王一奇 丁翔翔 宋會(huì)銀 陳楠生

(1.中國(guó)科學(xué)院海洋研究所海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 山東青島 266071; 2.嶗山實(shí)驗(yàn)室 海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)功能實(shí)驗(yàn)室 山東青島 266237; 3.中國(guó)科學(xué)院海洋大科學(xué)研究中心 山東青島 266071; 4.中國(guó)科學(xué)院大學(xué) 北京 100049; 5.江漢大學(xué) 湖北武漢 430056)

隸屬于定鞭藻門(Haptophyta) 的棕囊藻屬(PhaeocystisLagerheim)物種在包括極地和溫帶海域在內(nèi)的全球海域廣泛分布, 既是重要的初級(jí)生產(chǎn)者,也是構(gòu)成海洋生態(tài)系統(tǒng)的基礎(chǔ), 為浮游動(dòng)物提供食物(齊雨藻等, 2001)。棕囊藻屬物種具有重要的生態(tài)功能, 不僅能夠合成和降解二甲基巰基丙酸(DMSP),釋放二甲基硫(DMS)在氣候調(diào)節(jié)中起重要作用(沈萍萍等, 2018), 而且可以引起赤潮, 在包括歐洲北海沿岸海域、荷蘭沿海、挪威海等海域頻繁暴發(fā), 產(chǎn)生灰白色泡沫, 給海洋環(huán)境和漁業(yè)造成極大危害(齊雨藻等, 2002)。自1997 年10 月球形棕囊藻(Phaeocystis globosa)赤潮首次在我國(guó)東南沿海海域大規(guī)模暴發(fā)以來(lái), 球形棕囊藻赤潮在包括福建、廣東、廣西、海南、河北及天津等省市海域在內(nèi)的多個(gè)海域都頻繁暴發(fā)(Wanget al, 2021)。

由于球形棕囊藻具有復(fù)雜的異型生活周期(heteromorphic life cycle), 既包括游離具有鞭毛的單細(xì)胞形態(tài), 也具有囊體形態(tài), 不同形態(tài)具有不同的生理和生態(tài)特征(Rousseauet al, 2007; Wanget al, 2021),加上球形棕囊藻細(xì)胞很小(直徑約3～9 μm), 增加了基于形態(tài)特征的檢測(cè)和鑒定的難度。1997 年球形棕囊藻赤潮首次在我國(guó)海域暴發(fā)時(shí), 曾經(jīng)根據(jù)其形態(tài)特征鑒定為波切棕囊藻(Phaeocystis pouchetii) (何家菀等, 1999), 后來(lái)通過(guò)分子生物學(xué)方法確認(rèn)為球形棕囊藻(王寧等, 2000), 表明分子生物學(xué)方法的輔助鑒定大大提升了鑒定的敏感性和準(zhǔn)確性。在球形棕囊藻赤潮首次在我國(guó)海域暴發(fā)時(shí), 赤潮原因種曾被鑒定為一個(gè)新紀(jì)錄種(陳菊芳等, 1999)。不過(guò)由于其細(xì)胞小,在浮游植物調(diào)查研究中可能被忽視, 因此并不能排除它本來(lái)就是我國(guó)海域的一個(gè)常見(jiàn)物種, 只是長(zhǎng)期沒(méi)有得到準(zhǔn)確鑒定。

基于通用分子標(biāo)記擴(kuò)增子高通量測(cè)序的宏條形碼分析(metabarcoding analysis)越來(lái)越廣泛地應(yīng)用于鑒定特定海洋生態(tài)環(huán)境中浮游植物的組成并跟蹤浮游植物的時(shí)空動(dòng)態(tài)變化(陳楠生, 2020)。與其他種類分子標(biāo)記相比, 針對(duì)海洋浮游植物和赤潮物種的宏條形碼分析中應(yīng)用最多的分子標(biāo)記18S rDNA V4 具有較高的分辨率, 其長(zhǎng)度(～380 bp)也適于DNA 二代測(cè)序技術(shù), 而且參考序列最豐富(Guillouet al, 2013)。不過(guò), 由于包括球形棕囊藻在內(nèi)的定鞭藻物種的18S rDNA 均具有較高的GC 含量, 使得基于不同引物的PCR 擴(kuò)增結(jié)果出現(xiàn)了不利于定鞭藻物種的擴(kuò)增偏好性, 導(dǎo)致宏條形碼分析容易遺漏掉大量的定鞭藻物種(Liuet al, 2009)。這些研究表明擴(kuò)增引物的選擇對(duì)針對(duì)定鞭藻物種的宏條形碼分析的重要性。為了評(píng)估18S rDNA V4 不同擴(kuò)增引物對(duì)球形棕囊藻宏條形碼分析結(jié)果的影響, 我們利用青島棧橋海域的水樣, 比較分析了18S rDNA V4 擴(kuò)增引物對(duì)宏條形碼分析結(jié)果的影響。本研究比較分析了18S rDNA V4 兩組常用擴(kuò)增引物: (1) 由Stoeck 等開發(fā)的擴(kuò)增引物(簡(jiǎn)稱Stoeck 引物), 包括 V4F: CCAGCA(G/C)C(C/T)GCGGTAATTCC 和V4R: ACTTTCGTTCTTGAT(C/T)(A/G)A (Stoecket al, 2010; Liuet al, 2021); (2) 由宋倫等開發(fā)的擴(kuò)增引物(簡(jiǎn)稱Song 引物), 包括V4-F:GCGGTAATTCCAGCTCCAAT 和V4-R: GATCCCC HWACTTTCGTTCTTGA(宋倫等, 2016)。除此之外,還比較分析了2021 年冬季青島近岸海域(西海岸)首次暴發(fā)的球形棕囊藻赤潮(Liet al, 2022; Songet al,2022; 張清春等, 2022)樣本的球形棕囊藻及其時(shí)間動(dòng)態(tài)變化。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

為了比較分析通用分子標(biāo)記18S rDNA V4 的擴(kuò)增引物選擇對(duì)針對(duì)球形棕囊藻的宏條形碼分析結(jié)果的影響, 我們?cè)谇鄭u棧橋海域系統(tǒng)開展了時(shí)間序列的采樣。從2021 年9 月1 日至30 日, 于青島棧橋定點(diǎn)(圖1)完成了30 天不間斷的連續(xù)逐日采樣。采集時(shí)間為每天上午10 點(diǎn), 每次采集表層海水5 L, 采用200 μm 篩絹于現(xiàn)場(chǎng)完成藻細(xì)胞過(guò)濾, 去掉大型的浮游動(dòng)物和浮游植物, 保留藻細(xì)胞樣本, 帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行第2 次過(guò)濾, 采用0.2 μm 的聚碳酸酯膜(Millipore,USA) 對(duì)1.5 L 海水進(jìn)行過(guò)濾, 攜帶藻細(xì)胞的濾膜迅速放入液氮罐中冷凍保存。除了采集藻細(xì)胞, 還于現(xiàn)場(chǎng)完成了溫度和鹽度的測(cè)量, 并于實(shí)驗(yàn)室完成了對(duì)海水樣本進(jìn)行葉綠素和營(yíng)養(yǎng)鹽測(cè)量(附表1)。

圖1 本研究采樣位點(diǎn)示意圖Fig.1 Locations of sampling sites in this study

青島近海于2021 年冬季(12 月)突然暴發(fā)了一次球形棕囊藻赤潮, 我們對(duì)此赤潮事件也進(jìn)行了時(shí)間序列的采樣。采樣站位位于青島魯海豐海洋牧場(chǎng)(圖1),共完成了7 次采樣, 包括12 月3 日、12 月8 日、12月11 日、12 月16 日、12 月21 日、12 月26 日和12月31 日采樣。赤潮暴發(fā)期間, 海水中的球形棕囊藻囊體很多, 肉眼可見(jiàn)(附圖1), 最后一次采集樣品時(shí)肉眼可見(jiàn)的囊體很少且沒(méi)有完整的形態(tài)。每次采集1.5 L 表層海水, 為避免過(guò)濾掉囊體, 現(xiàn)場(chǎng)直接采集表層海水, 未經(jīng)篩娟過(guò)濾, 后續(xù)的采樣流程與青島棧橋海域時(shí)間序列的采樣流程相同。

1.2 DNA 提取、PCR 擴(kuò)增與測(cè)序

濾膜細(xì)胞的DNA 提取方法參照文獻(xiàn)(Liuet al,2020)。為了比較由于引物選擇對(duì)分子標(biāo)記18S rDNA V4 擴(kuò)增結(jié)果的影響, 分別利用Stoeck 引物和Song 引物對(duì)棧橋海域樣本的DNA 進(jìn)行了擴(kuò)增。

針對(duì)西海岸赤潮海域樣本, 利用Song 引物進(jìn)行了擴(kuò)增。

擴(kuò)增結(jié)束后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR 產(chǎn)物的長(zhǎng)度, 檢測(cè)合格后將產(chǎn)物送至北京諾禾致源科技股份有限公司, 使用 Illumina 公司 TruSeq DNA PCR-Free Library Preparation Kit 建庫(kù)試劑盒進(jìn)行文庫(kù)的構(gòu)建, 構(gòu)建好的文庫(kù)經(jīng)過(guò)Qubit 定量和文庫(kù)檢測(cè), 合格后, 使用NovaSeq 6000 PE250 模式進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。

1.3 生物信息學(xué)分析

利用R 包DADA2 對(duì)擴(kuò)增子測(cè)序結(jié)果展開宏條形碼分析(Callahanet al, 2016, 2017), 分析參數(shù)設(shè)置如下: maxEE = c (2,2), minLen = 200, truncLen = c(220,220), minBoot = 80, and Min overlap = 12。運(yùn)行得到ASV 豐度信息以及各個(gè)ASV 的PR2注釋結(jié)果。為保證各樣本測(cè)序深度的可比性, 使用R 包Vegan(Dixon, 2003)按照ASV 豐度表格中樣本的最低數(shù)據(jù)量抽平, 并采用0.01%的閾值進(jìn)行豐度篩選。接著對(duì)各個(gè)ASV 進(jìn)行進(jìn)一步的blastn 注釋, 設(shè)置PID 大于99%, Coverage 大于95%, 合并PR2注釋結(jié)果和blastn注釋結(jié)果。通過(guò)Mega 11.0 軟件的最大似然法構(gòu)建了ASV 和代表序列之間的遺傳進(jìn)化樹(Tamuraet al,2021), Bootstrap 值為1 000。各ASV 之間的TCS 遺傳網(wǎng)絡(luò)圖是借助PopART v1.7 構(gòu)建的(Leighet al,2015)。利用R 包c(diǎn)orrplot (Weiet al, 2017)和psych(Revelle, 2021)完成了ASV 與環(huán)境因子的相關(guān)性分析。利用R 包Vegan (Dixon, 2003)完成了對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)的稀釋曲線分析。

1.4 基于18S rDNA V4 的遺傳多樣性分析

把從宏條形碼分析結(jié)果中篩選出注釋為球形棕囊藻的18S rDNA V4 ASV 序列, 以及從不同海域分離到的代表性球形棕囊藻株系的18S rDNA V4 序列一起構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。這些代表性球形棕囊藻株系包括: CNS00062(北部灣)、CNS00063(北部灣)、CNS00069(北部灣)、CNS00073(北部灣)、CNS00076(北部灣)、CNS00082(越南)、CNS00093(越南)、CNS00254(越南)、CNS00079(泰國(guó))、CNS01609(青島西海岸赤潮暴發(fā)海域)和Pg-G(A) (歐洲北海)。

2 結(jié)果

2.1 評(píng)估18S rDNA V4 擴(kuò)增引物對(duì)球形棕囊藻宏條形碼分析結(jié)果的影響

本研究中, 每一個(gè)樣本的18S rDNA V4 擴(kuò)增子通過(guò)二代測(cè)序獲得約5 萬(wàn)條reads (圖2)。稀釋曲線分析(附圖2a, 2b)表明測(cè)序深度基本達(dá)到飽和, 足夠用于分析樣本中浮游植物的組成。通過(guò)對(duì)不同擴(kuò)增引物(Stoeck 引物和Song 引物)獲得的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行宏條形碼分析, 獲得了綠藻, 隱藻, 甲藻, 定鞭藻等浮游植物門的組成信息(圖2)。利用Stoeck 引物(Stoecket al, 2010; Liuet al, 2021)的擴(kuò)增結(jié)果開展宏條形碼分析獲得的甲藻門(Dinoflagellata)、棕鞭藻門(Ochrophyta,包 括 硅 藻) 、 定 鞭 藻 門(Haptophyta) 、 綠 藻 門(Chlorophyta)和隱藻門(Cryptophyta)的ASV(amplicon sequence variant, 擴(kuò)增子序列變異)數(shù)目分別為479、244、0、43 和21 個(gè); 利用Song 引物(宋倫等, 2016)的擴(kuò)增結(jié)果開展宏條形碼分析獲得的甲藻門、棕鞭藻門、定鞭藻門、綠藻門和隱藻門分別為581、293、76、49 和26 個(gè)。比較兩種引物的分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)差異主要體現(xiàn)在定鞭藻門上, 利用Stoeck 引物的宏條形碼分析沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何鑒定為定鞭藻門的ASV, 而利用Song 引物的宏條形碼分析發(fā)現(xiàn)了76 個(gè)鑒定為定鞭藻門的ASVs (圖3a, 3c)。因此, Song 引物能夠更好地實(shí)現(xiàn)對(duì)18S rDNA V4 的擴(kuò)增, 從而能夠更好地?cái)U(kuò)增出定鞭藻物種, 更適于針對(duì)定鞭藻的宏條形碼分析。

圖2 棧橋海域樣本的宏條形碼分析流程Fig.2 Metabarcoding analysis of the samples collected in Zhanqiao Pier, Qingdao

2.2 宏條形碼分析可以成功鑒定球形棕囊藻并且能夠鑒定球形棕囊藻的遺傳多樣性

通過(guò)對(duì)青島棧橋海域的30 個(gè)逐日樣本的宏條形碼分析得到的全部ASVs 進(jìn)行物種注釋, (圖4a)發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)ASVs (ASV_2 和ASV_6)注釋為球形棕囊藻,這兩個(gè)ASVs 可能代表兩個(gè)球形棕囊藻株系。這兩個(gè)ASVs 在所有30 個(gè)棧橋海域樣本中都出現(xiàn)了(圖5d, 5e,5f), 并且具有相對(duì)穩(wěn)定的水平, 表明青島海域中存在球形棕囊藻, 并且存在一定的遺傳多樣性, 是青島近海的本地株系。本研究表明Song 引物不僅可以成功擴(kuò)增球形棕囊藻的18S rDNA V4, 并且擴(kuò)增結(jié)果可以揭示球形棕囊藻的遺傳多樣性。

圖4 球形棕囊藻ASVs 之間的遺傳多樣性及其與環(huán)境因子相關(guān)性分析Fig.4 TCS network display of ASVs annotated as P. globosa and their correlation with environmental factors

利用Song 引物對(duì)青島近海2021 年冬季(12 月)突發(fā)性球形棕囊藻赤潮暴發(fā)期間采集的時(shí)間序列樣本的宏條形碼分析也發(fā)現(xiàn)了這兩個(gè)ASVs 的信息, 并且比較分析發(fā)現(xiàn)兩種ASVs 的相對(duì)豐度顯示出不同的時(shí)間變化規(guī)律(圖5)。在從青島西海岸球形棕囊藻赤潮暴發(fā)過(guò)程中采集到的樣本中, ASV_2 代表的球形棕囊藻株系在赤潮暴發(fā)高潮期間的相對(duì)豐度較高, 并在赤潮暴發(fā)過(guò)程中顯示出較強(qiáng)的豐度變化, 隨著赤潮的消退逐步降低(圖5a)。與ASV_2 代表的株系相比, ASV_6 代表的球形棕囊藻株系的相對(duì)豐度較低,并在赤潮暴發(fā)過(guò)程中顯示出較弱的豐度變化, 基本維持在接近本底的水平(圖5b)。此外, 在球形棕囊藻赤潮暴發(fā)高峰時(shí)ASV_2 的豐度也高于ASV_ 6(圖5c)。這說(shuō)明以ASV_2 和ASV_6 為代表的兩類球形棕囊藻在西海岸赤潮暴發(fā)中扮演著不同的角色: 以 ASV_2 為代表的球形棕囊藻隨著西海岸赤潮暴發(fā)呈現(xiàn)出先增加后減少的趨勢(shì), 且在西海岸赤潮起主要作用, 而以 ASV_6 為代表的球形棕囊藻變化較小。ASV_2 和ASV_6 與青島海域的環(huán)境因子的相關(guān)性分析(圖4b)表明, 與ASV_6 相比, ASV_2 與海水溫度呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01), 說(shuō)明ASV_2 代表的是一類耐低溫的球形棕囊藻株系, 在環(huán)境條件適宜時(shí)造成此次赤潮暴發(fā)。

2.3 基于18S rDNA V4 的球形棕囊藻遺傳多樣性分析

前期的研究表明球形棕囊藻具有較高的遺傳多樣性(Songet al, 2020, 2021, 2022; Wanget al, 2021)。為了探索本研究中發(fā)現(xiàn)的ASV_2 和ASV_6 所代表的球形棕囊藻與前期報(bào)道的球形棕囊藻的遺傳多樣性之間的關(guān)系, 我們將ASV_2 和ASV_6 序列與11 株從不同海域分離的球形棕囊藻株系的18S rDNA V4序列進(jìn)行了遺傳進(jìn)化分析(圖6)。發(fā)現(xiàn)這些18S rDNA V4 序列可以聚成兩個(gè)不同的分支, 球形棕囊藻代表性株系的18S rDNA V4 序列要么與ASV_2 聚在一起,要么與ASV_6 聚在一起(圖6), 表明根據(jù)18S rDNA V4 可以將球形棕囊藻株系區(qū)分為兩類。此外, ASV_2序列還與CNS01609 株系(在青島西海岸赤潮暴發(fā)海域分離)聚在一起。本研究表明, 宏條形碼分析中常用的通用分子標(biāo)記(即可以用于擴(kuò)增廣譜性物種)18S rDNA V4 不僅可以鑒定到球形棕囊藻, 還可以用于初步區(qū)分球形棕囊藻的遺傳差異。

圖6 基于通用分子標(biāo)記18S rDNA V4 序列的遺傳進(jìn)化分析Fig.6 Phylogenetic analysis of the common molecular marker 18S rDNA V4

3 討論

3.1 通用分子標(biāo)記18S rDNA V4 的PCR 擴(kuò)增引物選擇對(duì)宏條形碼分析結(jié)果的準(zhǔn)確性很重要

通過(guò)比較針對(duì)分子標(biāo)記18S rDNA V4 的兩套不同PCR 擴(kuò)增引物(即Stoeck 引物和Song 引物)發(fā)現(xiàn),這兩套針對(duì)18S rDNA V4 的擴(kuò)增引物得到的宏條形碼分析結(jié)果顯示出巨大不同。盡管基于兩套引物的宏條形碼分析均鑒定出大部分門類的浮游植物組成,包括甲藻、棕鞭藻、綠藻和隱藻(圖3)。然而只有基于Song 引物的宏條形碼分析獲得了定鞭藻信息(76個(gè)ASVs), 基于Stoeck 引物的宏條形碼分析沒(méi)有檢測(cè)到任何定鞭藻信息。本研究結(jié)果與宋倫等(2016)的分析結(jié)果基本相符。此外, 本研究結(jié)果進(jìn)一步明確了18S rDNA V4 擴(kuò)增引物的選擇對(duì)研究結(jié)果的準(zhǔn)確性很重要。

3.2 青島近岸海域存在當(dāng)?shù)厍蛐巫啬以逯晗?/h3>

本研究發(fā)現(xiàn)在青島近岸海域中可以鑒定到球形棕囊藻信息, 并且該分子生物學(xué)鑒定結(jié)果與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果(附圖1)相符, 因球形棕囊藻單細(xì)胞尺寸很小, 分子生物學(xué)的快速鑒定顯示出方法的優(yōu)勢(shì)。此外,針對(duì)野外樣本的宏條形碼分析得到的球形棕囊藻序列ASV_2 與2021 年冬季青島西海岸球形棕囊藻赤潮暴發(fā)海域分離到的球形棕囊藻株系CNS01609 的18S rDNA V4 序列完全一致(圖6), 進(jìn)一步證實(shí)青島近岸海域存在本底球形棕囊藻株系。不僅如此, 經(jīng)分子生物學(xué)鑒定分析發(fā)現(xiàn)在青島棧橋海域和西海岸赤潮暴發(fā)海域中均出現(xiàn)了兩類不同的球形棕囊藻株系(即由ASV_2 和ASV_6 代表的兩類株系)。ASV_2 和ASV_6在2021 年9 月棧橋海域的整月采樣過(guò)程中相對(duì)比較穩(wěn)定, 沒(méi)有受到潮汐的顯著影響(圖5)。利用 18S rDNA V4 (Liuet al, 2020)針對(duì)2019 年1 月膠州灣海域樣本的宏條形碼分析以及利用高分辨率分子標(biāo)記pgcp1(Songet al, 2020, 2022)和cox1(Songet al, 2021,2022)針對(duì)2019 年1 月膠州灣海域樣本的分子分析也鑒定到球形棕囊藻的存在, 與本研究結(jié)果相符, 表明青島海域不僅存在本底球形棕囊藻, 還具有一定的遺傳多樣性。

3.3 不同球形棕囊藻株系對(duì)青島海域突發(fā)性赤潮具有不同的貢獻(xiàn)

本研究基于18S rDNA V4 的宏條形碼分析發(fā)現(xiàn),于2021 年冬季(12 月)在青島近海突然暴發(fā)的球形棕囊藻赤潮樣本中可以分辨出兩個(gè)主要 ASVs, 即ASV_2 和ASV_6。其中ASV_2 的相對(duì)豐度較高, 并隨赤潮的變化呈現(xiàn)顯著的動(dòng)態(tài)變化, 隨著赤潮消退呈現(xiàn)下降趨勢(shì)(圖5)。說(shuō)明造成此次赤潮的致災(zāi)基因型是以ASV_2 所代表的這類球形棕囊藻株系。由此可以判斷, 不同株系對(duì)球形棕囊藻赤潮的形成具有不同的貢獻(xiàn)。從該赤潮暴發(fā)海域分離到的球形棕囊藻株系CNS01609 的18S rDNA V4 序列與ASV_2 序列在系統(tǒng)發(fā)育樹中聚在一起(圖6), 表明代表ASV_2 的球形棕囊藻株系在赤潮樣本中大量存在。

4 結(jié)論

18S rDNA V4 是迄今宏條形碼分析中最常用的分子標(biāo)記(陳楠生, 2020)。本研究比較了兩對(duì)不同的18S rDNA V4 引物在擴(kuò)增球形棕囊藻時(shí)的差別, 包括常用引物(即Stoeck 引物)和球形棕囊藻特異性引物(即Song 引物)。比較分析表明在展開宏條形碼分析時(shí), 選擇合適的引物對(duì)于分析結(jié)果至關(guān)重要。宏條形碼分析結(jié)果表明, 青島近岸海域存在本底球形棕囊藻, 盡管相對(duì)豐度不高, 但是具有一定的遺傳多樣性,主要有兩種, 分別由ASV_2 和ASV_6 所代表。其中ASV_2 所代表的球形棕囊藻株系更可能是造成此次赤潮暴發(fā)的致災(zāi)基因型, 表明不同球形棕囊藻株系在球形棕囊藻赤潮暴發(fā)過(guò)程中的貢獻(xiàn)不同。此外, 兩種代表ASVs 與環(huán)境因子的相關(guān)性分析表明, ASV_2所代表的球形棕囊藻株系與溫度呈顯著負(fù)相關(guān)。本研究表明利用Song 引物擴(kuò)增分子標(biāo)記18S rDNA V4 在鑒定其他大量浮游植物的同時(shí), 不僅可以檢測(cè)到青島近岸海域存在本底球形棕囊藻, 還可以鑒定出2 種基因型的球形棕囊藻(ASV_2 和ASV_6)。因此, 在考慮選擇合適的引物開展針對(duì)球形棕囊藻以及其他定鞭藻的宏條形碼分析時(shí), 建議選擇Song 引物(宋倫等,2016)開展基于18S rDNA V4 的宏條形碼研究。不過(guò),如果研究目標(biāo)只是球形棕囊藻的遺傳多樣性, 可以選擇利用高分辨率分子標(biāo)記pgcp1(Songet al., 2020)或cox1(Songet al., 2021)。