燕霞鳳，侯召勤，張翠芬，馬燕飛，王建軍,*

（1.東營(yíng)市人民醫(yī)院科教科，山東 東營(yíng) 257000；2.深圳大學(xué) 呼吸疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室深圳大學(xué)變態(tài)反應(yīng)分室，廣東 深圳 518060）

苯并芘（benzo(a)pyrene，BaP）是化石燃料、煙草等不完全燃燒產(chǎn)生的揮發(fā)性化合物，是主要的大氣污染物之一[1]，其也是肺癌、皮膚癌和肌肉減少癥等多種疾病的誘因之一[2-4]。由于BaP主要存在于空氣中，因此其最主要的危害是誘發(fā)呼吸道疾病。研究表明，BaP暴露會(huì)誘發(fā)呼吸道細(xì)胞氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)，進(jìn)而造成呼吸道損傷[5]，而呼吸道內(nèi)皮細(xì)胞在誘發(fā)、調(diào)控哮喘疾病過程中有重要的作用[6]。

山楂不僅是中藥，還是不可多得的保健食品，具有消食化滯、活血化瘀、降血脂、降血壓等功效[7]。山楂中富含黃酮、三萜、有機(jī)酸類等化合物[8]。其中，山楂總黃酮為山楂中重要的活性成分，具有多種藥理活性[9-10]，能夠降血脂、改善冠脈血流量及機(jī)體微循環(huán)狀態(tài)等[10]。研究發(fā)現(xiàn)，山楂富含活性酚類化合物，具有良好的抗氧化、抑菌、抗炎能力[11-12]，對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞損傷也有一定的保護(hù)作用[13]。Deng Jie等[14]發(fā)現(xiàn)，富含酚類化合物的山楂提取物具有抑制BaP遺傳毒性的作用；同樣地，Shin等[15]的研究表明，山楂的提取物具有預(yù)防過敏性氣道炎癥的功能，是過敏性哮喘的潛在治療藥物。但目前關(guān)于山楂對(duì)呼吸道的保護(hù)功能研究較少，同時(shí)這種保護(hù)作用是否與山楂多酚有關(guān)尚不明確。

本實(shí)驗(yàn)在研究BaP暴露損傷呼吸道上皮細(xì)胞潛在機(jī)制的同時(shí)，研究山楂活性酚類化合物對(duì)呼吸道上皮細(xì)胞的保護(hù)活性及潛在分子機(jī)制，以期為環(huán)境污染物暴露導(dǎo)致的哮喘的預(yù)防、治療提供一定的借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

BaP 阿拉丁試劑（上海）有限公司；人支氣管上皮（16HBE）細(xì)胞 中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、胎牛血清和青霉素-鏈霉素混合液、DMEM培養(yǎng)基、BCA蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)研究所；芳香烴受體（aryl hydrocarbon receptor，AhR）、細(xì)胞色素p450家族1亞家族A成員1（cytochrome P450 family 1 subfamily A member 1，CYP1A1）、p-p65、p-IκBα、p-IKKα/β和β-actin的一抗抗體、山羊抗兔二抗和山羊抗鼠二抗 美國(guó)CST公司。

1.2 儀器與設(shè)備

R2487高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀 美國(guó)Waters公司；3-30K高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)、2K15型低溫高速離心機(jī) 美國(guó)Sigma公司；INCO2108型CO2培養(yǎng)箱 德國(guó)Memmert公司；液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC/MS）儀 美國(guó)Agilent Technologies公司；SW-CJ-IC型超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；Ultra-Turrax?高性能分散機(jī) 德國(guó)IKA集團(tuán)；Epics Altra型流式細(xì)胞儀 美國(guó)Beckman公司。

1.3 方法

1.3.1 山楂活性多酚分離、鑒定

新鮮山楂5 kg，粉碎并與10 kg水混合，超聲提取3 次（功率1 000 W、溫度10 ℃），每次1 h，過濾，合并提取液，減壓濃縮（溫度100 ℃、平均速率60 r/min）得浸膏798.4 g，向浸膏中加入3 kg水，依次用氯仿、乙酸乙酯萃取，回收溶劑后得氯仿萃取物（100.4 g）、乙酸乙酯萃取物（112.5 g）及水層物。基于構(gòu)建的BaP暴露16HBE細(xì)胞模型，評(píng)價(jià)氯仿萃取物、乙酸乙酯萃取物及水層萃取物的細(xì)胞保護(hù)活性，將活性最佳部分收集并繼續(xù)分離活性化合物。

將乙酸乙酯萃取物（100 g）經(jīng)硅膠柱色譜（1 kg，200～300 目）分離，以氯仿-甲醇梯度洗脫（體積比100∶10→10∶100），經(jīng)薄層色譜法（thin-layer chromatography，TLC）檢測(cè)后合并得到10 個(gè)組分（組分A～J）?；跇?gòu)建的BaP暴露16HBE細(xì)胞模型，評(píng)價(jià)這10 個(gè)組分的細(xì)胞保護(hù)活性，將活性最佳部分收集并繼續(xù)分離活性化合物。組分D經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜分離，得到化合物1（HBP-1，221 mg）、化合物2（HBP-2，324 mg）和化合物3（HBP-3，228 mg）；組分E經(jīng)硅膠（300 g，300～400 目）柱色譜分離，以氯仿-甲醇梯度洗脫（體積比60∶40→10∶90），得到化合物4（HBP-4，114 mg）、化合物5（HBP-5，134 mg）和化合物6（HBP-6，158 mg）；組分F經(jīng)反相十八烷基硅烷鍵合硅膠填料（octadecylsilyl，ODS）柱色譜分離，以甲醇-水（體積比60∶40）洗脫，得到化合物7（HBP-7，192 mg）、化合物8（HBP-8，143 mg）、化合物9（HBP-9，133 mg）和化合物10（HBP-10，215 mg）。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞活力檢測(cè)

100 μL/孔的16HBE細(xì)胞（1×105個(gè)/mL）接種于96 孔板中，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜?？瞻捉M細(xì)胞不做任何處理，BaP組細(xì)胞培養(yǎng)基中分別加入終濃度為1、10、50、250、500、1 250 μmol/L的BaP培養(yǎng)24 h，或培養(yǎng)基中加入BaP（終濃度為10 μmol/L）分別培養(yǎng)12、24、48、72 h。使用CCK-8試劑盒檢測(cè)16HBE細(xì)胞活力[16]。

100 μL/孔的16HBE細(xì)胞（1×105個(gè)/mL）接種于96 孔板中，培養(yǎng)過夜?？瞻讓?duì)照組細(xì)胞不做任何處理，第2～12組細(xì)胞培養(yǎng)基中加入終濃度為10 μmol/L的BaP培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，冷磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗2 次，第2組（BaP組）加入新的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h；第3～12組細(xì)胞清洗后，分別加入含有25 μmol/L的HBP-1～10或白藜蘆醇的新鮮培養(yǎng)基并繼續(xù)培養(yǎng)24 h。采用CCK-8試劑盒檢測(cè)16HBE細(xì)胞活力。

參考文獻(xiàn)[17]方法，采用噻唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法檢測(cè)化合物HBP-1～10的細(xì)胞毒性。

1.3.3 16HBE細(xì)胞炎癥因子及細(xì)胞內(nèi)活性氧水平測(cè)定

100 μL/孔的16HBE細(xì)胞（1×105個(gè)/mL）接種于96 孔板中，培養(yǎng)過夜?？瞻讓?duì)照組細(xì)胞不做任何處理，第2～4組細(xì)胞培養(yǎng)基中加入終濃度為10 μmol/L的BaP培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，冷PBS清洗2 次，第2組（BaP組）加入新的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h；第3、4組細(xì)胞清洗后，分別加入含有5、50 μmol/L的HBP-1新鮮培養(yǎng)基并繼續(xù)培養(yǎng)24 h。之后1 400 r/min離心5 min，收集上清液及細(xì)胞。參照腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-18、IL-10、IL-6及ROS酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒說明書進(jìn)行細(xì)胞上清液中炎癥因子及細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平檢測(cè)。

1.3.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

100 μL/孔的16HBE細(xì)胞（1×105個(gè)/mL）接種于96 孔板中，培養(yǎng)過夜?？瞻讓?duì)照組細(xì)胞不做任何處理，第2～4組細(xì)胞培養(yǎng)基中加入終濃度為10 μmol/L的BaP培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，冷PBS清洗2 次，第2組（BaP組）加入新的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h；第3、4組細(xì)胞清洗后，分別加入含有10、50 μmol/L HBP-1的新鮮培養(yǎng)基并繼續(xù)培養(yǎng)24 h。收集細(xì)胞，PBS清洗2 遍，根據(jù)Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說明書操作，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)16HBE細(xì)胞凋亡情況。

1.3.5 Western blotting檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)

將16HBE細(xì)胞密度調(diào)整為3×105個(gè)/mL，3 mL/孔接種于6 孔板中，參照1.3.4節(jié)方法分組處理，收集細(xì)胞，加入適量RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，參考文獻(xiàn)[18]的方法采用Western blotting檢測(cè)核因子（nuclear factor，NF）-κB信號(hào)通路、細(xì)胞AhR信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

HBPs的化學(xué)結(jié)構(gòu)圖采用ChemDraw軟件繪制。采用SPSS 18軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)方法檢驗(yàn)。P＜0.05表示具有顯著差異，P＜0.01表示具有極顯著差異，實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，n＝3。

2 結(jié)果與分析

2.1 HBPs的分離鑒定

基于活性追蹤方法，本研究分離獲得山楂活性酚類化合物HBP-1～10，并鑒定其結(jié)構(gòu)（圖1）。

圖1 化合物HBP-1～10的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of HBP-1 through 10

H B P-1：黃色油狀物，高分辨電噴霧電離質(zhì)譜（high resolution electrospray ionization mass s p e c t r o s c o p y，H R-E S I-M S）顯示準(zhǔn)分子離子峰m/z341.172 9 [M＋Na]＋（C19H26O4Na，理論計(jì)算值：341.172 3），確定分子式為C19H26O4。其1H NMR、13C NMR數(shù)據(jù)見表1。

表1 HBP-1、3、4、5、6的1H NMR、13C NMR數(shù)據(jù)Table 1 1H NMR and 13C NMR data of HBP-1, 3, 4, 5 and 6

HBP-2：黃色油狀物，HR-ESI-MS顯示準(zhǔn)分子離子峰m/z319.190 4 [M＋H]＋（C19H27O4，理論計(jì)算值：319.190 4），確定分子式為C19H26O4，不飽和度為6。其1H NMR、13C NMR數(shù)據(jù)見表2。

表2 HBP-2、7、8、9、10的1H NMR、13C NMR數(shù)據(jù)Table 2 1H NMR and 13C NMR data of HBP-2, 7, 8, 9 and 10

HBP-3：黃色油狀物，HR-ESI-MS顯示準(zhǔn)分子離子峰m/z319.190 4 [M＋H]＋（C19H27O4，理論計(jì)算值：319.190 4），確定分子式為C19H26O4，不飽和度為7。其1H NMR、13C NMR數(shù)據(jù)見表1。

HBP-4：淡黃色油狀物，HR-ESI-MS顯示準(zhǔn)分子離子峰m/z357.167 6 [M＋Na]＋（C19H26O5Na，理論計(jì)算值：357.167 2），確定分子式為C19H26O5，不飽和度為7。其1H NMR、13C NMR數(shù)據(jù)見表1。

HBP-5：淡黃色油狀物，HR-ESI-MS顯示準(zhǔn)分子離子峰m/z357.167 8 [M＋Na]＋（C19H26O5Na，理論計(jì)算值：357.167 2），確定分子式為C19H26O5，不飽和度為7。其1H NMR、13C NMR數(shù)據(jù)見表1。

HBP-6：黃色油狀物，HR-ESI-MS顯示準(zhǔn)分子離子峰m/z335.185 5 [M＋H]＋（C19H27O5，理論計(jì)算值：335.185 3），確定分子式為C19H26O5，不飽和度為7。其1H NMR、13C NMR數(shù)據(jù)見表1。

HBP-7：黃色油狀物，HR-ESI-MS顯示準(zhǔn)分子離子峰m/z373.198 5 [M＋Na]＋（C20H30O5Na，理論計(jì)算值：373.198 5），確定分子式為C20H30O5，不飽和度為7。其1H NMR、13C NMR數(shù)據(jù)見表2。

HBP-8：黃色油狀物，HR-ESI-MS顯示準(zhǔn)分子離子峰m/z335.186 2 [M＋H]＋（C19H27O5，理論計(jì)算值：335.185 3），確定分子式為C19H26O5，不飽和度為7。其1H NMR、13C NMR數(shù)據(jù)見表2。

HBP-9：白色粉末，HR-ESI-MS顯示準(zhǔn)分子離子峰m/z251.128 1 [M＋H]＋（C14H19O4，理論計(jì)算值：251.127 8），確定其分子式為C14H18O4，分子量為250，不飽和度為6。其1H NMR、13C NMR數(shù)據(jù)見表2。

HBP-10：黃色油狀物，HR-ESI-MS顯示準(zhǔn)分子離子峰m/z357.167 3 [M＋Na]＋（C19H26O5Na，理論計(jì)算值：357.167 2），確定分子式為C19H26O5，不飽和度為7。其1H NMR、13C NMR數(shù)據(jù)見表2。

2.2 HBP-1～10的細(xì)胞保護(hù)活性

采用基于BaP暴露的16HBE細(xì)胞模型及CCK8法檢測(cè)BaP對(duì)16HBE細(xì)胞的損傷情況，結(jié)果如圖2A、B所示。BaP暴露使16HBE細(xì)胞活力降低，其中，10 μmol/L的BaP暴露24 h后16HBE細(xì)胞活力降低11.6%（P＜0.01），說明BaP暴露使16HBE細(xì)胞受到嚴(yán)重?fù)p傷。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，BaP對(duì)16HBE細(xì)胞活力的影響還具有一定的濃度及時(shí)間依賴性。

圖2 HBP-1～10的細(xì)胞保護(hù)活性Fig.2 Cytoprotective activity of HBP-1 through 10

此外，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測(cè)了HBP-1～10抗BaP損傷16HBE細(xì)胞的保護(hù)活性（圖2C）。與Control組相比，BaP組16HBE細(xì)胞活力降低12.2%（P＜0.01），說明BaP暴露損傷16HBE細(xì)胞進(jìn)而使細(xì)胞活力下降。而HBP-1～10對(duì)16HBE細(xì)胞具有保護(hù)作用；相比于BaP組，白藜蘆醇組的細(xì)胞活力略高，但不具備顯著性差異，而HBP-1、HBP-5及HBP-10組細(xì)胞活力分別提高11.5 個(gè)百分點(diǎn)（P＜0.01）、10.3 個(gè)百分點(diǎn)（P＜0.05）及10.1 個(gè)百分點(diǎn)（P＜0.05），且其細(xì)胞保護(hù)活性均超過白藜蘆醇。其中，HBP-1的細(xì)胞保護(hù)活性最佳，因此，接下來的實(shí)驗(yàn)以HBP-1為代表深入研究山楂活性酚類化合物發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)活性的潛在機(jī)制。

采用MTT法檢測(cè)化合物HBP-1～10對(duì)于16HBE細(xì)胞的毒性，結(jié)果顯示化合物HBP-1～10在濃度低于1.2 mmol/L（48 h）時(shí)未損傷16HBE細(xì)胞。

2.3 HBP-1對(duì)BaP誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞炎癥因子及ROS水平的影響

如圖3A～E所示，BaP暴露能夠極顯著誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞炎癥因子（TNF-α、IL-1β、IL-18、IL-10、IL-6）分泌。相比于Control組，BaP組TNF-α、IL-1β、IL-18、IL-10、IL-6分泌分別增加809%（P＜0.01）、444%（P＜0.01）、1 145%（P＜0.01）、783%（P＜0.01）及849%（P＜0.01）。結(jié)合CCK8細(xì)胞活力的檢測(cè)結(jié)果（圖2C），推測(cè)BaP暴露誘發(fā)16HBE細(xì)胞炎癥因子過量分泌，使細(xì)胞受到嚴(yán)重炎性損傷。而相比于BaP組，HBP-1處理后16HBE細(xì)胞炎癥因子分泌減少；相比于BaP組，50 μmol/L HBP-1處理后，TNF-α、IL-1β、IL-18質(zhì)量濃度分別減少59.9%（P＜0.01）、65.9%（P＜0.01）及67.4%（P＜0.01）。說明HBP-1能夠有效抑制BaP誘導(dǎo)的16HBE細(xì)胞炎癥因子過量分泌，緩解BaP誘導(dǎo)的16HBE細(xì)胞炎性損傷。

圖3 HBP-1對(duì)16HBE細(xì)胞炎癥因子及ROS水平的影響Fig.3 Effect of HBP-1 on inflammatory factors and ROS levels in 16HBE cells

本研究進(jìn)一步分析了BaP暴露對(duì)16HBE細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響，結(jié)果如圖3F所示，BaP暴露使16HBE細(xì)胞內(nèi)ROS水平極顯著升高。相比于Control組，BaP組細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高212%（P＜0.01），推測(cè)BaP暴露誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞受到嚴(yán)重氧化損傷。而相比于BaP組，HBP-1處理后16HBE細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著降低；相比于BaP組，經(jīng)過50 μmol/L HBP-1處理后，16HBE細(xì)胞內(nèi)ROS水平降低51.7%（P＜0.01）。說明，HBP-1能夠有效抑制BaP誘導(dǎo)的16HBE細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高及細(xì)胞氧化損傷。

2.4 HBP-1對(duì)BaP誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞凋亡的影響

本實(shí)驗(yàn)通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)BaP暴露對(duì)16HBE細(xì)胞凋亡的影響。相比于Control組，BaP暴露使16HBE細(xì)胞凋亡率增加20.7 個(gè)百分點(diǎn)（P＜0.01）；而經(jīng)HBP-1處理后，16HBE細(xì)胞凋亡率顯著減少，相比于BaP組，10、50 μmol/L HBP-1處理后16HBE細(xì)胞凋亡率分別減少12.8 個(gè)百分點(diǎn)（P＜0.05）及16.4 個(gè)百分點(diǎn)（P＜0.01）（圖4）。

圖4 HBP-1對(duì)BaP誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞凋亡的影響Fig.4 Effect of HBP-1 on BaP-induced apoptosis in 16HBE cells

2.5 HBP-1對(duì)BaP誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路的影響

NF-κB信號(hào)通路在細(xì)胞炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)中具有重要的作用[19]，因此，靶向NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)是開發(fā)抗炎藥物的重要方法[20-21]。為了研究NF-κB信號(hào)通路在HBP-1對(duì)BaP誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)中的作用，本研究檢測(cè)了BaP誘導(dǎo)的16HBE細(xì)胞中NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。如圖5所示，HBP-1能夠顯著抑制BaP誘導(dǎo)的16HBE細(xì)胞p65、IKKα/β和IκBα蛋白的磷酸化，進(jìn)而抑制BaP誘導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路激活。

圖5 HBP-1對(duì)BaP誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effect of HBP-1 on NF-κB signaling pathway-related protein expression in BaP-induced 16HBE cells

2.6 HBP-1對(duì)BaP誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞AhR信號(hào)通路的影響

BaP是細(xì)胞AhR的配體，細(xì)胞BaP暴露后能活化AhR，進(jìn)而促進(jìn)CYP1A1基因表達(dá)，代謝BaP產(chǎn)生有毒中間產(chǎn)物，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)BaP可以導(dǎo)致炎癥和氧化應(yīng)激，且經(jīng)由AhR信息路徑傳遞[22-23]。因此，本研究檢測(cè)了HBP-1對(duì)AhR信號(hào)通路中AhR和CYP1A1蛋白表達(dá)的影響。如圖6所示，BaP暴露誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞中AhR和CYP1A1蛋白表達(dá)極顯著升高。而經(jīng)HBP-1處理后，BaP暴露誘導(dǎo)的16HBE細(xì)胞AhR和CYP1A1蛋白表達(dá)升高被抑制。Western blot結(jié)果表明AhR和CYP1A1信號(hào)分子對(duì)HBP-1抑制BaP誘導(dǎo)的16HBE細(xì)胞損傷發(fā)揮重要作用。

圖6 HBP-1對(duì)BaP誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞AhR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.6 Effect of HBP-1 on AhR signaling pathway-related protein expression in BaP-induced 16HBE cells

3 討 論

隨著化石燃料的不斷使用，BaP在大氣中的含量逐年升高，給人們的身體健康帶來了極大的危害。BaP的長(zhǎng)時(shí)間暴露會(huì)誘發(fā)呼吸道炎癥并進(jìn)一步誘發(fā)呼吸系統(tǒng)疾病，如哮喘、肺部位炎癥等[24-25]。研究表明，山楂多酚對(duì)哮喘引起的呼吸道上皮細(xì)胞損傷有一定的抗炎、抗氧化活性[12-13]。本研究通過活性追蹤分離方法從山楂中分離出10 種具有細(xì)胞保護(hù)活性的酚類化合物（HBP-1～10）。本研究結(jié)果證實(shí)多環(huán)芳烴（BaP）暴露會(huì)誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激和炎癥；同時(shí)，山楂酚類化合物能夠抑制BaP誘導(dǎo)的支氣管上皮細(xì)胞炎癥和氧化應(yīng)激。此外，本研究還檢測(cè)了AhR和NF-κB信號(hào)通路在介導(dǎo)山楂酚類化合物細(xì)胞保護(hù)活性中的作用。

炎癥是一種針對(duì)外源物入侵的先天免疫反應(yīng)，在炎癥過程中，巨噬細(xì)胞被激活，并產(chǎn)生炎癥介質(zhì)來抵御入侵的外源物（如病原體）[26-27]。本研究中，BaP暴露顯著誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞炎癥因子（IL-1β、IL-6、IL-10、IL-18和TNF-α）過度釋放，說明BaP暴露誘導(dǎo)了16HBE細(xì)胞炎癥反應(yīng)。而HBP-1對(duì)炎癥因子（IL-1β、IL-18和TNF-α）的過度分泌有顯著的抑制作用，表明HBP-1可通過調(diào)節(jié)炎癥因子的分泌來發(fā)揮抗炎活性。

自由基的過度產(chǎn)生會(huì)擾亂細(xì)胞能量代謝平衡，誘發(fā)氧化應(yīng)激，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)DNA、蛋白質(zhì)損傷[28-29]，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而ROS是導(dǎo)致細(xì)胞氧化損傷和炎癥的重要介質(zhì)[30]。本研究中，BaP暴露顯著誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞ROS的過量生成，而其在HBP-1干預(yù)后被顯著抑制。推測(cè)BaP暴露誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生大量ROS，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞DNA和蛋白質(zhì)等遺傳、功能性分子氧化損傷，從而導(dǎo)致炎癥因子的過度產(chǎn)生，HBP-1干預(yù)后BaP暴露誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和炎癥損傷得以逆轉(zhuǎn)。

細(xì)胞凋亡對(duì)細(xì)胞的功能和生存至關(guān)重要[31]，在本研究中，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HBP-1對(duì)BaP誘導(dǎo)的16HBE細(xì)胞凋亡的抑制作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HBP-1可抑制BaP誘導(dǎo)的16HBE細(xì)胞凋亡。呼吸道內(nèi)皮細(xì)胞在維持呼吸道環(huán)境穩(wěn)態(tài)中具有重要的作用，而炎癥的暴發(fā)往往會(huì)導(dǎo)致呼吸道內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙[32]。高濃度炎癥因子（如IL-1β、IL-18等）會(huì)誘發(fā)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致炎癥性疾病[33]。結(jié)合HBP-1可抑制BaP誘導(dǎo)的16HBE細(xì)胞炎癥因子過度分泌，說明HBP-1可通過抑制BaP暴露誘導(dǎo)的炎癥及16HBE細(xì)胞凋亡發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)活性。

體外實(shí)驗(yàn)表明，多環(huán)芳烴污染物可通過激活NF-κB信號(hào)通路誘導(dǎo)呼吸道上皮細(xì)胞炎癥因子表達(dá)增加，進(jìn)而誘導(dǎo)生成ROS中間體，并進(jìn)一步激活NF-κB信號(hào)通路。同時(shí)，有研究報(bào)道，NF-κB信號(hào)通路的激活與炎癥的發(fā)展及炎癥因子（IL-10、IL-18等）分泌有密切關(guān)系[12]。本研究中，BaP暴露使NF-κB信號(hào)通路蛋白磷酸化極顯著增加，說明BaP暴露激活了NF-κB信號(hào)通路。而經(jīng)HBP-1處理后，BaP暴露誘導(dǎo)的16HBE細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路蛋白磷酸化被顯著抑制。推測(cè)HBP-1可抑制BaP暴露誘導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路激活，進(jìn)而抑制炎癥因子過量分泌，發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)活性。

AhR是一種核轉(zhuǎn)錄因子，可被外源性及內(nèi)源性配體激活。其中，AhR外源性配體中最為常見的是一些環(huán)境毒物，如2,3,7,8-四氯二苯并二噁英、BaP等[34]。AhR通過與配體結(jié)合被激活而發(fā)生核易位，并通過經(jīng)典信號(hào)傳導(dǎo)途徑誘導(dǎo)表達(dá)可代謝多種化學(xué)異物或藥物的代謝酶，如CYP1A1、CYP1A2和CYP1B1等[13]。目前多以CYP1A1基因表達(dá)上調(diào)與否來判斷AhR是否被配體激活。BaP激活A(yù)hR后引起CYP1A1基因表達(dá)上調(diào)高達(dá)幾百倍，進(jìn)而引起后續(xù)的代謝激活。本研究中，BaP暴露激活16HBE細(xì)胞中AhR信號(hào)通路，而HBP-1處理抑制了BaP暴露誘導(dǎo)的16HBE細(xì)胞AhR信號(hào)通路激活，說明AhR信號(hào)通路在HBP-1抑制BaP誘導(dǎo)的16HBE細(xì)胞損傷時(shí)同樣具有重要作用。

4 結(jié) 論

抑制呼吸道上皮細(xì)胞炎癥對(duì)哮喘的治療具有重要的意義，本研究發(fā)現(xiàn)山楂酚類化合物可抑制BaP誘導(dǎo)的16HBE細(xì)胞氧化應(yīng)激、AhR及NF-κB信號(hào)通路激活、細(xì)胞凋亡及炎癥因子（TNF-α、IL-1β、IL-18）等炎癥因子過表達(dá)，從而抑制呼吸道上皮細(xì)胞炎癥。本研究為山楂活性酚類化合物應(yīng)用于緩解、治療BaP暴露導(dǎo)致的呼吸道上皮細(xì)胞損傷等相關(guān)疾病提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。