張樹乾 張素萍

(1.中國科學(xué)院海洋研究所海洋生物分類與系統(tǒng)演化實(shí)驗(yàn)室 青島市海洋生物多樣性與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 山東青島 266071;2.中國科學(xué)院海洋大科學(xué)研究中心 山東青島 266071)

針盤海牛屬DiaululaBergh, 1878 隸屬于腹足綱Gastropoda 、 裸 鰓 目 Nudibranchia 、 盤 海 牛 科Discodorididae。該屬種類分布廣, 在太平洋、大西洋和南非海域均有分布, 多數(shù)種類生活在潮間帶或淺海巖礁上, 以海綿為食(Marcuset al, 1967; Valdéset al, 2010), 目前僅有2 種在深海有分布(Valdés, 2001)。自針盤海牛屬建立以來, 有學(xué)者認(rèn)為該屬種類在生活方式和形狀、身體大小、齒舌以及生殖系統(tǒng)結(jié)構(gòu)特征等方面均與盤海牛屬DiscodorisBergh, 1877 種類極為相似, 因此將針盤海牛屬看作后者的同物異名(Thompson, 1975; McDonald, 1983)。然而, 這一觀點(diǎn)并未被一些學(xué)者所接受(如 Behrens, 1991)。Valdés(2001)基于形態(tài)學(xué)比較, 認(rèn)為針盤海牛屬種類的背部具帶有骨針的瘤狀突起, 前列腺分為兩部分,這些特征可明顯區(qū)分于盤海牛屬。

歐氏針盤海牛Diaulula odonoghuei(Steinberg,1963)在北太平洋海域從韓國(Koh, 2006)、日本(Baba,1957)、俄羅斯(Martynovet al, 2015), 到北美洲西海岸的加拿大和美國(Kelly, 2013; Lindsayet al, 2016)均有分布, 棲息于潮間帶或淺水區(qū)的巖礁上。迄今,我國已記錄了盤海?？浦衅渌? 屬9 種(張素萍, 2008;張素萍等, 2016), 但尚未對針盤海牛屬種類進(jìn)行過研究和報道。近年來, 作者對黃渤海的裸鰓類進(jìn)行調(diào)查時, 采集到歐氏針盤海牛2 個標(biāo)本, 系我國新記錄屬及新記錄種。本文中, 作者基于形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)對其進(jìn)行了研究報道。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)所用的盤海牛標(biāo)本于2021 年3 月10 日采自大連市黑石礁潮間帶, 共2 個標(biāo)本, 活體體長約為40 mm。標(biāo)本(酒精浸制)保存于中國科學(xué)院海洋生物標(biāo)本館, 標(biāo)本號為: MBM287595 和MBM287596。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 形態(tài)學(xué)研究 活體采集后, 帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行暫養(yǎng)。在體式顯微鏡下對外部形態(tài)的細(xì)微特征進(jìn)行了觀察, 利用數(shù)碼相機(jī)對其進(jìn)行了拍照, 并用卡尺對其體長進(jìn)行了測量。

齒舌的解剖: 沿動物的背部中線將外套膜剪開,用探針挑出口球部, 用解剖針及鑷子初步清除口球肌肉及齒舌上附著的組織后, 放入10% NaOH 溶液,室溫浸泡3～4 h 或60 °C 浸泡1～2 h, 期間振蕩數(shù)次以徹底去除附帶組織。

掃描電鏡拍攝: 將前期準(zhǔn)備的齒舌放在載玻片上, 展平后進(jìn)行空氣干燥, 將干燥后的齒舌用導(dǎo)電膠粘在樣品臺上, 放入鍍膜機(jī)內(nèi)噴金, 后放入掃描電鏡內(nèi), 5 kV 加速電壓下進(jìn)行觀察拍照。

1.2.2 分子生物學(xué)研究 切取2個標(biāo)本的足部肌肉各約30 mg, 使用TIANGEN 海洋生物基因組DNA 抽提試劑盒(北京, 天根生化科技)提取基因組DNA, 并在將所提取 DNA 溶解后置于 4°C 冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

用于擴(kuò)增樣品線粒體 COI 基因的引物序列為LCO1490 (5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG–3′) 和 HCO2198 (5′-TTAACTTCAGGGTGACC AAAAAATCA-3′) (Folmeret al, 1994); 用于擴(kuò)增線粒體16S rRNA 的引物序列為16S arL (5′-CGCCTGT TTAACAAAAACAT-3′, Palumbiet al, 2002)和16S R(5′-CCGRTYTGAACTC AGCTCACG-3′, Pusledniket al, 2008); 用于擴(kuò)增核基因H3 的引物序列為HexAF(F) (5′-ATGGCTCGTACCAAGCAGACGGC-3′) 和(5′-ATATCCTTGGGCATGATGGTGAC-3′) (Colganetal, 1998)。引物稀釋濃度為10 μmol/L, –20 °C 保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR 反應(yīng)總體積為25 μL, 其中包括2 μL 模板DNA, 12.5 μL Taq Mix, 引物各0.5 μL, 雙蒸水加至總體積。PCR 反應(yīng)程序?yàn)? 95 °C 預(yù)變性3 min, 95 °C變性30s, 45 °C 退火45 s, 72 °C 延伸10 min。在進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(U=5 V/cm)進(jìn)行確認(rèn)之后,將所得PCR 產(chǎn)物送至青島擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

將測得的基因片段與從GenBank 中下載的針盤海牛屬Diaulula的同源序列進(jìn)行分析(見表1), 利用MEGA X 將COI 和H3 基因片段翻譯成氨基酸序列進(jìn)行比對和人工校對, 利用MAFFT 軟件對16S rRNA進(jìn)行聚類, 并用Gblocks 軟件去除非信息位點(diǎn)。隨后,將這三個基因串聯(lián)成用于建立系統(tǒng)發(fā)育樹的多基因序列, 長度為1 423 bp, 其中包括COI 657 bp、16S rRNA 439 bp 以及H3 327 bp。根據(jù)ModelFinder 計算最佳分區(qū)模型, 得到的COI 和16S rRNA 的最佳模型均為HKY+F+I, H3 的最佳模型為HKY+F, 基于貝葉斯(BI)以及最大似然法(ML)分別構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。使用 MEGA X 計算針盤海牛屬種類種內(nèi)和種間的遺傳距離。

表1 本研究所用的基因序列Tab.1 Gene sequences used in the present study

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)描述

歐氏針盤海牛Diaulula odonoghuei(Steinberg,1963) (圖1, 圖2)

圖1 歐氏針盤海牛D. odonoghuei (Steinberg, 1963)的外部形態(tài)Fig.1 Externally morphology of D. odonoghuei (Steinberg, 1963)

圖2 歐氏針盤海牛D. odonoghuei (Steinberg, 1963)的齒舌Fig.2 Radula of D. odonoghuei (Steinberg, 1963)

Doris odonoghueiSteinberg, 1963: 63.

Doris echinataO’Donoghue, 1922: 149.

Doridigitata maculataO'Donoghue, 1926: 206.

Diaulula odonoghuei: Lindsayet al, 2016: 4, figs.A-B, E-G.

Diaulula boreopacificaMartynov: Sanamyan &Korshunova, 2015: 68, fig.2b.

模式標(biāo)本產(chǎn)地 加拿大溫哥華島(Vancouver Island)。

標(biāo)本采集地 遼寧(大連黑石礁)。

觀察標(biāo)本 2 個標(biāo)本, 黃海, 潮間帶巖礁,2021.III.10, 張樹乾采。

形態(tài)描述 動物中等大小, 體長40 mm, 呈橢圓形, 低平。外套背面密布有瘤狀突起, 每個突起的周緣具5 個直立的骨針?？谟|手呈指狀。嗅角粗壯, 上部約有18 個褶葉, 末端呈乳頭狀; 嗅角鞘低, 邊緣具瘤狀突起, 嗅角可完全縮入嗅角鞘內(nèi)。鰓羽狀, 6 葉, 3歧分枝, 圍繞肛門突起排列成圓形, 可完全縮入鰓腔內(nèi)。足部寬大, 呈橢圓形, 后端可在動物伸展時突出外套后方。體色為淡黃色, 外套背部兩側(cè)具有排列不規(guī)則、大小不等的、呈圓形的黑色斑點(diǎn)。

齒舌齒式為20·0·20。中央齒缺, 側(cè)齒呈鉤狀, 前10 對側(cè)齒逐漸變大, 隨后側(cè)齒逐漸向外緣變小。

生態(tài)習(xí)性 生活于潮間帶至淺水區(qū)的巖礁間,以海綿為食。

地理分布 歐氏針盤海牛在北太平洋分布廣泛,見于韓國、日本、俄羅斯, 加拿大和美國西海岸。本種在我國沿海為首次報道。

2.2 COI 基因分析和系統(tǒng)進(jìn)化分析

測序獲得本研究2 個歐氏針盤海牛標(biāo)本的COI基因序列, 結(jié)合GenBank 下載的針盤海牛屬種類的COI 基因序列進(jìn)行對比分析, 兩端對齊, 獲得一致序列639bp?；?Kimura-2-parameter 模型計算各針盤海牛種內(nèi)及種間遺傳距離。4 種針盤海牛屬種類的種內(nèi)遺傳距離為 0%～1.9%, 種間遺傳距離為 7.5%～23.7%。比較歐氏針盤海牛與其余3 種針盤海牛遺傳距離可知, 歐氏針盤海牛與Diaulula sandiegensis的遺傳距離最近(7.5%～8.7%), 與Diaulula greeleyi的遺傳距離最遠(yuǎn)(23.1%～23.7%)。在分析的5 個歐氏針盤海牛個體中, 中國海的個體與日本海的個體具有最近的遺傳距離(0.2%), 而與俄羅斯和美國的個體的遺傳距離分別為1.8%。

以同科中的兩個圍鰓海牛屬Jorunna種類作為外群, 基于最大似然法以及貝葉斯法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。兩種算法獲得的系統(tǒng)發(fā)育樹具有基本相同的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)(圖3)。針盤海牛屬的4 個種類聚為一個單系分支,不同的種聚在不同的分支上, 節(jié)點(diǎn)均擁有較高的支持率。在歐氏針盤海牛的分支上, 本研究所用的個體與日本的個體先聚在一起, 隨后該分支再與俄羅斯和美國的個體相聚。

圖3 基于多基因序列(COI, 16S rRNA, H3)構(gòu)建的針盤海牛屬系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree inferred by Bayesian analysis (BI) and maximum likelihood (ML) based on concatenated dataset of COI, 16S,and H3 genes

3 討論

本研究所用標(biāo)本的形態(tài)特征與歐氏針盤海牛Diaulula odonoghuei(Steinberg, 1963)的原始描述特征及其他文獻(xiàn)的描述相吻合。由于歐氏針盤海牛在外部形態(tài)、齒舌特征以及生殖系統(tǒng)構(gòu)造方面與Diaulula sandiegensis(J.G.Cooper, 1863)均十分相似, 因此常被認(rèn)為是后者的同物異名(Behrenset al, 2001)。然而,近年來的分子生物學(xué)研究證實(shí)了它們?yōu)椴煌姆N(Lindsayet al, 2016)。基于分子結(jié)果, Lindsay 等(2016)對這兩個種的外部形態(tài)進(jìn)行了進(jìn)一步的比較, 發(fā)現(xiàn)它們之間存在穩(wěn)定的形態(tài)差異, 即: 歐氏針盤海牛背部的黑色斑點(diǎn)全部為實(shí)心狀, 而Diaulula sandiegensis背部的黑色斑點(diǎn)為環(huán)形。Diaululaodonoghuei分布于日本海至加利福尼亞北部,Diaululasandiegensis僅分布于加利福尼亞, 兩者的分布范圍在加利福尼亞北部有一定的重合。

Martynov 等(2015)認(rèn)為Diaulula odonoghuei的原始描述過于簡單, 并不能證明該種屬于針盤海牛屬Diaulula, 而很可能屬于盤海?？浦械钠渌麑? 因此,對其種名的有效性提出異議。事實(shí)上, 在Diaulula odonoghuei的原始描述中, O’Donoghue (1922)明確指出其背部具帶有骨針的瘤狀突起, 另外還對齒舌和一些解剖結(jié)構(gòu)進(jìn)行了描述, 這些特征均與針盤海牛屬Diaulula的特征相吻合。此外, Lindsay 等(2016)在模式種產(chǎn)地附近又重新采到了Diaulula odonoghuei標(biāo)本, 通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)研究進(jìn)一步確認(rèn)了該種為針盤海牛屬種類, 從而證實(shí)了它的有效性。

4 結(jié)論

本文基于形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)研究, 報道了中國海盤海?？? 記錄屬和1 新記錄種: 歐氏針盤海牛Diaulula odonoghuei(Steinberg, 1963)。該種在北太平洋海域的分布范圍極廣, 從韓國、日本、俄羅斯, 到北美洲西海岸的加拿大和美國均有分布。歐氏針盤海牛在中國海的發(fā)現(xiàn), 不僅豐富了中國海軟體動物多樣性研究內(nèi)容, 也為更好地理解該種在北太平洋的擴(kuò)散和演化提供了新的數(shù)據(jù)和資料。