張 慧 葛海波

（南京中醫(yī)藥大學附屬南京中醫(yī)院，江蘇南京 210022）

近年來，哮喘的患病率逐年上升，目前全球已有3 億人患有哮喘，預計到2025 年哮喘的患病率將達到4 億人[1]。龐大的哮喘患病人群以及居高不下的死亡率使得哮喘成為世界范圍內(nèi)的重大公共衛(wèi)生問題。目前，哮喘的基礎治療包括使用皮質(zhì)類固醇、β2受體激動劑和白三烯拮抗劑，這些藥物可減輕炎癥，但在預防和逆轉氣道重塑方面無明顯療效[2]。在哮喘發(fā)病過程中預防氣道重塑具有降低疾病嚴重程度、控制和預防疾病進展的潛力。因此，尋找抑制哮喘氣道重塑的藥物是哮喘治療的關鍵所在。

相關研究表明，上皮細胞間質(zhì)轉化（epithelial to mesenchymal transition，EMT）在哮喘氣道重塑的發(fā)生中起著重要作用[3]。EMT是一種與上皮極性喪失、間充質(zhì)標志物表達及流動性增強、細胞外基質(zhì)重塑相關的細胞狀態(tài)，如緊密和貼壁連接以及上皮標記物E-鈣黏蛋白（E-cadherin）表達減少，并獲得間充質(zhì)特性，即N-鈣黏蛋白（N-cadherin）和α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）的表達增加，使得上皮細胞在此期間失去上皮特征。轉化生 長 因 子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）分泌聚集及其活化的細胞信號轉導分子2/3（mothers against decapentaplegic homolog2/3，Smad2/3）蛋白的免疫反應性增加是導致EMT的關鍵信號通路[4]。與正常上皮細胞相比，來自哮喘患者的原代氣道上皮細胞在TGF-β1干預下會導致E-cadherin的缺失及Smad2/3磷酸化水平的增加[5]。因此，抑制TGF-β1及其下游Smad2/3信號通路，減少氣道EMT是干預哮喘發(fā)生、發(fā)展的關鍵分子機制。三子養(yǎng)親湯出自《韓氏醫(yī)通》，由紫蘇子、白芥子、萊菔子3 味中藥組成，為著名的溫化寒痰方劑?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)本方對哮喘中證見痰壅氣滯者有顯著療效，可有效改善患者肺功能，緩解癥狀，并能稀釋痰質(zhì)以助黏痰排出[6-7]。機制研究發(fā)現(xiàn)，三子養(yǎng)親湯可減輕哮喘患者氣道重塑[8]，但其具體作用機制尚未闡明。本研究擬制備哮喘小鼠模型，觀察三子養(yǎng)親湯對TGF-β1/Smad2/3 信號通路的干預作用以深入探索本方抑制哮喘氣道EMT的作用機制，以期為三子養(yǎng)親湯治療哮喘提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 40只無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級雌性16～18周齡Balb/c小鼠，體質(zhì)量（18±2）g，購自浙江維通利華實驗動物科技有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（浙）2019-0001。動物飼養(yǎng)及實驗過程遵循實驗動物福利3R原則，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會審批通過。

1.2 實驗藥物 三子養(yǎng)親湯（白芥子9 g，紫蘇子9 g，萊菔子9 g），藥物飲片購自上海真仁堂藥業(yè)有限公司。將中藥飲片置于煎藥陶罐中浸泡1 h，水煎2次，合并煎出液后濃縮，用純凈水配置成生藥含量1.08 g/mL、0.54 g/mL的溶液，置于4 ℃冰箱中備用。地塞米松（批號：HY-14648）購自美國MCE公司，規(guī)格500 mg，用純凈水配置成濃度為0.075 mg/mL的溶液，置于-20 ℃冰箱中備用。

1.3 主要試劑 細胞裂解液（批號：P10013B）、磷酸酶抑制劑（批號：P1081）、蛋白酶抑制劑（批號：P1010）、BCA蛋白定量試劑盒（批號：P0010）、ECL發(fā)光液（批號：P0018S）及蘇木素伊紅（HE）染色試劑盒（批號：C0105S）購自上海碧云天生物技術有限公司；E-cadherin（批號：14472）、N-cadherin（批 號：13116）、β-actin（批 號：3700）、TGF-β1（批號：3711）、Smad2（批號：5339）、Smad3（批號：9523）、磷酸化Smad2（P-Smad2，批號：3104）、磷酸化-Smad3（P-Smad3，批號：9520）抗體購自美國CST公司；α-SMA（批號：14395）、GAPDH（批號：60004-1）購自武漢三鷹生物技術有限公司；雞卵白蛋白（Ovalbumin，OVA，批號：A5503）、硫酸鋁鉀十二水合物（批號：237086）、氯化乙酰甲基膽堿（Mch，批號：A2251）購自美國sigma公司；小鼠抗卵清蛋白免疫球蛋白E（IgE）酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）檢測試劑盒（批號：JL23405）購自上海江萊生物科技有限公司。1.4 主要儀器 全自動多功能酶標儀（型號：DK-3506），購自德卡精密量儀（深圳）有限公司；凝膠成像儀（型號：GelDoc XR+），購自美國伯樂公司；CO2電熱恒溫細菌細胞培養(yǎng)箱（型號：HCP-80S），購自廣州市康恒儀器有限公司；光學顯微鏡（型號：BX53M），購自日本Olympus公司；電子天平（型號：CP214），購自美國奧豪斯公司；垂直電泳儀（型號：1658033），購自美國伯樂公司；無創(chuàng)肺功能儀（型號：Link Master），購自英國EMMS公司。

2 實驗方法

2.1 分組與造模、給藥 小鼠適應性喂養(yǎng)1周后隨機分為正常組、模型組、地塞米松組及三子養(yǎng)親湯低、高劑量組，每組8只。除正常組外，其余各組小鼠參考ZENG L W等[9]的實驗方法構建哮喘小鼠模型：于造模第1天及第14天腹腔注射100 μL致敏液（OVA 1 mg/mL及硫酸鋁鉀0.2 g/mL混合液）致敏，造模第14、25、26、27天予1 mg/mL OVA 25 μL滴鼻激發(fā)，兩側鼻孔各滴入12.5 μL。正常組小鼠同期予等量無菌生理鹽水腹腔注射，等量生理鹽水滴鼻。造模開始后第14至27天，三子養(yǎng)親湯低、高劑量組分別予三子養(yǎng)親湯5.4 g/（kg·d）、10.8 g/（kg·d）灌胃，地塞米松組予地塞米松0.75 mg/（kg·d）灌胃，正常組及模型組予等量無菌水灌胃，每只小鼠灌胃體積為0.2 mL（以小鼠體質(zhì)量20 g計算），連續(xù)灌胃14 d。造模后各造模小鼠均出現(xiàn)點頭、撓鼻、煩躁不安等行為，表明造模成功。

2.2 取材 末次OVA滴鼻激發(fā)后24 h，每組隨機選取6只小鼠進行肺功能檢測，隨后所有小鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，摘眼球取血約800 μL，室溫靜置1 h后1200×g離心10 min，留取上清-80 ℃保存。隨后各組小鼠脫頸椎處死，迅速打開胸腔取左上肺葉置于4%多聚甲醛中固定，用于肺組織病理染色；摘取右上肺葉置于液氮中保存，用于蛋白免疫印跡（Western blot）法檢測。

2.3 指標檢測

2.3.1 全身體積描記系統(tǒng)檢測各組小鼠肺功能 通過全身體積描記系統(tǒng)對各組小鼠進行活體呼吸參數(shù)測量。每組取6只小鼠依次放入全體容積描計箱內(nèi)，以濃度為0、3.125、6.250、12.500、25.000 mg/mL的Mch霧化1 min后，測定激發(fā)5 min內(nèi)小鼠支氣管收縮參數(shù)增強呼吸間歇（enhanced pause，Penh），以衡量小鼠氣道高反應性。

2.3.2 ELISA法檢測各組小鼠血清IgE 取每組6只小鼠血清，嚴格按照試劑盒說明書，使用多功能酶標儀于450 nm波長下檢測OD值，并根據(jù)標準曲線計算血清IgE含量。

2.3.3 HE染色觀察各組小鼠肺組織病理 取每組3只小鼠左上肺葉置于4%多聚甲醛中固定24 h，石蠟包埋，沿矢狀面切片，厚度約4 μm，參照試劑盒說明進行HE染色，中性樹脂膠封片后顯微鏡下觀察并拍照。

2.3.4 Western blot法檢測各組小鼠肺組織E-cadherin、N-cadherin、α-SMA蛋白表達水平 取每組6 只小鼠右上肺葉加入預混蛋白酶抑制劑及磷酸酶抑制劑的細胞裂解液，研磨；將組織蛋白置于4 ℃低溫離心機13 500×g離心20 min后取上清，采用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量；加入上樣緩沖液后100 ℃加熱變性5 min；蛋白樣本行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜后加入一抗（E-cadherin、N-cadherin、

α-SMA、β-actin，稀釋比例1∶1000），4 ℃過夜，TBST洗膜3次，每次搖床孵育5 min；加山羊抗兔IgG或山羊抗鼠IgG（稀釋比例1∶5000），室溫搖床孵育1 h，TBST洗膜3次后加入ECL發(fā)光液置于凝膠成像儀，以β-actin為內(nèi)參通過Image J軟件計算目的蛋白相對表達量。

2.3.5 Western blot法檢測各組小鼠肺組織TGF-β1/Smad2/3信號通路相關蛋白表達水平 取2.2.4項下各組6只小鼠肺組織蛋白樣本，行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜后加入一抗（TGF-β、Smad2、Smad3、P-Smad2、P-Smad3、GAPDH，稀釋比例1∶1000），4 ℃過夜，TBST洗膜3次，每次搖床孵育5 min。加山羊抗兔IgG（稀釋比例1∶5000），室溫搖床孵育1 h，TBST洗膜3次后加入ECL發(fā)光液并置于凝膠成像儀中，以GAPDH為內(nèi)參通過Image J軟件計算目的蛋白相對表達量，以P-Smad2/Smad2和P-Smad3/Smad3反映Smad2/3磷酸化激活情況。

2.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)均為計量資料且均符合正態(tài)分布，采用均值±標準差（x-±s）表示，組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

3 實驗結果

3.1 各組小鼠肺功能比較 如表1所示，予3.125、6.250、12.500、25.000 g/L的Mch霧化激發(fā)后，模型組小鼠Penh值顯著高于正常組（P＜0.01），地塞米松組小鼠Penh值明顯低于模型組（P＜0.01）；予25.000 mg/mL Mch霧化激發(fā)后，三子養(yǎng)親湯高劑量組小鼠Penh值明顯低于模型組（P＜0.01）。予不同濃度Mch霧化激發(fā)后，地塞米松對哮喘模型小鼠Penh值的干預作用優(yōu)于三子養(yǎng)親湯各劑量組，部分數(shù)值組間比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01），三子養(yǎng)親湯各劑量組小鼠Penh值組間比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表1 各組小鼠肺功能Penh值比較（±s）

表1 各組小鼠肺功能Penh值比較（±s）

注： 與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01；與地塞米松組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

組別動物數(shù)/只Penh值0 g/L Mch3.125 g/L Mch6.250 g/L Mch 12.500 g/L Mch 25.000 g/L Mch正常組60.58±0.100.88±0.091.37±0.201.69±0.162.30±0.29模型組60.58±0.291.54±0.25**2.48±0.32**2.84±0.26**4.55±0.36**三子養(yǎng)親湯低劑量組60.46±0.191.41±0.252.37±0.15▲▲2.79±0.49▲▲ 3.98±0.65▲▲三子養(yǎng)親湯高劑量組60.53±0.171.20±0.172.05±0.612.60±0.25▲3.57±0.19△△▲地塞米松組60.52±0.141.11±0.28△△1.56±0.08△△2.00±0.32△△ 2.75±0.48△△

3.2 各組小鼠血清IgE水平比較 模型組小鼠血清IgE水平明顯高于正常組（P＜0.01），三子養(yǎng)親湯低劑量組、地塞米松組小鼠血清IgE水平明顯低于模型組（P＜0.05），各給藥組組間比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。詳見表2。

表2 各組小鼠血清IgE水平比較（x-±s）

3.3 各組小鼠肺組織病理表現(xiàn) HE染色結果提示，與正常組比較，模型組小鼠肺組織炎癥水平增加，氣道平滑肌增厚，氣道上皮細胞排列紊亂伴部分上皮細胞脫落，氣道黏液分泌增加。與模型組比較，各給藥組小鼠氣道炎癥水平改善，平滑肌增厚減少，氣道上皮細胞排列有序、脫落減少，其中以三子養(yǎng)親湯高劑量組及地塞米松組改善更為顯著。詳見圖1。

圖1 各組小鼠肺組織病理表現(xiàn)（HE，×200）

3.4 各組小鼠肺組織E-cadherin、N-cadherin、α-SMA蛋白表達水平比較 模型組小鼠肺組織N-cadherin、α-SMA蛋白表達水平顯著高于正常組（P＜0.01），E-cadherin蛋白表達水平顯著低于正常組（P＜0.01）。三子養(yǎng)親湯高劑量組及地塞米松組小鼠肺組織E-cadherin蛋白表達水平顯著高于模型組（P＜0.01），三子養(yǎng)親湯各劑量組小鼠肺組織N-cadherin蛋白表達水平均顯著低于模型組（P＜0.01），各給藥組小鼠肺組織α-SMA蛋白表達水平均顯著低于模型組（P＜0.05，P＜0.01）。其中，三子養(yǎng)親湯高劑量組小鼠肺組織E-cadherin蛋白表達水平明顯高于低劑量組（P＜0.01），三子養(yǎng)親湯高劑量對小鼠肺組織N-cadherin蛋白表達水平的改善，三子養(yǎng)親湯各劑量對α-SMA蛋白表達水平的改善均明顯優(yōu)于地塞米松（P＜0.05，P＜0.01）。詳見表3、圖2。

圖2 各組小鼠肺組織E-cadherin、N-cadherin、α-SMA蛋白電泳圖

表3 各組小鼠肺組織E-cadherin、N-cadherin、α-SMA蛋白相對表達量比較（x-±s）

3.5 各組小鼠肺組織TGF-β1/Smad2/3信號通路相關蛋白表達水平比較 模型組小鼠肺組織TGF-β1、P-Smad2/Smad2、P-Smad3/Smad3 水平均顯著高于正常組（P＜0.01，P＜0.05），三子養(yǎng)親湯各劑量組小鼠上述指標水平均明顯低于模型組（P＜0.05，P＜0.01），而地塞米松則未表現(xiàn)出對上述指標的改善作用（P＞0.05）。三子養(yǎng)親湯低劑量組小鼠肺組織TGF-β1 表達，三子養(yǎng)親湯各劑量組小鼠肺組織P-Smad2/Smad2 水平均明顯低于地塞米松組（P＜0.05，P＜0.01）。詳見表4、圖3。

圖3 各組小鼠肺組織TGF-β1/Smad2/3信號通路蛋白電泳圖

表4 各組小鼠肺組織TGF-β1、P-Smad2/Smad2、P-Smad3/Smad3相對表達量比較（x-±s）

4 討論

哮喘是一種常見的慢性呼吸系統(tǒng)疾病，以慢性氣道炎癥、氣道重塑以及氣道高反應性為主要特征。其中，氣道重塑引起的不可逆氣道阻塞和肺功能惡化是導致哮喘反復發(fā)作的關鍵病理因素[10]。氣道重塑的主要特征是氣道上皮細胞增生及平滑肌肥大、增生和氣道血管重構。研究表明，氣道重塑與上皮間質(zhì)轉化功能障礙密切相關，在氣道上皮屏障的損傷修復過程中，氣道上皮細胞通過TGF-β1介導的信號通路參與了EMT的發(fā)生，通過介導呼吸道基底膜的增厚和細胞基質(zhì)沉積導致氣道壁的纖維化和增厚，從而參與氣道重塑[11]。

哮喘屬中醫(yī)學“哮病”范疇。哮病之所以反復發(fā)作，難以治愈，是由于“內(nèi)有壅塞之氣，外有非時之感，膈有膠固之痰”，三者相合，閉塞氣道，搏擊有聲，發(fā)為哮病。“宿痰伏肺”是哮喘的宿根。哮喘反復發(fā)作，極易損傷氣津，痰液更加黏稠難出，滯塞肺絡，淤積不散，出現(xiàn)頑痰膠固，致肺管狹窄，使無形之氣不能宣降，氣道狹窄，致津、血運行受礙。這種痰氣交阻的病理特征使病情遷延，纏綿難愈，與現(xiàn)代醫(yī)學關于哮喘氣道重塑細胞外基質(zhì)沉積、支氣管平滑肌增生、血管通透性增加、黏膜瘀血水腫、炎性分泌物增多，結果導致氣道狹窄、缺血缺氧，嚴重影響氣道通氣功能的認識是一致的[12]。

三子養(yǎng)親湯方中白芥子溫肺豁痰、利氣平喘；紫蘇子止咳平喘，萊菔子消食除脹，兩者均為降氣化痰之要藥。三藥合用，使肺氣宣降，咳喘得平，氣順則痰消。本研究以OVA誘導哮喘小鼠模型，結果顯示造模后小鼠出現(xiàn)點頭、撓鼻、煩躁不安等表現(xiàn)，氣道炎性細胞浸潤，氣道平滑肌增厚，氣道黏液分泌增加，氣道上皮細胞排列紊亂，部分氣道上皮細胞脫落，血清IgE及肺功能Penh值水平顯著增加，且EMT相關蛋白檢測結果提示上皮連接表型蛋白E-cadherin在肺組織中的表達量顯著降低，而間充質(zhì)表型相關蛋白N-cadherin、α-SMA蛋白表達水平顯著增高，提示OVA誘導的哮喘小鼠模型構建成功，模型小鼠具有氣道EMT的病理表現(xiàn)。本研究結果表明，經(jīng)三子養(yǎng)親湯干預后，哮喘模型小鼠肺組織上皮細胞排列恢復整齊，氣道上皮細胞脫落減少，同時EMT相關蛋白的表達回調(diào)，提示三子養(yǎng)親湯可以保護哮喘模型小鼠上皮屏障，阻止哮喘氣道EMT的發(fā)生與發(fā)展。與文獻報道[2]相一致的是，本次研究同樣發(fā)現(xiàn)三子養(yǎng)親湯對于哮喘模型小鼠氣道EMT相關蛋白的回調(diào)作用優(yōu)于地塞米松。

TGF-β1是一種多效性細胞因子，參與細胞成熟分化、胚胎發(fā)育、炎癥、免疫調(diào)節(jié)、傷口愈合、組織重塑修復等眾多關鍵過程，而在哮喘的病理過程中，TGF-β1主要參與氣道炎癥反應和纖維化組織重塑，表現(xiàn)為免疫反應的增強和支氣管壁不同層的支氣管重構，包括氣道EMT改變[13-14]。研究發(fā)現(xiàn)，哮喘患者肺活檢組織及支氣管肺泡灌洗液中TGF-β1水平升高，且TGF-β1的升高與氣道厚度密切相關[15-16]。TGF-β1通過多種不同的信號通路發(fā)揮作用，包括Smad依賴性、非Smad依賴性和β-連環(huán)蛋白信號通路。Smad依賴性信號通路是TGF-β1的典型信號通路，TGF-β1通過與TGF-β1 Ⅱ型受體（TβRⅡ）結合，進而磷酸化TGF-β1 Ⅰ型受體（TβRⅠ），通過TβRⅠ活化進一步磷酸化激活Smad信號因子。Smad2/3 被認為是TGF-β1信號促氣道EMT和組織纖維化中的關鍵調(diào)節(jié)因子[17]。WNUK D等[18]研究發(fā)現(xiàn)，與健康供體相比，哮喘患者的成纖維細胞中TGF-β1誘導的促纖維化Smad2/3 信號通路的激活增強，對抗纖維化Smad1/5/9 信號通路的激活明顯減弱。本研究探究了三子養(yǎng)親湯對TGF-β1及下游經(jīng)典信號通路Smad2/3的調(diào)控作用，發(fā)現(xiàn)三子養(yǎng)親湯可以抑制OVA誘導的哮喘模型小鼠肺組織Smad2/3 信號通路的磷酸化激活與TGF-β1表達，而地塞米松對哮喘小鼠肺組織TGF-β1/Smad2/3 信號通路的調(diào)控作用明顯低于三子養(yǎng)親湯，進一步提示了三子養(yǎng)親湯可能通過干預TGF-β1/Smad2/3 信號通路抑制哮喘氣道EMT的發(fā)生。同時，本研究發(fā)現(xiàn)三子養(yǎng)親湯對上述指標的干預作用并未表現(xiàn)出明顯的劑量依賴性，分析可能與實驗小鼠的個體變異性以及藥物濃度梯度不足相關，在接下來的研究中可通過提高樣本量及增加中藥濃度梯度的方式進一步提高三子養(yǎng)親湯治療哮喘相關研究的科學性及嚴謹性。

綜上，本研究結果表明三子養(yǎng)親湯可抑制哮喘小鼠的氣道EMT改變，其調(diào)控機制可能與下調(diào)TGF-β1表達，抑制Smad2/3信號通路激活有關?！罢{(diào)氣”與“化痰”均為三子養(yǎng)親湯治療哮喘的重要治則治法，本課題組在接下來的研究中將通過拆方及單味藥研究、轉錄組學等方式進一步探究“調(diào)氣”與“化痰”的相關性及其分子內(nèi)涵。