胡晨馨 呂麗媛 孫改改,3 姚韓韓 林志華,① 董迎輝①

(1.浙江萬里學(xué)院生物與環(huán)境學(xué)院 浙江省水產(chǎn)種質(zhì)資源高效利用技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 浙江寧波 315100; 2.浙江萬里學(xué)院寧海海洋生物種業(yè)研究院 浙江寧波 315604; 3.寧波大學(xué)海洋學(xué)院 浙江寧波 315832)

氨氮是水環(huán)境中常見的非生物脅迫因子之一,當(dāng)水生動(dòng)物體內(nèi)氨氮積累到一定程度時(shí)會(huì)導(dǎo)致組織受損和退化、離子調(diào)節(jié)失衡、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、生長(zhǎng)減緩和高死亡率(Renet al, 2014; Chenget al,2015; Zhanget al, 2018)。水環(huán)境中的氨氮主要有離子態(tài)氨(N)和非離子態(tài)氨(NH3)兩種形式, 二者可以相互轉(zhuǎn)化, 并處于動(dòng)態(tài)平衡, 機(jī)體內(nèi)的氨氮大多以N的形式存在(付瑩等, 2018)。由于NH+4脂溶性極低且可與水結(jié)合形成水合離子, 不易透過細(xì)胞膜, 因此水生動(dòng)物機(jī)體內(nèi)的大多數(shù)氨氮的跨膜運(yùn)輸是通過各種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白來實(shí)現(xiàn)的(Weineret al, 2019)。細(xì)胞外的氨氮主要通過銨轉(zhuǎn)運(yùn)體(AMT)和Rhesus (Rh)糖蛋白促進(jìn)擴(kuò)散, 也可由 K+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白如 Na+/K+-ATP 酶(NKA)、Na+-K+-2Cl 共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(NKCC)和K+通道蛋白(KCN)等進(jìn)行跨膜運(yùn)輸(Tresguerreset al, 2020)。有研究表明, 鈉氫交換蛋白(NHE)、囊泡相關(guān)蛋白(VAMP)以及水通道蛋白(AQP)家族的某些成員也可能參與氨的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)(Walker, 2014)?？傊? 水生動(dòng)物具有非常復(fù)雜的氨氮運(yùn)輸調(diào)控網(wǎng)絡(luò), 而NKA 是參與氨排泄的重要通道之一。

NKA 是一種重要的陽(yáng)離子泵蛋白, 由α 亞基、β亞基及調(diào)節(jié)亞基組成, 其中α 亞基包含陽(yáng)離子、核苷酸以及配體結(jié)合位點(diǎn)(Caoet al, 2021)。NKA 可以在ATP 和Mg2+的催化下轉(zhuǎn)運(yùn)Na+和K+, 從而控制細(xì)胞質(zhì)膜上的Na+、K+濃度梯度, 維持細(xì)胞內(nèi)外液的滲透壓(?echováet al, 2016)。此外, 由于NH4+在水溶液中具有與K+幾乎相同的物理特性, 因此NH4+可以取代K+通過NKA 進(jìn)行跨膜運(yùn)輸(Tresguerreset al, 2020)。目前, 在印度囊鰓鲇(Heteropneustes fossilis) (Chewet al, 2020)、龜殼攀鱸(Anabas testudineus) (Ipet al,2012)、首長(zhǎng)黃道蟹(Metacarcinus magister) (Martinet al, 2011)、岸蟹(Carcinus maenas) (Fehsenfeldet al,2016)、克氏原螯蝦(Procambarus clarkii) (Shenet al,2021)、鱗硨磲(Tridacna squamosa) (Ipet al, 2015)和秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans) (Adlimoghaddamet al, 2015)等多種動(dòng)物中已證明NKA 參與氨氮的排泄過程。

近年來, 隨著貝類基因組信息的豐富、高通量單核苷酸多態(tài)性(SNP)芯片的開發(fā)以及基因分型技術(shù)的快速發(fā)展, 全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome-wide association study, GWAS)已廣泛應(yīng)用于貝類生長(zhǎng)、抗逆和品質(zhì)等重要經(jīng)濟(jì)性狀的遺傳位點(diǎn)鑒定。例如, 利用GWAS 技術(shù), 在蝦夷扇貝(Patinopecten yessoensis)中篩選出了2 個(gè)與生長(zhǎng)顯著關(guān)聯(lián)的SNP 位點(diǎn)(Ninget al, 2019), 在皺紋盤鮑(Haliotis discus hannai)中發(fā)掘了27 個(gè)與耐高溫性狀相關(guān)的遺傳標(biāo)記(Menget al,2020), 在長(zhǎng)牡蠣(Crassostrea gigas)中定位了一批與脂肪酸、糖原、鋅等營(yíng)養(yǎng)性狀相關(guān)的SNP(Shiet al,2020)。在耐氨氮關(guān)聯(lián)SNP 研究方面, Xu 等(2019)已用GWAS 分析在斜帶石斑魚(Epinephelus coioides)中鑒定出25 個(gè)與耐氨氮性狀相關(guān)的SNP 及7 個(gè)候選基因; Lv 等(2023)利用GWAS 分析在縊蟶(Sinonovacula constricta)中鑒定出11 個(gè)與耐氨氮性狀顯著相關(guān)的SNP 位點(diǎn), 并進(jìn)一步發(fā)掘了5 個(gè)關(guān)聯(lián)候選基因, 包括NKA、β-半乳糖苷酶(GLB1)、四肽重復(fù)蛋白 28(TTC28)、微管蛋白β (TUBB)和真核翻譯延伸因子1a(eEF1A)。GWAS 關(guān)聯(lián)的SNP 位點(diǎn)和候選基因作為重要的遺傳標(biāo)記, 對(duì)進(jìn)一步研究氨氮耐受的分子調(diào)控機(jī)制和基因組選擇育種具有重要意義。

縊蟶是我國(guó)重要的海水養(yǎng)殖貝類, 是蝦(蟹)-貝混養(yǎng)模式的主要養(yǎng)殖種類, 該養(yǎng)殖系統(tǒng)中的大量殘餌、糞便等有機(jī)廢物會(huì)增加底泥中的氨氮含量, 而縊蟶是一種典型的底棲穴居雙殼貝類, 其面臨的氨氮環(huán)境尤為嚴(yán)峻(Conget al, 2021; 柴欣如等, 2022)。已有大量研究表明, 縊蟶機(jī)體對(duì)于過量的氨存在特定的解毒方式和代謝途徑(陳凱鋒等, 2020; 張歡等,2020; Sunet al, 2021; Lvet al, 2022)。本研究對(duì)課題組前期通過全基因組關(guān)聯(lián)分析獲得的與氨氮耐受性狀顯著關(guān)聯(lián)的SNP 位點(diǎn)(g.21062868T>A)進(jìn)行了驗(yàn)證,并開展了位點(diǎn)關(guān)聯(lián)基因NKA的時(shí)間表達(dá)譜和蛋白組織定位分析, 探究氨氮脅迫下NKA基因在縊蟶鰓中的表達(dá)特征, 同時(shí)通過檢測(cè)NKA基因干擾后NKCC1基因的mRNA 表達(dá)量及血淋巴氨濃度, 探討NKA 在縊蟶氨氮排泄中發(fā)揮的作用, 為深入研究NKA 在貝類氨氮解毒過程中的功能及調(diào)控機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

從寧波市海洋與漁業(yè)科技創(chuàng)新基地采集健康的1齡縊蟶[濕重(15.38±1.84) g, 殼長(zhǎng)(59.36±2.52) mm],實(shí)驗(yàn)前暫養(yǎng)7 d, 海水鹽度為20±1, pH 值為8.1±0.1,溫度為(19.4±0.4) °C。每12 h 更換1/2 海水, 每天08:00 和18:00 投喂小球藻(Chlorella vulgaris)。

1.2 氨氮脅迫實(shí)驗(yàn)

在進(jìn)行氨氮脅迫實(shí)驗(yàn)前, 先隨機(jī)取6 顆縊蟶的鰓、肝胰腺、腸、足、外套膜、水管和閉殼肌, 液氮速凍后保存于–80 °C 超低溫冰箱中, 用于組織表達(dá)分析。參考Zhang 等(2020)縊蟶氨氮急性脅迫96 h 的半致死濃度(LC50-96 h), 以氨氮濃度180 mg/L 作為實(shí)驗(yàn)組, 并設(shè)置對(duì)照組(正常海水)。每組120 顆縊蟶, 設(shè)置三個(gè)平行, 即每個(gè)平行40 顆。分別在實(shí)驗(yàn)開始后0、3、6、12、24、48、72 和96 h 隨機(jī)采集6 顆縊蟶, 取其鰓, 液氮速凍完全后, 保存于–80 °C 超低溫冰箱中,用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qRT-PCR)和蛋白免疫印跡(western blotting, WB)檢測(cè)。在脅迫96 h 時(shí), 分別從兩組中取6 顆縊蟶, 剪取鰓組織進(jìn)行常規(guī)石蠟切片和NKA 蛋白組織定位研究。

1.3 耐氨氮性狀關(guān)聯(lián)SNP 位點(diǎn)的驗(yàn)證

選取180 mg/L 作為縊蟶氨氮脅迫實(shí)驗(yàn)的濃度,每2 h 對(duì)死亡個(gè)體進(jìn)行采樣, 實(shí)驗(yàn)共持續(xù)180 h, 取150 顆最早死亡的個(gè)體(氨氮敏感組, SG, 18～96 h)和死亡率到達(dá)約80%時(shí)剩余的150 顆存活個(gè)體(氨氮耐受組, TG, 180 h)的足經(jīng)液氮速凍后儲(chǔ)存在-80 °C 超低溫冰箱中。使用海洋動(dòng)物組織基因組DNA 提取試劑盒(TIANGEN, 北京)提取總DNA, 通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 的完整性, 并使用Nano Drop2000分光光度計(jì)(Thermo Fisher Scientific, 美國(guó))檢測(cè)DNA 濃度。

利用競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性PCR (KASP)分析技術(shù)進(jìn)行基因分型。使用PolyMarker 設(shè)計(jì)SNP 位點(diǎn)(g.21062868T>A) 的 KASP 引 物 (http://www.polymarker.info/)并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。使用384 孔板進(jìn)行KASP 測(cè)定, 反應(yīng)體系為10 μL, 包括5 μL FLu-Arms 2×PCR 混合物、0.5 μL KASP 引物混合物、1 μL 基因組DNA (濃度為20 ng/μL)和3.5 μL 去離子水。PCR 程序在LightCycler?480II PCR 儀(Roche, 瑞士)中進(jìn)行, 每次運(yùn)行均包括非模板對(duì)照(NTC)。反應(yīng)程序?yàn)? 94 °C, 15 min; 94 °C,20 s, 61 °C, 1 min, 共10 個(gè)循環(huán); 94 °C, 20 s, 55 °C,1 min, 共26 個(gè)循環(huán)。PCR 擴(kuò)增后使用Intellics 軟件(LGC Douglas Scientific, 美國(guó))讀取每個(gè)樣本的基因型。

表1 本實(shí)驗(yàn)所用引物及其序列Tab.1 Primers and their sequences used in this study

1.4 qRT-PCR 分析

使用Trizol 法提取總RNA, 1%瓊脂糖電泳檢測(cè)其完整性, 使用Nano Drop2000 分光光度計(jì)(Thermo Fisher Scientific, 美國(guó))檢測(cè) RNA 濃度。使用PrimeScript?RT reagent kit with gDNA eraser (TaKaRa,日本)合成cDNA。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室縊蟶基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中的NKA(GenBank 登錄號(hào): MN052993.1)、NKCC1(GenBank 登錄號(hào): OQ244851)以及 18S ribosomal RNA (18S) (GenBank 登錄號(hào): AY695800.2)基因序列(Donget al, 2020), 通過Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)PCR 引物(表1), 并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。每對(duì)引物在進(jìn)行熒光定量前都通過普通PCR 驗(yàn)證。使用LightCycler?480II PCR 儀(Roche, 瑞士)進(jìn)行qRT-PCR 反應(yīng), 總體系為20 μL, 包括cDNA和ddH2O 共8 μL, 10 μmol/L 上下游引物各1 μL,2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix (Vazyme,南京) 10 μL。反應(yīng)程序?yàn)? 95 °C 預(yù)變性10 min, 95 °C 10 s, 60 °C 退火1 min, 循環(huán)40 次, 72 °C 延伸7 min,運(yùn)行結(jié)束后對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行溶解曲線分析, 確保只有單一的PCR 產(chǎn)物得到擴(kuò)增。選擇18S基因作為內(nèi)參基因(表1), 用2–ΔΔCt法計(jì)算縊蟶NKA 基因(Sc-NKA)的相對(duì)表達(dá)量(Sunet al, 2022)。

1.5 Sc-NKA 多克隆抗體制備及氨氮脅迫后Sc-NKA蛋白免疫印跡檢測(cè)

根據(jù)Sc-NKA基因序列設(shè)計(jì)引物(表1), 擴(kuò)增開放閱讀框(ORF)區(qū)域。將獲得的 PCR 產(chǎn)物連接到pET-32A(+)質(zhì)粒(TaKaRa, 日本), 構(gòu)建含有His-tag 的融合蛋白表達(dá)重組質(zhì)粒 pET-32A-Sc-NKA。將陰性pET-32A 質(zhì)粒和陽(yáng)性重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌(Escherichia coli) Rosetta (DE3)進(jìn)行原核蛋白表達(dá),挑選陽(yáng)性菌體接種至含抗生素的LB 液體培養(yǎng)基中,37 °C 振蕩培養(yǎng)過夜。使用1 mmol/L IPTG 在37 °C下誘導(dǎo)4 h, 收集誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體重懸并超聲, 利用Ni-NTA 樹脂對(duì)蛋白進(jìn)行純化。隨后將抗原與等體積的佐劑完全乳化后對(duì)新西蘭白兔進(jìn)行多點(diǎn)皮下注射。采集全血后進(jìn)行抗體純化和ELISA 測(cè)定效價(jià), 并將制備好的抗體保存于–20 °C 冰箱中。

利用RIPA 裂解液(碧云天, 上海)裂解縊蟶鰓組織, 通過總蛋白定量測(cè)定試劑盒(南京建成)測(cè)定各樣品的蛋白濃度, 并用裂解液稀釋到同樣濃度, 加入5×loading buffer 沸水煮沸10 min。配置合適濃度的凝膠(12%分離膠和 5%濃縮膠), 等量上樣后進(jìn)行SDS-PAGE 電泳, 將凝膠中含有的目標(biāo)蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上(60 mA, 3 h), 利用TBST 溶解的10%脫脂奶粉室溫下封閉1 h。然后分別利用兔抗Sc-NKA 多克隆抗體(HuaBio, 杭州, 1︰500 比例稀釋)和兔抗GAPDH 多克隆抗體(上海生工, 1︰3 000 比例稀釋)在4 °C 下孵育過夜, 再用HRP 標(biāo)記的驢抗兔IgG 在室溫下進(jìn)行二抗孵育(上海生工, 1︰2 000 比例稀釋)1 h。最后, 將增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光液(ECL)滴加至PVDF 膜上, 在凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad, 美國(guó))下觀察和拍攝圖像。以GAPDH 作為內(nèi)參蛋白, 利用ImageJ2 軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行灰度值計(jì)算(Sunet al, 2022)。

1.6 Sc-NKA 蛋白免疫熒光檢測(cè)

鰓樣品用 4%多聚甲醛固定, 然后在梯度乙醇(50%、70%、80%、90%、100%)中脫水, 置于二甲苯中透明, 石蠟包埋切片(厚度為4 μm)。將烤片后的組織切片用二甲苯脫蠟, 梯度乙醇復(fù)水, 置于0.01 mol/L 檸檬酸鈉溶液中進(jìn)行抗原修復(fù); 用5%牛血清白蛋白(BSA,生工生物工程, 上海)室溫封閉1 h, 甩干后滴加兔抗Sc-NKA 多克隆抗體(HuaBio, 杭州, 1︰400 比例稀釋)于4 °C 濕盒中孵育過夜; 滴加FITC 標(biāo)記的驢抗兔IgG二抗(1︰150 比例稀釋)室溫避光孵育1 h; 滴加DAPI染色液(碧云天, 上海)對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色, 在Eclipse 80i 熒光顯微鏡(Nikon, 日本)下觀察并拍攝鰓組織。

1.7 RNA 干擾實(shí)驗(yàn)

Sc-NKA和陰性對(duì)照(NC, 非特異性的siRNA 對(duì)照)的siRNA 序列由生工生物工程(上海)股份有限公司制備(表1, 利用無 RNase 水將干擾鏈配制成0.22 μg/μL。將240 顆縊蟶隨機(jī)分為氨氮脅迫組(AG,180 mg/L)和對(duì)照組(CG, 正常海水), 使用50 μL 微量進(jìn)樣器將siRNA-NKA干擾鏈、NC 鏈及無RNase 水(空白對(duì)照) 18.45 μL 分別注射到兩組40 顆縊蟶的閉殼肌中。在注射后0、6、12、24 和48 h 隨機(jī)收集各缸中6 顆縊蟶, 采集其鰓和血淋巴用于qRT-PCR 檢測(cè)和血氨濃度測(cè)定。

1.8 血氨濃度測(cè)定

依據(jù)血氨測(cè)定試劑盒(A086-1-1, 南京建成)說明書檢測(cè)樣品反應(yīng)后的吸光值。其原理主要是用蛋白質(zhì)沉淀劑將血清中的蛋白沉淀以抑制酶活性, 防止游離氨產(chǎn)生, 并去除大部分干擾呈色的物質(zhì)。通過Berthelot 反應(yīng)在630 nm 處測(cè)定吸光值, 與標(biāo)準(zhǔn)溶液比較計(jì)算血淋巴中的氨濃度。根據(jù)公式計(jì)算樣品中的血氨濃度:

1.9 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA),P<0.05 表示差異顯著,P<0.01 表示差異極顯著，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示。用卡方(χ2)檢驗(yàn)計(jì)算SNP 位點(diǎn)在SG 組和TG 組間基因型頻率的差異。使用GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果

2.1 耐氨氮性狀關(guān)聯(lián)SNP 位點(diǎn)的驗(yàn)證與分析

應(yīng)用KASP 分析方法在驗(yàn)證群體中對(duì)SNP 位點(diǎn)(g.21062868T>A)進(jìn)行基因分型, 并與縊蟶耐氨氮性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析, 分別在TG 組和SG 組中檢測(cè)到148和150 個(gè)熒光信號(hào)。分析結(jié)果表明, 該SNP 位點(diǎn)存在3 種基因型, 其中純合子TT 為優(yōu)勢(shì)基因型, 在TG 組有92 個(gè)個(gè)體, SG 組有74 個(gè)個(gè)體, 在兩組中的基因型頻率分別為62.16%和49.33%; 雜合子TA 在TG 組有18 個(gè)個(gè)體, SG 組有37 個(gè)個(gè)體, 在兩組中的基因型頻率分別為12.16%和24.67%; 純合子AA 在TG 組有38 個(gè)個(gè)體, SG 組有39 個(gè)個(gè)體, 在兩組中的基因型頻率分別為25.68%和26.00%。對(duì)TG 組和SG 組的基因型頻率進(jìn)行卡方檢驗(yàn)后發(fā)現(xiàn), 該SNP 位點(diǎn)在兩組間差異顯著(P<0.05) (表2)。

表2 TG 和SG 組SNP 基因型頻率的比較Tab.2 Comparison in genotype frequency of the SNP between the TG and SG groups

2.2 Sc-NKA 基因?qū)Π钡{迫的響應(yīng)

利用qRT-PCR 和WB 技術(shù)檢測(cè)了Sc-NKA基因在縊蟶不同組織中的表達(dá)量以及在氨氮脅迫下鰓中mRNA 和蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示,Sc-NKA基因在鰓、肝胰腺、腸、足、外套膜、水管和閉殼肌中均有表達(dá), 且在鰓組織中的表達(dá)量最高(P<0.05), 其次是腸和肝胰腺, 在外套膜、閉殼肌和足中的表達(dá)量最低(圖1a)。在180 mg/L 的高氨脅迫后, 鰓中Sc-NKA基因mRNA 表達(dá)水平在6～48 h 相比0 h 顯著升高(P<0.05), 總體呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì), 且在24 h達(dá)到最大值, 約為0 h 的2 倍(圖1b)。通過對(duì)Sc-NKA蛋白印跡灰度值分析發(fā)現(xiàn), WB 的結(jié)果與qRT-PCR 基本一致(圖1c)。

圖1 縊蟶Sc-NKA 基因的組織表達(dá)分析及在氨氮脅迫下鰓中mRNA 和蛋白的表達(dá)變化Fig.1 Expression of Sc-NKA in different tissues and the mRNA and protein expression in the gill of S. constricta under ammonia stress

2.3 Sc-NKA 蛋白的組織細(xì)胞定位

縊蟶的鰓絲由單層上皮細(xì)胞(柱狀細(xì)胞和扁平細(xì)胞)以及其圍繞的血腔組成。DAPI 染色顯示, 鰓組織纖毛處含有大量排列整齊的單層柱狀細(xì)胞, 而靠近鰓內(nèi)腔的約一半?yún)^(qū)域?yàn)楸馄郊?xì)胞。免疫熒光結(jié)果顯示,Sc-NKA 在鰓組織的柱狀細(xì)胞和扁平細(xì)胞中均有表達(dá)(FITC 綠色熒光信號(hào)), 且其在柱狀細(xì)胞中的熒光信號(hào)強(qiáng)于其他部位。同時(shí), 與CG 組相比, TG 組表現(xiàn)出更強(qiáng)烈的陽(yáng)性信號(hào)(圖2)。

圖2 縊蟶鰓組織Sc-NKA 蛋白的免疫熒光分析Fig.2 Immunofluorescence of Sc-NKA in the gill

2.4 Sc-NKA 基因RNA 干擾對(duì)NKCC1 基因表達(dá)和血氨含量的影響

利用RNAi 技術(shù)檢測(cè)了Sc-NKA基因表達(dá)受到抑制后對(duì)NKCC1基因表達(dá)和血氨含量的影響。qRT-PCR 結(jié)果表明, 注射siRNA-NKA干擾鏈6、12、24 和48 h 后, AG 組和CG 組Sc-NKA的mRNA 表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.05), 其中AG 組干擾效率分別為23%、84%、83%和80%, CG 組分別為33%、78%、85%和79% (圖3a, 3b)。對(duì)Sc-NKA基因的干擾影響了Sc-NKCC1的mRNA 表達(dá)水平。在12～48 h, AG 和CG 兩組中siRNA-NKA實(shí)驗(yàn)組的Sc-NKCC1表達(dá)量相較陰性和空白對(duì)照組均顯著降低(P<0.05), 其中AG組在12、24 和48 h 分別下降37%、99%和99%, CG組分別下降44%、80%和95%。同時(shí), 整個(gè)干擾實(shí)驗(yàn)期間siRNA-NKA實(shí)驗(yàn)組的Sc-NKCC1mRNA 表達(dá)水平總體呈現(xiàn)下降趨勢(shì), 與Sc-NKA的表達(dá)量變化趨勢(shì)一致(圖3c, 3d)。

圖3 RNAi 后鰓組織中Sc-NKA 和Sc-NKCC1 基因mRNA 相對(duì)表達(dá)量和血氨濃度的變化Fig.3 Relative expression of Sc-NKA and Sc-NKCC1 gene in the gill and ammonia concentration in the hemolymph after RNAi

使用血氨測(cè)定試劑盒測(cè)定Sc-NKA基因RNAi后縊蟶血淋巴中的氨濃度。結(jié)果表明, AG 組和CG組的siRNA-NKA實(shí)驗(yàn)組中血氨濃度在6～48 h 均顯著高于陰性和空白對(duì)照組(P<0.05), 其中 AG 組血氨濃度在48 h 達(dá)到最大值(5 163.16 μmol/L), 約為對(duì)照組的2.32 倍; CG 組血氨濃度在6 h 達(dá)到最大值(161.03 μmol/L), 約為對(duì)照組的1.23 倍(圖3e, 3f)。此外, 在實(shí)驗(yàn)期間, 陰性和空白對(duì)照組的上述指標(biāo)之間均沒有顯著差異(P>0.05) (圖3a～3f)。

3 討論

氨氮是水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中最常見的脅迫因子之一,氨氮水平的升高是水生動(dòng)物健康和生命的主要威脅(Zhaoet al, 1997; Harriset al, 2001)。氨氮濃度過高會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生多種危害, 因此需要將其轉(zhuǎn)化成毒性較小的分子或迅速排出, 以避免有害物質(zhì)在體內(nèi)積聚(Larsenet al, 2014)?？O蟶作為一種底棲濾食性貝類,經(jīng)常面臨高濃度的氨氮環(huán)境, 是研究氨氮解毒分子機(jī)制的重要模式物種(Penget al, 2016)。本課題組Lv等(2023)對(duì)縊蟶耐氨氮性狀進(jìn)行了GWAS 分析, 發(fā)現(xiàn)了一個(gè)位于NKA基因(Chr8: 21038162-21054270)下游8.6 kb 基因間區(qū)內(nèi)的顯著性SNP 位點(diǎn)(g.21062868T>A)(P<0.05), 本實(shí)驗(yàn)通過KASP 技術(shù)驗(yàn)證了其與縊蟶氨氮耐受性狀之間存在顯著關(guān)聯(lián)(P<0.05), 推測(cè)該SNP可能通過影響與其相鄰的NKA基因的表達(dá)參與氨氮脅迫下的調(diào)控過程。近年來, 許多研究表明, 基因間區(qū)包含非編碼RNA 如miRNA、rRNA、snRNA 和tRNA等尚未鑒定的重要功能元件(Hesset al, 2007; Zhonget al, 2014; Caiet al, 2016; Kanwalet al, 2019)?；蜷g區(qū)含有的增強(qiáng)子DNA 序列可以控制相距幾千個(gè)堿基對(duì)以上的離散基因的表達(dá)(Ingvarssonet al, 2016;Bakhtiarizadehet al, 2018)。這一發(fā)現(xiàn)也在水產(chǎn)動(dòng)物中得到廣泛驗(yàn)證, 如在對(duì)刺參(Apostichopus japonicus)疣足數(shù)量進(jìn)行GWAS 分析中, 篩選并驗(yàn)證了與PATS1基因相鄰的位于基因間區(qū)的顯著性SNP 位點(diǎn), 證明其在細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖中的重要作用(Zhuet al, 2022);在對(duì)長(zhǎng)牡蠣脂肪酸品質(zhì)性狀的GWAS 分析中, 選取了7個(gè)與不飽和脂肪酸含量顯著相關(guān)的SNP 位點(diǎn), 這些位點(diǎn)均位于基因間區(qū), 最后通過分析與這些SNP 相鄰的NFYA基因的mRNA 表達(dá)水平等方式證明該基因可能參與調(diào)控牡蠣飽和脂肪酸代謝(史瑞輝, 2020)。

研究表明, 絕大多數(shù)水生生物, 包括兩棲動(dòng)物、硬骨魚和大多數(shù)無脊椎動(dòng)物的大部分含氮廢物都是直接以NH4+的形式排出, 這是因?yàn)镹H3在水環(huán)境中很容易轉(zhuǎn)化為NH4+并通過離子轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)由鰓排泄到體外(Cragget al, 1961; Woodet al, 1989; Wright, 1995;Weihrauchet al, 2009; Wrightet al, 2009)。水生動(dòng)物的鰓是一個(gè)多功能器官, 是進(jìn)行多種生理過程的場(chǎng)所,包括氨排泄、離子轉(zhuǎn)運(yùn)、酸堿平衡和氣體交換等(涂翰卿等, 2019)。作為離子調(diào)節(jié)系統(tǒng)中的重要成員,NKA 通常在鰓中發(fā)揮作用(Henryet al, 2012)。在對(duì)遮目魚(Chanos chanos)鰓中的NKA 蛋白進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)后發(fā)現(xiàn), NKA 位于鰓上皮細(xì)胞的基底外側(cè)膜上(Tanget al, 2011)。同樣, 在黑小鯢(Hynobius nigrescens)的鰓扁平細(xì)胞和富含線粒體的細(xì)胞基底外側(cè)膜上觀察到了NKA 的免疫陽(yáng)性反應(yīng)(Uchiyamaet al, 2011)。本研究發(fā)現(xiàn), NKA 定位于縊蟶鰓的扁平細(xì)胞與柱狀細(xì)胞中, 與參與滲透調(diào)節(jié)的水通道蛋白(AQP)在鰓中的定位結(jié)果較為一致(Ruanet al, 2022)。此外, 氨氮脅迫后的NKA 陽(yáng)性信號(hào)較未脅迫的對(duì)照組明顯更強(qiáng), 且高氨脅迫下鰓中NKA基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平均有顯著上調(diào)(P<0.05), 這一現(xiàn)象在印度囊鰓鲇(Chewet al, 2020)和龜殼攀鱸(Ipet al,2012)中也有發(fā)現(xiàn), 表明NKA對(duì)氨氮刺激具有明顯的響應(yīng)。在亞致死氨氮濃度(1.5 mg/L 和3 mg/L)脅迫下菲律賓蛤仔(Tapes philippinarum)鰓中的NKA 酶活性明顯增強(qiáng)(P<0.05), 且用相同濃度的K+或NH+4進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)時(shí), NKA 均受到最大程度的激活, 表明NH+4可以替代K+從而被NKA 運(yùn)輸(Pagliaraniet al,2008)。暴露于高氨下,NKA基因的高表達(dá)可能是調(diào)節(jié)機(jī)體對(duì)氨氮應(yīng)激的適應(yīng)性反應(yīng): NKA 可以像結(jié)合K+一樣結(jié)合NH+4, 然后直接將其從細(xì)胞中轉(zhuǎn)運(yùn)出來(Tresguerreset al, 2020)。在本研究中, 高氨脅迫6～48 h,NKA基因的持續(xù)高表達(dá)表明, 短期氨氮脅迫下縊蟶可通過誘導(dǎo)NKA基因mRNA 的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白豐度上調(diào), 來促進(jìn)鰓中NH+4的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。

NH+4在水溶液中不能通過自由擴(kuò)散的方式穿過細(xì)胞膜, 而需要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與(Henryet al, 2012)。由于NH+4與K+的離子半徑、遷移率等物理特性相似,NH+4可以競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合K+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白, 如NKA、NKCC和KCN (Kinneet al, 1986; Choeet al, 2000; Weineret al, 2007)。研究發(fā)現(xiàn), 紅鰭東方 鲀(Takifugu rubripes)、熱帶雀鱔(Atractosteus tropiccus)、許氏齒彈涂魚(Periophthalmodon schlosseri)在氨氮脅迫下鰓中NKA和NKCC1的mRNA 表達(dá)水平均上調(diào), 表明二者在氨排泄過程中均發(fā)揮作用(Nawataet al, 2010; Chewet al, 2015; Aranda-Moraleset al, 2021)。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)Sc-NKA基因進(jìn)行RNAi 后發(fā)現(xiàn), 縊蟶血淋巴氨濃度在干擾后顯著升高, 證實(shí)了NKA 在氨氮轉(zhuǎn)運(yùn)中的重要作用。同時(shí), qRT-PCR 檢測(cè)Sc-NKA基因干擾后Sc-NKCC1的mRNA 表達(dá)量發(fā)現(xiàn), 對(duì)NKA基因的抑制會(huì)下調(diào)NKCC1基因的轉(zhuǎn)錄水平, 表明兩者之間可能存在著協(xié)同作用。水生生物通過鰓細(xì)胞基底外側(cè)膜上的NKCC1替代K+運(yùn)輸NH+4的生理活動(dòng)將導(dǎo)致流入上皮細(xì)胞的Na+增加, 因此, 增強(qiáng)NKA 酶的活性對(duì)于維持Na+電化學(xué)梯度至關(guān)重要(Chewet al, 2020)。也有研究推測(cè),NKA 能夠維持Na+梯度進(jìn)而驅(qū)動(dòng)NKCC1 (任琴, 2015)。結(jié)合本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果, 當(dāng)NKA表達(dá)水平降低時(shí), 細(xì)胞內(nèi)的Na+濃度將增加, 影響細(xì)胞內(nèi)外的Na+濃度梯度,進(jìn)而使NKCC1的表達(dá)受到抑制。

4 結(jié)論

本研究在縊蟶氨氮耐受和敏感群體中驗(yàn)證了位于NKA基因下游的SNP 位點(diǎn)(g.21062868T>A)與氨氮耐受性狀存在顯著關(guān)聯(lián)性(P<0.05), 分析了該基因在高氨脅迫下的時(shí)空表達(dá)規(guī)律, 發(fā)現(xiàn)氨氮刺激可以誘導(dǎo)Sc-NKA的高表達(dá)。Sc-NKA 蛋白定位于縊蟶鰓的柱狀細(xì)胞和扁平細(xì)胞中, 并且在氨氮脅迫后蛋白豐度增加。此外, 干擾Sc-NKA使血淋巴中的氨濃度升高, 并下調(diào)了同為K+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的Sc-NKCC1基因的轉(zhuǎn)錄水平, 這表明Sc-NKA 在氨運(yùn)輸過程中具有重要作用。后續(xù)將深入探究NKA 與其他轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在氨氮排泄中的互作關(guān)系, 為進(jìn)一步闡明縊蟶氨氮脅迫響應(yīng)分子機(jī)制奠定理論基礎(chǔ), 也為耐氨氮新品種的分子標(biāo)記輔助選育工作提供候選基因。