GFP-RcbZIP11,在擬南芥原生質(zhì)體中瞬時表達(dá),得到的結(jié)果與前人研究結(jié)果一致。

啟動子作為研究基因表達(dá)及功能的重要作用元件,可以與bZIP轉(zhuǎn)錄因子的堿性區(qū)域結(jié)合,進(jìn)而調(diào)控下游基因的表達(dá)[4]。一般地,bZIP轉(zhuǎn)錄因子會優(yōu)先結(jié)合以ATGC為核心的順式作用元件,如A-box、C-box、G-box和ABRE元件[32-33]。甘薯(Pomoeabatatas)的IbbZIP22啟動子區(qū)域中就有多個G-box和MBS元件,還有多個茉莉酸甲酯(MeJA)和ABA誘導(dǎo)元件,說明IbbZIP22轉(zhuǎn)錄因子可能會受到MYB的調(diào)控,基因的表達(dá)會受到MeJA和ABA激素的誘導(dǎo)[34]。RcbZIP11啟動子中也同樣有G-box核心元件(CACGTC)、MYB結(jié)合位點(CAACTG)、水楊酸誘導(dǎo)元件(CCATCTTTTT)、MeJA誘導(dǎo)元件(CGTCA和TGACG)和赤霉素誘導(dǎo)元件(TCTGTTG),說明RcbZIP11基因的表達(dá)可能會受到激素和干旱誘導(dǎo)的調(diào)控,RcbZIP11基因在干旱脅迫(圖12,A)下的表達(dá)模式也驗證了這一猜想,但是該基因在植物應(yīng)對干旱脅迫過程中的潛力需進(jìn)一步驗證。研究表明,bZIP轉(zhuǎn)錄因子在植物應(yīng)對不利環(huán)境的應(yīng)答過程中扮演著重要的角色,包括鹽、干旱、低溫、滲透脅迫和機(jī)械損傷等多種環(huán)境壓力[21,25,35],bZIP通常情況下是通過基因的過量表達(dá)來應(yīng)對上述非生物脅迫的。例如,MtbZIP2和MtbZIP26基因的過量表達(dá)可提高蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)植株在鹽脅迫下的適應(yīng)能力[36];蘋果(Maluspumila)的MdbZIP2/8/10/39/46/60/69/72/78/79/94/96/99/104/109基因在干旱脅迫下的根和葉片組織中特異性表達(dá),說明這16個基因?qū)μO果植株應(yīng)對干旱脅迫有重要意義[37];大豆的GmbZIP44、GmbZIP62和GmbZIP78基因在冷脅迫下表達(dá)量攀升,促進(jìn)了大豆葉片脯氨酸的合成,提高了植物在冷脅迫中的存活能力[38]。蓖麻RcbZIP11基因時空表達(dá)模式顯示,RcbZIP11基因表達(dá)受非生物脅迫的誘導(dǎo),在干旱、鹽、低溫和ABA脅迫下的基因表達(dá)量攀升,均高于0 h,說明RcbZIP11基因積極參與蓖麻植株對非生物脅迫的應(yīng)答,這與前人研究結(jié)果[13]一致。

綜上,本研究對‘通篦5號’RcbZIP11基因和啟動子進(jìn)行克隆,對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析和基因的表達(dá)模式分析,探討了RcbZIP11蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能,再通過構(gòu)建RcbZIP11蛋白質(zhì)的熒光表達(dá)載體,明確其亞細(xì)胞定位,為蓖麻RcbZIP11基因在應(yīng)對非生物脅迫過程中的功能奠定了基礎(chǔ),后續(xù)可構(gòu)建RcbZIP11基因的過表達(dá)載體,通過轉(zhuǎn)化模式植物進(jìn)一步明確該基因的具體功能。