謝 飛 于 洋 周海龍① 李富花

(1.海南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 海南海口 570228; 2.中國(guó)科學(xué)院海洋研究所實(shí)驗(yàn)海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 山東青島 266071)

凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)是我國(guó)重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)動(dòng)物, 是對(duì)蝦養(yǎng)殖的主導(dǎo)品種(Luet al, 2017; Boydet al, 2021)。然而, 對(duì)蝦產(chǎn)業(yè)的發(fā)展飽受病害問題困擾。近年, 急性肝胰腺壞死病(Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease, AHPND)給對(duì)蝦產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重?fù)p失(Wanget al, 2015), 該病致病力強(qiáng)、傳播速度快、死亡率高, 以肝胰腺萎縮變白為主要特征, 患病對(duì)蝦空腸, 空胃, 之后逐漸死亡(Joshiet al,2014)。該病最初于2009 年首次發(fā)現(xiàn), 隨后在全球主要對(duì)蝦養(yǎng)殖國(guó)家爆發(fā), 據(jù)估計(jì)因AHPND 造成的對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)損失已達(dá)10 億美元(Lunet al, 2018)。有關(guān)AHPND 的致病源的研究, Lightner 等(2012)首先報(bào)道該病的病原是副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus),隨后研究證實(shí)含有PirA、PirB毒素質(zhì)粒的副溶血弧菌是AHPND 的病因(Leeet al, 2015)。雖然AHPND可以通過(guò)益生菌、蛭弧菌等控制弧菌的方式進(jìn)行防控(De Schryveret al, 2014; Gomez-Gilet al, 2014), 但是由于病原菌在養(yǎng)殖水體中已經(jīng)廣泛存在, 生物防控難度較大。

培育抗病對(duì)蝦良種是防控AHPND 暴發(fā)的根本方法, 然而抗病性狀由于存在測(cè)定困難、遺傳力低等問題, 采用傳統(tǒng)育種技術(shù)進(jìn)行抗病育種難度較大。應(yīng)用精準(zhǔn)、高效的分子育種技術(shù)能夠顯著加快抗AHPND遺傳選育, 而篩選抗病基因是開展分子育種的基礎(chǔ)。在水產(chǎn)動(dòng)物中, 隨著水產(chǎn)動(dòng)物基因組的相繼破譯, 多個(gè)抗病相關(guān)基因被發(fā)掘, 推動(dòng)了水產(chǎn)動(dòng)物抗病分子育種研究。在大西洋鮭(Salmo salar)中, 研究鑒定了抗IPN (Infectious pancreatic necrosis)相關(guān)QTL 和基因, 并篩選了兩個(gè)與抗IPN 性狀顯著相關(guān)的SNP 標(biāo)記, 為抗病性狀的改良供了標(biāo)記來(lái)源(Houstonet al,2008, 2012)。此外, 在貝類中分別鑒定了文蛤(Meretrix meretrix)抗副溶血弧菌和櫛孔扇貝(Chlamys farreri)抗鰻利斯頓氏菌(Listonella anguillarum)相關(guān)分子標(biāo)記(Liet al, 2009; Nieet al, 2015, 2016)。前期在凡納濱對(duì)蝦研究中, 通過(guò)關(guān)聯(lián)分析技術(shù), 鑒定了多個(gè)抗AHPND 相關(guān)SNP 標(biāo)記, 并鑒定到LvALF6、LvPI3K等抗弧菌候選基因(Zhanget al, 2019; 李碧瀚等,2021)。上述抗病分子標(biāo)記和抗病基因的研究推動(dòng)了水產(chǎn)動(dòng)物抗病分子育種工作的開展。

除通過(guò)關(guān)聯(lián)分析鑒定抗病標(biāo)記和基因, 轉(zhuǎn)錄組比較分析也是篩選抗病基因的重要方法。前期抗AHPND 家系和敏感家系的比較轉(zhuǎn)錄組分析鑒定了多個(gè)抗弧菌相關(guān)基因(Zhanget al, 2021), 其中一種低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白 1 (Litopenaeus vannameiprolow-density lipoprotein receptor-related protein 1-like,LvLRP1)基因在凡納濱對(duì)蝦抗性和敏感家系之間存在顯著差異, 提示其可能在對(duì)蝦抗弧菌中發(fā)揮重要作用。LRP1 隸屬于低密度脂蛋白受體(LDLR)家族, 家族成員基本都是跨膜蛋白, 包括胞外區(qū)域和胞內(nèi)區(qū)域。前期研究顯示LRP1 在內(nèi)吞和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用, 同時(shí)該基因也是炎癥反應(yīng)的一個(gè)重要調(diào)節(jié)器, 可以影響細(xì)胞因子的分泌、吞噬作用和免疫系統(tǒng)細(xì)胞的遷移等(May, 2013)。在櫛孔扇貝中, 低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白可以作為識(shí)別和清除病原體的受體, 這為該基因在無(wú)脊椎動(dòng)物免疫中的功能提供了新的線索(Liuet al, 2014)。鑒于前期報(bào)道的低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白在炎癥反應(yīng)和免疫識(shí)別中的作用, 結(jié)合抗性和敏感家系轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù), 本研究對(duì)前期篩選的凡納濱對(duì)蝦低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1進(jìn)行功能研究, 初步解析了其在抗弧菌感染中的功能, 為對(duì)蝦抗弧菌性狀的遺傳解析提供了新的線索。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本實(shí)驗(yàn)所用凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)購(gòu)自日照星光海洋牧場(chǎng)漁業(yè)有限公司(山東日照), 用于弧菌感染實(shí)驗(yàn)的對(duì)蝦平均體重2.33 g, 用于組織表達(dá)的對(duì)蝦平均體重10.66 g。在進(jìn)行弧菌感染和組織表達(dá)取樣前, 所有實(shí)驗(yàn)材料均在26 °C的海水中暫養(yǎng)48 h。組織表達(dá)分析分別取表皮、腸道、腹神經(jīng)、肝胰臟、肌肉、腦、淋巴、鰓、胃、心臟、血、眼柄共12個(gè)組織, 所有組織經(jīng)液氮速凍后置于–80 °C冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 總RNA 提取和cDNA 合成

1.2.1 總RNA提取 在液氮中研磨不同組織, 組織粉末使用RNAiso Plus (TaKaRa, 日本)試劑提取總RNA, 具體操作參照說(shuō)明書。使用1.5%瓊脂糖檢測(cè)總RNA的完整性, 使用Nanodrop1000檢測(cè)總RNA濃度。

1.2.2 cDNA合成 使用PrimeScript RT Reagent Kit (TaKaRa, 日本)合成cDNA, 具體方法參照說(shuō)明書。首先用gDNA Eraser Buffer在42 °C下除去基因組DNA, 然后用PrimeScript RT Enzyme Mix在37 °C下合成cDNA。PCR反應(yīng)條件為: 37 °C, 60 min; 85 °C, 5 s;4 °C, 5 min。反應(yīng)結(jié)束后凍存在–20 °C冰箱。

1.3 凡納濱對(duì)蝦低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1 的序列分析

前期在抗副溶血弧菌家系和敏感家系的比較轉(zhuǎn)錄組中篩選到一個(gè)差異基因, 注釋為低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1 (Litopenaeus vannameiprolow-density lipoprotein receptor-related protein 1-like,LvLRP1)(Zhanget al, 2021)。經(jīng)與轉(zhuǎn)錄組比對(duì)發(fā)現(xiàn)該基因存在兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本, 分別命名為L(zhǎng)vLRP1-1和LvLRP1-2。設(shè)計(jì)引物L(fēng)vLRP1-F 和LvLRP1-R 同時(shí)擴(kuò)增兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本(表1), 使用頭胸部組織cDNA 作為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增, 電泳顯示擴(kuò)增出兩條帶。將兩條帶分別膠回收后進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化, 之后挑取單克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行一代測(cè)序, 測(cè)序結(jié)果顯示兩條帶分別與LvLRP1-1和LvLRP1-2序列相同, 證實(shí)兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本均表達(dá)且序列準(zhǔn)確。

表1 核苷酸引物序列Tab.1 Oligonucleotide primer sequences

使用ORFfinder 預(yù)測(cè)LvLRP1-1和LvLRP1-2的CDS 區(qū)域, 使用 SignaIP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/)進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè), 使用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)和Interproscan (https://www.ebi.ac.uk/interpro/about/ interproscan/)進(jìn)行基因的功能域預(yù)測(cè)。

1.4 組織表達(dá)分析

使用熒光定量PCR 檢測(cè)LvLRP1-1和LvLRP1-2在不同組織中的表達(dá)水平。用于組織表達(dá)的引物如表1 所示, 通過(guò)將引物設(shè)計(jì)在LvLRP1-1和LvLRP1-2的差異區(qū)域?qū)崿F(xiàn)表達(dá)量的分別檢測(cè), 使用18S 作為內(nèi)參基因, 分別擴(kuò)增目的基因和內(nèi)參基因。qRT-PCR 退火溫度設(shè)置為55 °C, 目的基因相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算使用2–ΔΔCt法(Goniet al, 2009)。

1.5 弧菌感染過(guò)程中的基因表達(dá)變化

通過(guò)浸泡方式進(jìn)行對(duì)蝦的副溶血弧菌感染實(shí)驗(yàn),將凍存于–80 °C 的菌液接種至含有2% NaCl 的TSB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行活化, 之后轉(zhuǎn)接到新的培養(yǎng)基中過(guò)夜擴(kuò)培, 培養(yǎng)溫度為30 °C, 搖床轉(zhuǎn)速為220 r/min。在副溶血弧菌生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期后, 使用顯微鏡和血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)菌定量, 并通過(guò)PCR 擴(kuò)增檢測(cè)PirA、PirB質(zhì)粒的存在(Hanet al, 2015), PCR 擴(kuò)增引物如表1 所示, 通過(guò)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)確定出半數(shù)致死濃度為5×106CFU/mL。

利用培養(yǎng)的帶有PirA、PirB質(zhì)粒的副溶血弧菌進(jìn)行浸泡感染實(shí)驗(yàn), 實(shí)驗(yàn)水體中副溶血弧菌濃度為5×106CFU/mL, 根據(jù)兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本的組織表達(dá)情況,取表皮作為分析的靶組織。分別在浸泡感染前(0 h),浸泡感染后3、6、12 h 取對(duì)蝦表皮組織, 3 尾蝦混合作為1 個(gè)樣品, 每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。提取表皮組織RNA 并合成cDNA, 使用qPCR 檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)表皮組織中LvLRP1-1和LvLRP1-2的表達(dá)變化, qPCR程序和相對(duì)表達(dá)量計(jì)算方法與1.4 一致。

1.6 dsRNA 合成與最佳干擾劑量的確定

由于LvLRP1-1和LvLRP1-2的序列相似性高, 其差異部分無(wú)法單獨(dú)設(shè)計(jì)dsRNA, 因此使用其共同部分設(shè)計(jì)dsRNA 進(jìn)行RNA 干擾實(shí)驗(yàn)。使用Primer3 設(shè)計(jì)dsRNA 引物, 并在引物序列前添加T7 啟動(dòng)子序列,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成, 同時(shí)合成EGFP 基因的dsRNA 作為對(duì)照, 引物如表1 所示。使用TranscriptAid T7 高產(chǎn)率轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Thermo Fisher Science)合成目的基因和 EGFP 的dsRNA。

為確定最佳干擾劑量, 分別使用1 μg/尾、2 μg/尾和4 μg/尾劑量進(jìn)行干擾預(yù)實(shí)驗(yàn), 同時(shí)注射同等劑量的dsEGFP 和PBS 作為對(duì)照, 注射后48 h 取表皮組織進(jìn)行RNA 提取和LvLRP1-1和LvLRP1-2的定量檢測(cè), 分析不同劑量的干擾效率, 確定最佳干擾劑量。

1.7 RNA 干擾與細(xì)菌感染

使用預(yù)實(shí)驗(yàn)獲得的最佳干擾劑量同時(shí)敲降LvLRP1-1和LvLRP1-2, 并在基因干擾后進(jìn)行弧菌感染。分別設(shè)置PBS 未感染組、PBS 組、dsEGFP 組和dsLRP1 組, 每組三個(gè)平行, 每個(gè)平行30 尾蝦。PBS組每尾蝦注射10 μL 1×PBS, dsEGFP 組每尾蝦注射10 μL 的dsEGFP (2 μg dsEGFP), dsLRP1 組每尾蝦注射10 μL 的目的基因雙鏈RNA (2 μg dsLRP1)。

注射雙鏈后 48 h, 對(duì) PBS 組、dsEGFP 組和dsLRP1 組的樣品通過(guò)浸泡方式進(jìn)行弧菌感染, 水體中弧菌濃度設(shè)置為5×106CFU/mL, PBS 未感染組不進(jìn)行弧菌感染。感染后 3 h 分別從 dsEGFP 組和dsLRP1 組隨機(jī)挑選9 尾個(gè)體, 取表皮組織, 3 尾個(gè)體混合作為一個(gè)樣品, 提取樣品的RNA 并通過(guò)qPCR檢測(cè)弧菌PirA基因的相對(duì)表達(dá)量, qPCR 擴(kuò)增引物如表1 所示。同時(shí)記錄感染各個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)蝦的死亡率,繪制死亡率曲線。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 軟件對(duì)獲得的基因表達(dá)數(shù)據(jù)和不同組的死亡率數(shù)據(jù)進(jìn)行T 檢驗(yàn), 計(jì)算對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組間的顯著性差異,P<0.05 表示顯著性差異(用*標(biāo)記),P<0.01 表示極顯著性差異(用**標(biāo)記)。

2 結(jié)果與分析

2.1 LvLRP1-1 和LvLRP1-2 的cDNA 序列分析

LvLRP1-1和LvLRP1-2兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本的cDNA 序列高度一致, 唯一的差別在于LvLRP1-1的cDNA 比LvLRP1-2多129 bp, 多編碼43 個(gè)氨基酸(圖1)。LvLRP1-1的cDNA序列全長(zhǎng)916 bp, 開放閱讀框681 bp,編碼226 個(gè)氨基酸, 蛋白質(zhì)分子量為24 334.69 Da, 等電點(diǎn)pI 為5.45。LvLRP1-2的cDNA 序列全長(zhǎng)787 bp,開放閱讀框552 bp, 編碼183 個(gè)氨基酸, 預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)分子量為19 646.52 Da, 等電點(diǎn)pI 為6.55。兩者僅ORF 區(qū)存在差異,LvLRP1-1比LvLRP1-2多編碼43個(gè)氨基酸(圖1), 結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)顯示LvLRP1-1和LvLRP1-2都含有信號(hào)肽和低密度脂蛋白受體結(jié)構(gòu)域,且均含有兩個(gè)內(nèi)部重復(fù)片段(RPT 1)結(jié)構(gòu)域(圖2)。

圖1 凡納濱對(duì)蝦低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1 基因兩種轉(zhuǎn)錄本的核苷酸和氨基酸序列Fig.1 The nucleotide and amino acid sequences of two low-density lipoprotein receptor-related protein 1 gene in L. vannamei

圖2 凡納濱對(duì)蝦低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1 基因兩種轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)Fig.2 Prediction of low density lipoprotein receptor-related protein 1 domains in L. vannamei

2.2 組織表達(dá)分布

通過(guò)熒光定量PCR 檢測(cè)LvLRP1-1和LvLRP1-2在不同組織中的表達(dá)量, 結(jié)果顯示LvLRP1-1在表皮、眼柄、腦和心臟中高表達(dá),LvLRP1-2僅在表皮和眼柄中高表達(dá)。表皮和眼柄是LvLRP1-1和LvLRP1-2共同高表達(dá)的組織(圖3)。

圖3 LvLRP1-1 和LvLRP1-2 的組織表達(dá)分布Fig.3 Tissue expression distribution of LvLRP1-1 and LvLRP1-2

2.3 副溶血弧菌感染后的基因表達(dá)變化

在副溶血弧菌感染對(duì)蝦后,LvLRP1-1和LvLRP1-2的轉(zhuǎn)錄表達(dá)變化趨勢(shì)一致, 均在感染后3 h 其轉(zhuǎn)錄水平明顯升高, 上調(diào)倍數(shù)均在10 倍以上, 在感染后6 h之后, 其轉(zhuǎn)錄表達(dá)又恢復(fù)到正常水平(圖4)。

圖4 副溶血弧菌感染后表皮組織LvLRP1-1 和LvLRP1-2 表達(dá)變化Fig.4 Changes of the LvLRP1-1 and LvLRP1-2 expression in epidermal tissue after V. parahaemolyticus infection

2.4 最佳干擾劑量的確定

在注射1、2 和4 μg 雙鏈后LvLRP1-1和LvLRP1-2的表達(dá)變化如圖5 所示, 在2 和4 μg 時(shí)兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本的干擾效率均達(dá)98% (圖5), 為了兼顧干擾效率和經(jīng)濟(jì)性, 最終確定以2 μg/尾的干擾劑量進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。

圖5 注射不同劑量dsRNA 后LvLRP1-1 和LvLRP1-2 的相對(duì)表達(dá)量Fig.5 Relative expression of LvLRP1-1 and LvLRP1-2 after injection with different doses of dsRNA

2.5 基因干擾對(duì)機(jī)體抗副溶血弧菌能力的影響

在LvLRP1-1和LvLRP1-2被敲降后進(jìn)行副溶血弧菌感染, 感染后3 h 后檢測(cè)表皮中PirA的相對(duì)表達(dá)量來(lái)代表弧菌感染和增殖速度, 結(jié)果顯示目的基因被干擾后表皮中PirA基因的相對(duì)表達(dá)量顯著升高(圖6)。同時(shí), 在基因干擾后, 對(duì)蝦的死亡速度顯著加快。在感染后6 h 干擾組死亡率為對(duì)照組的3 倍, 在感染后12 h 干擾組死亡率已達(dá)75%, 而對(duì)照組的死亡率僅為35%。在感染后24 h, 感染組死亡率達(dá)90%, 對(duì)照組死亡率為50%。感染后36 h和48 h, 干擾組死亡率為100%,對(duì)照組逐漸趨近平穩(wěn), 最終死亡率為60% (圖7)。

圖6 LvLRP1-1 和LvLRP1-2 同時(shí)干擾組和對(duì)照組在副溶血弧菌感染3 h 后表皮組織PirA 基因的相對(duì)含量Fig.6 Relative content of PirA gene in epidermal tissue of LvLRP1-1 and LvLRP1-2 gene interference group and control group after 3 h of V. parahaemolyticus infection

圖7 LvLRP1-1 和LvLRP1-2 基因同時(shí)干擾后凡納濱對(duì)蝦弧菌感染后死亡率Fig.7 Mortality following Vibrio infection in L. vannamei after interference of LvLRP1-1 and LvLRP1-2 gene

3 討論

抗弧菌相關(guān)基因的篩選是開展對(duì)蝦抗病分子育種的基礎(chǔ)。本研究針對(duì)前期篩選的抗弧菌相關(guān)基因LvLRP1的兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行了基因序列、組織表達(dá)和功能研究, 證實(shí)了凡納濱對(duì)蝦低密度脂蛋白受體1 基因在對(duì)蝦抵抗弧菌感染的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。

低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(LRP)是低密度脂蛋白受體家族的一員, 是一種細(xì)胞表面蛋白(Audersetet al, 2020)。本研究中發(fā)現(xiàn)的LvLRP1-1和LvLRP1-2結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)是位于胞外區(qū)的膜結(jié)合蛋白, 符合低密度脂蛋白受體的結(jié)構(gòu)特征, 推測(cè)可能發(fā)揮細(xì)胞表面受體的作用。前期研究表明, LRP1 可能是以模式識(shí)別受體形式發(fā)揮免疫作用, 在扇貝中的研究顯示低密度脂蛋白受體可以作為識(shí)別和清除病原的受體, 并證實(shí)其對(duì)弧菌有較強(qiáng)的抑菌活性(Liuet al, 2014)。除了作為模式識(shí)別受體, LRP1 也是重要的免疫和炎癥調(diào)節(jié)因子。在凡納濱對(duì)蝦中鑒定了一種含有低密度脂蛋白受體結(jié)構(gòu)域的凝集素, 免疫刺激后該基因表達(dá)上調(diào), 沉默該基因顯著提高了對(duì)蝦在感染副溶血弧菌后的死亡率, 且鰓中細(xì)菌載量顯著升高, 推測(cè)該基因具有細(xì)菌凝集活性, 并能增強(qiáng)血細(xì)胞的吞噬作用, 進(jìn)一步研究顯示該基因低密度脂蛋白受體結(jié)構(gòu)域的缺失突變體對(duì)血細(xì)胞的吞噬能力降低, 說(shuō)明低密度脂蛋白結(jié)構(gòu)域與該基因的免疫活性有關(guān)(Lianget al,2019)。在日本沼蝦(Macrobrachium nipponense)的研究中, 氨氮脅迫后LRP1基因顯著上調(diào), 提示LRP1基因可能作為重要的免疫及炎癥反應(yīng)因子, 在日本沼蝦抗氨氮脅迫中發(fā)揮作用(Sunet al, 2020)。

本研究鑒定的LvLRP1-1和LvLRP1-2序列高度相似, 眼柄和表皮是兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本共同高表達(dá)的組織。表皮是機(jī)體免疫的第一道防線, 在浸泡感染中, 表皮組織首先接觸弧菌, 并啟動(dòng)弧菌的識(shí)別和免疫防御機(jī)制。LvLRP1-1和LvLRP1-2均在弧菌感染后快速上調(diào)表達(dá), 而在6 h 后降至正常水平, 說(shuō)明該基因在弧菌的早期識(shí)別中發(fā)揮作用。值得說(shuō)明的是, 該基因除了含有低密度脂蛋白受體的結(jié)構(gòu)域外, Interproscan 的預(yù)測(cè)結(jié)果顯示兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本編碼的109～147 氨基酸與WAP 結(jié)構(gòu)域具有相似性, WAP 結(jié)構(gòu)域是對(duì)蝦抗菌肽的主要功能域, 其發(fā)揮重要的抗菌作用(Lvet al,2020), 因此LvLRP1在表皮中可能發(fā)揮識(shí)別和抑菌的雙重作用。同時(shí), 該基因在眼柄、心臟和腦中的高表達(dá)可能與發(fā)揮膽固醇或脂蛋白受體的作用有關(guān), 進(jìn)一步證實(shí)其功能的多樣性。

LvLRP1-1和LvLRP1-2序列相似性高, 難以設(shè)計(jì)雙鏈分別敲降, 鑒于兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本在弧菌感染過(guò)程中的表達(dá)變化一致, 我們推測(cè)其在抵抗弧菌感染中的功能相似, 所以本研究采取了對(duì)LvLRP1-1和LvLRP1-2同時(shí)干擾的方案, 以研究LvLRP1在抗弧菌感染過(guò)程中的功能。結(jié)果顯示, 注射LvLRP1的dsRNA 可以顯著降低LvLRP1-1和LvLRP1-2的表達(dá)量。弧菌感染實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,LvLRP1基因被沉默后, 對(duì)蝦死亡率顯著上升, 一種原因是該基因的沉默影響了機(jī)體對(duì)弧菌的識(shí)別, 進(jìn)而影響了機(jī)體免疫防御的啟動(dòng), 另外一種原因是該基因的敲降影響了該基因其對(duì)表皮組織中弧菌的清除, 從而使弧菌快速通過(guò)表皮進(jìn)入體內(nèi),該基因的沉默導(dǎo)致其無(wú)法發(fā)揮免疫效應(yīng)分子作用, 機(jī)體清除弧菌能力減弱, 從而使弧菌快速通過(guò)表皮進(jìn)入體內(nèi), 使得死亡率升高。研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了LvLRP1-1和LvLRP1-2在對(duì)蝦抗弧菌中發(fā)揮重要作用。

4 結(jié)論

本研究詳細(xì)分析了LvLRP1-1和LvLRP1-2兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本的序列、結(jié)構(gòu)域、組織表達(dá)分布和在對(duì)蝦抗弧菌感染中的功能, 證實(shí)LvLRP1基因在弧菌感染過(guò)程中發(fā)揮重要的免疫和抗病作用, 為對(duì)蝦抗弧菌性狀的遺傳解析提供了新的線索, 也為對(duì)蝦抗弧菌性狀的遺傳育種提供了理論指導(dǎo)。