任曉敏,云 嵐,2*,艾 芊,李 珍,趙 喬,石鳳翎

(1 內蒙古農業(yè)大學 草原與資源環(huán)境學院,呼和浩特 010018;2 草地資源教育部重點實驗室,呼和浩特 010011;3 中國科學院深圳先進技術研究院,深圳 518055)

IPT基因編碼的異戊烯基轉移酶(isopentenyl-transferases),是細胞分裂素(cytokinin,CK)合成過程中的第一限速酶[1],即使IPT基因表達很低也可以促進細胞分裂素的增加,而CK具有促進細胞分裂以及根部分化等作用[2],和植物產量密切相關。在油菜中,過表達SAG12-ipt基因的植株相比正常植株的分枝數明顯增加,在一定程度上為提高油菜單產提供了新的優(yōu)質材料[3]。ipt基因與果蠅熱激蛋白hsp70啟動子相結合轉化藍雪葉煙草,陽性植株側芽明顯增多,植株相對矮小,其體內的細胞分裂素含量增加了幾十倍到上百倍[4]。中間偃麥草是優(yōu)質的禾本科牧草,有研究構建ipt基因的雙元表達載體通過基因槍轟擊法獲得中間偃麥草的陽性過表達植株,陽性植株相比未轉化植株有明顯的叢生矮化現象,同時植株內的細胞分裂素含量也相對增加[5]。中國牧草產業(yè)起步較晚,育種技術相對落后,導致突破性品種少,優(yōu)質本土牧草的推廣范圍小,牧草種子很大程度上仍需靠進口補給[6]。

新麥草[Psathyrostachysjuncea(Fisch.) Nevski]又名俄羅斯野黑麥(Russian wildrye),是一種適應半干旱氣候的冷季型牧草,是新麥草屬中唯一的刈割放牧兼用型草種[7],也是禾谷類作物改良的潛在種質資源[8],在中國主要分布在內蒙古和新疆等地,具有抗寒、抗旱、耐鹽堿、耐牧、返青早等優(yōu)良特性,在北方寒旱區(qū)生態(tài)治理方面具有重要價值[9]。隨著中國畜牧業(yè)高質量發(fā)展和生態(tài)治理的逐步推進,對優(yōu)質高產草種的需求不斷增加,提高草產量成為當下草育種需要解決的關鍵問題。

前期研究發(fā)現并篩選了和新麥草分蘗相關的基因,其中IPT在新麥草中與調控分蘗形成有關[10],而分蘗數是影響新麥草飼草和種子產量的關鍵因素之一。目前新麥草中的IPT基因功能尚未被驗證,相關試驗分析也鮮見報道。因此,本試驗通過定量實時PCR(qRT-PCR)對IPT基因在新麥草少分蘗(ST)和多分蘗(DT)材料中的表達量進行了分析,并從新麥草中克隆出該基因,利用同源性比較及生物信息學分析其蛋白結構和特性;構建過表達載體并通過煙草的瞬時轉染鑒定該基因的表達性并分析其在煙草中的亞細胞定位情況;通過蛋白質印跡法(Western blot)檢測該基因在蛋白水平的表達,為深入了解IPT基因在多年生禾本科牧草生長發(fā)育中的作用機制及新麥草IPT基因功能驗證提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材 料

研究以種植于內蒙古呼和浩特市牧草資源圃的30株ST型和30株DT型的新麥草為材料,取分蘗節(jié)提取總RNA,進行RNA-seq測序。另取相同生育期的DT型新麥草材料的分蘗節(jié)提取總RNA,進行qRT-PCR驗證,以種植1個月左右的煙草為瞬時轉染材料。植物過表達載體為1300-cYFP,轉化用的菌株為DH5α感受態(tài),侵染煙草用的農桿菌菌株為GV3101感受態(tài),卡那霉素(Kan)、利福平(Rif)均由中國科學院深圳先進技術研究院合成所實驗室保存。

1.2 方 法

1.2.1IPT基因的表達量分析

通過3種內參基因穩(wěn)定性評估軟件Ge Norm、Norm Finder和Best Keeper 對RNA-seq數據進行分析,篩選出表達穩(wěn)定的IPT基因,通過軟件IBM SPSS Statistics 23和在線網站(http://www.geneontology.org/)分別進行IPT基因在DT及ST中的表達量和基因本體(GO)分析。利用Primer Premier 5.0軟件設計引物(表1),以新麥草分蘗節(jié)為材料用天根試劑盒提取總RNA并反轉錄cDNA,以4個質量濃度梯度的1 μL cDNA為模板,上下游引物各0.6 μL,2×Talent qPCR Pre Mix 10 μL,RNase-free ddH2O 7.8 μL,總體系20 μL,進行qRT-PCR驗證,通過qRT-PCR的標準曲線評估IPT的擴增效率,用2-ΔΔCT法計算IPT分別在DT和ST種的表達量,并用微生信(http:// www.bioinformatics.com.cn)平臺進行作圖分析。

表1 新麥草IPT基因引物

1.2.2IPT基因克隆及過表達載體構建

提取DT型新麥草材料分蘗節(jié)的總RNA,并反轉錄成cDNA,通過SnapGene 6.0.2軟件設計PCR及1300連接引物(表1),以2 μL的cDNA為模板,2×Phanta Max Master Mix 25 μL,上下游引物各2 μL,ddH2O補足到50 μL進行PCR反應,PCR反應程序為:95 ℃ 3 min 1個循環(huán),95 ℃ 15 s、56 ℃ 15 s、72 ℃ 1 min 30 s共35個循環(huán),72 ℃ 5 min 1個循環(huán),4 ℃∞,反應結束后加10 μL 6×Loading buffer進行聚丙烯酰胺凝膠電泳,按照天根膠回收試劑盒的方法對目的條帶進行膠回收,并用全式金的Blunt基因克隆試劑盒將膠回收產物與Blunt進行連接轉化,挑取單菌落于10 μL ddH2O中,以M13F和M13R為引物進行菌液PCR,反應程序為:94 ℃ 5 min 1個循環(huán),94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min 30 s共30個循環(huán),72 ℃ 5 min 1個循環(huán),4 ℃ ∞,選取陽性菌液加到1×LB 5 mL+50 mg/mL卡那霉素5 μL的搖菌管中過夜搖菌,按照天根試劑盒質粒小提試劑盒提取質粒,并測序。取測序正確的克隆質粒為模板加0.5 μL,上下游引物為1300連接引物各2 μL,其余同PCR反應,總體系50 μL,電泳后膠回收,用SpeI酶1.5 μL和Cut Smart 5 μL,37 ℃水浴鍋中單酶切20 μL 1300-cYFP載體質粒2 h,總體系50 μL,加10 μL 6×Loading buffer進行聚丙烯酰胺凝膠電泳,電泳結束后膠回收,將上述2個膠回收產物進行連接轉化,2 μL 5×CEⅡ buffer,1 μL E×naseⅡ,膠回收產物共7 μL,總體系10 μL,37 ℃反應30 min,菌液PCR引物為實驗室保存的1300上下游引物,轉化及提質粒測序同克隆過程。

1.2.3 1300-cYFP-IPT過表達載體農桿菌轉化

取出保存在-80 ℃冰箱中的GV3101感受態(tài)菌株于冰上融化,分裝后將連接產物加入混勻,冰上靜置20 min,液氮冰浴1 min,37 ℃熱擊5 min,冰浴2 min,在超凈臺中加入1 mL 1×LB,30 ℃復蘇2 h,4 000 r/min離心3 min,留少許上清重懸菌體,涂在含Kan和Rif的抗性版上,30 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 d,將菌落挑到含Kan和Rif抗生素的5 mL 1×LB中,30 ℃過夜小搖,吸取1 mL小搖后的菌液于20 mL 1×LB(含Kan和Rif)中,30 ℃ 200 r/min大搖12 h,落地離心機4 000 r/min離心30 min,倒干凈上清后加入2 mL侵染液重懸,4 000 r/min離心10 min,侵染液為1 mol/L MgCl2500 μL,1 mol/L MES 500 μL,200 mmol/LAS 50 μL,超純水定容到50 mL,倒掉離心后的上清,加2 mL侵染液重懸后作為母液,另取新的50 mL離心管倒入15 mL侵染液,加入適當母液,以侵染液為標準測菌液的OD600,OD600值在0.5～0.6為宜。

1.2.4 煙草瞬時轉染及亞細胞定位

取上述配好的菌液,用1 mL的注射器吸取菌液注射煙草葉片背面,注射2株煙草,共6片葉子,短日照培養(yǎng)2 d,取葉片組織于尼康共聚焦AX顯微鏡下觀察拍照。

1.2.5 SDS-PAGE凝膠電泳及Western blot

將上述注射過菌液的煙草葉片于液氮中研磨,研磨后置于1.5 mL離心管中,加入等量的2×SDS loading buffer,渦旋混勻,沸水浴加熱10 min,12 000 r/min離心2～5 min,取上清即為蛋白上樣液。取12孔的預制膠,安裝在電泳槽中,倒入1×SDS-PAGE電泳緩沖液,向膠孔中點入蛋白上樣液和混入二倍體積2×SDS loading buffer的全新預染彩色蛋白Marker,電壓120 V電泳1～1.5 h。待電泳快結束前,用甲醇浸泡PVDF膜,然后放入電轉液中,同時將濾紙也放入電轉液中,電轉液由5.8 g Tris、2.9 g甘氨酸、0.37 g SDS和200 mL甲醇配制而成,并由ddH2O定容至1 L,電泳結束后,將凝膠置于1層海綿和3層濾紙之上,覆蓋1層PVDF膜、3層濾紙和1層海綿于電泳槽中4℃恒壓100 V轉膜60～90 min。轉膜完成后,取出PVDF膜于孵育盒中,加入封閉液,室溫40 r/min搖1 h,封閉液是含5%脫脂奶粉的1×TBST(20×TBST、Tween-20和ddH2O組成),結束后倒掉封閉液,加入含GFP抗性的封閉液室溫低速搖1 h,倒掉上述封閉液,加入1×TBST低速搖床洗滌10 min,共3次,倒掉1×TBST,加入含標記山羊抗小鼠的封閉液,室溫40 r/min搖1 h,倒掉封閉液,1×TBST低速搖床洗滌5 min,共2次,向PVDF膜滴加ECL工作液(等量的BeyoECL Moon A液和B液混合),于WB曝光儀成像拍照。

1.2.6IPT基因生物信息學分析

以克隆出的新麥草IPT基因氨基酸序列為模板,通過NCBI數據庫中的BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行同源序列比對,獲得小麥(Triticumaestivum)等9個物種的氨基酸序列信息(表2),利用DNAMAN軟件對以上10個物種進行序列比對,通過NCBI中的Structure(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)對新麥草IPT編碼蛋白的保守結構域進行分析,利用PRABI中的SOPMA(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)進行新麥草IPT蛋白的二級結構預測,并通過在線軟件NetPhos 3.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)對新麥草IPT蛋白磷酸化位點進行預測。

表2 近緣物種IPT氨基酸序列信息

2 結果與分析

2.1 新麥草IPT基因GO分析

通過對新麥草IPT基因進行GO富集分析(表3)顯示,IPT在細胞組分中主要與線粒體和質體相關,并參與tRNA修飾的生物學過程,同時與tRNA二甲基烯丙基轉移酶活性相關,在新麥草多分蘗型材料中起到上調的作用。

表3 IPT基因GO分析

2.2 新麥草IPT基因表達量分析

通過對RNA-seq的數據分析(圖1)顯示,IPT在多分蘗的新麥草中表達量遠高于少分蘗中的表達量,qRT-PCR試驗結果與RNA-seq數據分析結果一致,在ST和DT中IPT基因表達差異顯著,說明IPT在新麥草分蘗過程中起到一定的調控作用,且在該過程中上調新麥草分蘗數。

圖1 新麥草IPT基因表達量分析

2.3 新麥草IPT基因克隆及過表達載體構建

以DT型新麥草為材料,提取分蘗節(jié)總RNA,以反轉錄的cDNA為模板,進行PCR反應并克隆IPT基因,結果顯示在目的片段位置成功克隆出了新麥草IPT基因,該基因片段大小為1 362 bp(圖2,A),以克隆質粒為模板,成功構建了1300-cYFP-IPT過表達載體,其菌液PCR顯示均為目的片段大小(圖2,B)。

圖2 新麥草IPT基因克隆及1300-cYFP-IPT載體菌液PCR

2.4 1300-cYFP-IPT過表達載體亞細胞定位

為了研究新麥草IPT蛋白在細胞中的表達狀態(tài)及定位情況,將構建成功的1300-cYFP-IPT過表達載體和1300-cYFP載體轉化GV3101農桿菌,注射到煙草的葉片中,在共聚焦顯微鏡下觀察,結果(圖3)顯示,空載1300-cYFP可以正常表達,新麥草IPT蛋白定位于葉綠體中,且能夠在植株中正常表達。

2.5 Western blot分析

通過蛋白質印跡法分析目的蛋白IPT的表達情況,結果(圖4)顯示,連接1300-cYFP載體的IPT能夠正常表達,位置大小在76.8 kD,說明1300-cYFP-IPT過表達載體可以轉入到目的植物中表達。

圖4 新麥草IPT蛋白印跡

2.6 近緣物種多序列比對及分析

新麥草與其近緣物種的IPT氨基酸序列比對圖中不同顏色代表氨基酸序列的保守程度(圖5),其中黑色代表序列的高度保守性,結果顯示,新麥草與9個近緣物種的氨基酸序列相似度較高,尤其同二粒小麥(Triticumdicoccoides)、小麥(Triticumaestivum)及硬粒小麥(Triticumturgidumsubsp.durum)的氨基酸序列相似度最高,說明IPT基因在新麥草及麥類作物中可能具有相似的功能。

2.7 新麥草IPT保守結構域及二級結構分析

新麥草IPT保守結構域分析(圖6)顯示,該蛋白存在PLN02840結構域,該結構域是tRNA二甲基烯丙基轉移酶家族保守結構域,其范圍是從第58位氨基酸開始,到第453位氨基酸結束。通過SOPMA對IPT蛋白二級結構分析(圖7)發(fā)現,該蛋白二級結構由α-螺旋、延伸鏈、β-轉角和不規(guī)則卷曲組成,其中α-螺旋有211個氨基酸,占46.58%;延伸鏈有49個氨基酸,占10.28%;β-轉角有24個氨基酸,占5.3%;不規(guī)則卷曲有169個氨基酸,占37.31%。

圖6 新麥草IPT保守結構域

圖7 新麥草IPT蛋白質二級結構預測

2.8 新麥草IPT編碼蛋白磷酸化位點預測

磷酸化位點分析結果(圖8)顯示,IPT蛋白共有55個磷酸化位點,其中絲氨酸有38個,蘇氨酸有11個,酪氨酸有6個。絲氨酸的磷酸化位點最有可能是潛在的磷酸化位點,它們的值遠遠高于臨界值0.5,表明該蛋白可能通過調控相應的磷酸化位點發(fā)揮功能。

圖8 新麥草IPT蛋白磷酸化位點預測

3 討 論

異戊烯基轉移酶(isopentenyl-transferases,IPT)是細胞分裂素(CK)合成過程中的重要限速酶[1],主要由植物和細菌產生,包括植物促生細菌(PGPB)和植物病原細菌,其中與PGPB相關的IPT主要傾向于和其他參與細胞分裂素代謝及降解的基因共發(fā)生[11],而CK是植物生長發(fā)育過程中的重要激素,在植物細胞分裂、分枝數目及形成愈傷組織等方面起調控作用,具有提高植物產量的巨大潛力[12],推測新麥草IPT主要是與植物促生細菌相關的酶,進而調控植株分蘗數,影響新麥草產量。

IPT基因表達量分析顯示,在新麥草分蘗數較多的材料類型中,IPT基因顯著上調,這與中間偃麥草的IPT基因研究結果相同,其陽性過表達植株中的細胞分裂素含量明顯增加,植株也出現了明顯的叢生矮化現象[5],北沙參異戊烯基轉移酶GlIPT1基因在北沙參香豆素合成途徑中表達量上調,為后續(xù)北沙參高產植株的研究奠定了基礎[13],與SSU(磷酸核酮糖羧化酶小亞基啟動子)融合的IPT基因在轉基因煙草中表達后,煙草的細胞分裂素水平明顯提高,相比正常煙草約增加了10倍,其形態(tài)上也表現出枝葉生長茂盛等典型的細胞分裂素作用反應[14],油菜中過表達SAG12-ipt基因的植株分枝數明顯增加,一定程度上可以提高油菜的產量[3],結合前期研究,推測新麥草IPT基因也是通過提高內源細胞分裂素含量來調控植株分蘗數量的。

通過PCR法從新麥草中成功克隆了IPT基因的全長并構建了1300-cYFP-IPT過表達載體,對其全長的氨基酸序列進行了相關生物信息學分析,多序列比對發(fā)現小麥類禾本科植物的IPT基因與新麥草的相似度最高,親緣關系最近,說明新麥草IPT蛋白和小麥類的IPT蛋白有功能相似的部分,新麥草IPT存在tRNA二甲基烯丙基轉移酶家族保守結構域,說明該蛋白為tRNA型IPT[12],該類型的異戊烯基轉移酶可以催化生成順式玉米素(cis-zeatincZ),從而影響細胞分裂素的合成[15],過表達該基因的轉基因植株細胞分裂素水平明顯提高,導致植株頂端優(yōu)勢消失,促進側芽生長[16]。蛋白質二級結構骨架中的原子之間通過相互作用進而形成多肽并決定蛋白質的結構,從而影響蛋白的生化功能[17],新麥草IPT蛋白質二級結構主要由α-螺旋、延伸鏈、β-轉角和不規(guī)則卷曲組成,探究其蛋白二級結構有助于揭示該蛋白的功能。磷酸化是生物體內的一種翻譯后修飾,可調節(jié)蛋白質活力及功能,絲氨酸、酪氨酸和蘇氨酸是常見的可磷酸化修飾的氨基酸,新麥草中IPT的磷酸化修飾位點主要是絲氨酸磷酸化位點,而磷酸化可以激活或失活蛋白質,從而調控細胞分裂素的合成,調控新麥草的分蘗數[18],以進一步改善新麥草的產量。

蛋白的亞細胞定位與其生物學功能有很強的相關性,擬南芥中個分支的AGO分別定位于細胞質、細胞核及核質-細胞質雙重亞細胞定位,定位于核質-細胞質中的蛋白功能更加豐富[19],因此研究新麥草IPT蛋白的亞細胞定位有助于其功能的進一步解析,新麥草IPT蛋白定位于葉綠體中,與藜麥的CqIPT蛋白研究結果相符,CqIPT蛋白均能定位到葉綠體中[1],苦參8-異戊烯基轉移酶基因的蛋白質亞細胞定位預測顯示也定位于葉綠體中[20],以上結果均與新麥草的IPT蛋白定位相同,說明葉綠體是新麥草IPT蛋白發(fā)揮功能的主要場所,且蛋白均能正常表達,Western blot的結果也同樣證實了新麥草IPT蛋白可在目標植物中正常表達。煙草的瞬時表達可以為后續(xù)IPT在目標植物中表達提供可行性依據,瞬時表達是以非整合的方式將外源基因導入到目標物種的細胞中,在短時間內驗證目的基因表達情況的技術[21-22],水母雪蓮[23]和二穗短柄草[24]的相關基因研究均以該方式對蛋白定位及表達進行了探討。利用煙草的瞬時轉染及Western blot鑒定新麥草IPT基因在植物中的表達情況,可為后續(xù)新麥草的功能驗證提供理論與技術基礎。

本研究克隆得到了新麥草IPT基因,并構建了1300-cYFP-IPT過表達載體,IPT基因的cDNA全長序列為1 362 bp;通過生物信息學分析及試驗驗證等方式分析了新麥草IPT基因的表達情況及其蛋白的功能,顯示IPT基因在密集分蘗型新麥草中的表達量遠遠高于稀疏分蘗型當中的表達量,說明IPT是調控新麥草分蘗的上調基因,蛋白質印跡法和煙草瞬時轉化顯示IPT蛋白均可以正常表達,其亞細胞定位于葉綠體中,推測在新麥草中該基因會正常表達;新麥草IPT主要與二粒小麥、小麥及硬粒小麥親緣關系較近,推測新麥草IPT與小麥類的IPT具有相似的功能,但IPT相關功能還需要進一步驗證,本研究將為后續(xù)IPT基因在新麥草分蘗過程中的調控機制奠定理論基礎。