祁業(yè)輝 黃 飛 杜心怡 劉桂芹 王長法 周苗苗

(聊城大學農學與農業(yè)工程學院,聊城 252000)

乳腺以血液中的氨基酸為前體物質來合成乳蛋白。然而,乳腺對一些必需氨基酸的攝取量低于乳中的排出量,乳腺攝取的游離氨基酸并不能完全滿足乳蛋白合成的需要[1]。為了彌補游離氨基酸的不足,乳腺必須攝取肽結合形式的氨基酸。反芻動物乳蛋白的合成過程中,多肽及小肽的作用已引起重視。研究表明,奶牛乳腺可以攝取血液中的肽結合氨基酸,乳腺酪蛋白合成所需蛋氨酸(Met)的8%～18%來源于血液中的小肽[1-2]。奶牛飼養(yǎng)試驗發(fā)現(xiàn),飼糧中添加小肽可顯著增加奶牛乳汁中乳蛋白含量[3-4]。奶牛乳腺上皮細胞(bovine mammary gland epithelial cells,BMECs)體外培養(yǎng)研究發(fā)現(xiàn),許多必需氨基酸組成的小肽均顯著提高了BMECs中酪蛋白基因表達或培養(yǎng)液中酪蛋白濃度[5-9]。已有研究證實BMECs中有小肽轉運載體2(oligopeptide transporter 2,PepT2)蛋白的表達,小肽轉運載體在乳腺小肽吸收利用過程中發(fā)揮重要作用[10-11]。然而,乳腺上皮細胞屬于極性細胞,其物質的吸收和乳汁的分泌具有方向性,即:從基底膜側(血液)攝取營養(yǎng)底物,而從頂膜側(腺泡)分泌乳汁顆粒。目前,相關研究所用BMECs的培養(yǎng)方式均為貼壁培養(yǎng)[5-9],不能保證細胞的極性狀態(tài),破壞了物質吸收和乳汁分泌的方向性,不能完全代表奶牛乳腺的正常生理狀態(tài)。小肽轉運載體是否在乳腺從血液(基底膜側)攝取小肽過程中發(fā)揮作用需要進一步的研究。

Transwell小室,即穿透小室,可用于生物屏障的建立、細胞共培養(yǎng)、細胞趨化、細胞遷移和細胞侵襲等多方面的研究[12-13]。Transwell小室可放入培養(yǎng)板中,小室內稱上室,培養(yǎng)板內稱下室,上室內盛裝上層培養(yǎng)液,下室內盛裝下層培養(yǎng)液,上、下層培養(yǎng)液以聚碳酸酯膜相隔。細胞種在上室內,由于聚碳酸酯膜有通透性,下層培養(yǎng)液中的成分可以影響到上室內的細胞,從而可以研究下層培養(yǎng)液中的成分對細胞生長、運動等的影響。Lin等[14]利用Transwell小室培養(yǎng)的Caco-2細胞層研究了具有降壓功能的大豆蛋白源三肽[亮氨酸-絲氨酸-色氨酸(Leu-Ser-Trp,LSW)]的轉運機理,結果顯示,LSW從頂膜側到基底膜側的轉運明顯高于相反方向,且完整LSW主要通過細胞旁路和小肽轉運載體1(oligopeptide transporter 1,PepT1)介導的主動轉運進行跨膜轉運。Lacroix等[15]以Transwell小室培養(yǎng)的Caco-2細胞層為模型,研究了5種乳源肽的轉運形式和生物活性,結果發(fā)現(xiàn)絕大部分乳源肽在跨膜轉運過程中被肽酶水解而喪失生物活性。細胞培養(yǎng)結合Transwell小室被廣泛應用于營養(yǎng)物質或藥物轉運研究。因此,本試驗將BMECs結合Transwell小室進行極化培養(yǎng),研究BMECs對Transwell上室和下室培養(yǎng)液中蛋氨酸二肽(Met-Met)的攝取和利用機制。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

將BMECs培養(yǎng)在Transwell小室(Corning,美國)中,待培養(yǎng)的BMECs形成細胞層后,以不添加Met-Met作為對照,分別在上室和下室培養(yǎng)液中添加0.5 mmol/L的Met-Met進行試驗。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,收集BMECs,采用Western blot檢測β-酪蛋白(β-casein)、PepT2蛋白的相對表達量以及哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)、核糖體蛋白S6激酶1(ribosomal protein S6 kinase 1,S6K1)和蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)的磷酸化水平。每個試驗重復3次。

1.2 BMECs的Transwell小室培養(yǎng)

選取3頭泌乳中后期的中國荷斯坦奶牛,于屠宰場宰殺后取乳腺腺泡組織,清洗并剪碎至1 mm3大小。參照Zhou等[6]的方法分離純化BMECs。調整BMECs濃度為1×105個/mL后,將細胞接種在12孔Tranwell小室中,分別在上室和下室中添加0.5和1.5 mL含有10%胎牛血清的DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)-F12培養(yǎng)液(Gibco,美國)(添加1%谷氨酰胺、100 IU/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素、5 μg/mL胰島素、1 μg/mL氫化可的松)。然后將細胞置于37 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱進行培養(yǎng),每2 d換1次培養(yǎng)液。待Transwell小室中培養(yǎng)的BMECs形成細胞層后進行后續(xù)試驗。

1.3 細胞層跨膜電阻(trans-epithelial electrical resistance,TEER)測定

通過測定細胞層TEER來檢測BMECs細胞層的緊密性。TEER用電阻儀(WPI EVOM,美國)測定,在使用前,其2個電極先用75%酒精浸泡5 min消毒,再用D-Hanks沖洗電極,洗去酒精。從細胞接種到Transwell濾網上第1天開始,以未接種細胞的Transwell小室為空白對照,每天同一時間用電阻儀測3個孔的細胞層TEER并記錄,連續(xù)測10 d。

細胞層TEER(Ω·cm2)=(TEER細胞-TEER對照)/
有效膜面積(1.12 cm2)。

1.4 Western blot

以磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)為內參,檢測β-酪蛋白、PepT2蛋白以及mTOR1、S6k1和AKT蛋白及磷酸化蛋白的相對表達量。試驗結束后,收集BMECs,棄去細胞培養(yǎng)液,用含有完全蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖液裂解收集的細胞。然后將樣品100 ℃煮沸10 min,16 000×g離心1 min,提取細胞中總蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)及Western blot操作。最后將膜在吸水紙上瀝干,置于平板上,放入化學發(fā)光成像儀中,拍照記錄并分析。試驗所用抗體分別進行稀釋后用于Western blot檢測,稀釋倍數(shù)見表1。

1.5 統(tǒng)計分析

本試驗所有數(shù)據(jù)用GraphPad Prism 6的t檢驗進行分析,數(shù)據(jù)柱以平均值表示,誤差線為標準差。當P<0.05時認為差異顯著。

表1 Western blot所用抗體

2 結果與分析

2.1 Transwell小室培養(yǎng)的BMECs層TEER

經測定發(fā)現(xiàn),BMECs接種于Transwell濾網約6 d時細胞層TEER達到平臺期(圖1),反映細胞層緊密性良好。

圖1 奶牛乳腺上皮細胞層跨膜電阻

2.2 Met-Met對BMECs中β-酪蛋白蛋白表達的影響

結果顯示,Transwell上室和下室培養(yǎng)液中添加0.5 mmol/L Met-Met均可顯著增加BMECs中β-酪蛋白的蛋白相對表達量(P<0.05,圖2)。

2.3 Met-Met對BMECs中PepT2蛋白表達的影響

結果顯示,Transwell上室和下室培養(yǎng)液中添加0.5 mmol/L Met-Met均顯著提高了BMECs中PepT2的蛋白相對表達量(P<0.05,圖3)。

數(shù)據(jù)柱形標注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖3、圖4同。

2.4 Met-Met對BMECs中mTOR、S6K1和AKT磷酸化水平的影響

結果顯示,Transwell下室培養(yǎng)液中添加0.5 mmol/L Met-Met顯著提高了mTOR、S6K1和AKT的磷酸化水平(P<0.05,圖4) 。

3 討 論

乳蛋白的合成和分泌是一個復雜的生物過程,受到很多因素的影響[16]。其中,氨基酸和小肽作為乳蛋白合成的前體物質,是影響乳蛋白合成的主要因素[15]。眾多研究表明小肽可以調控乳蛋白的合成[5,17]。但是BMECs上皮細胞攝取血液小肽的機制還不十分清楚。已有研究表明PepT2在BMECs小肽攝取過程中發(fā)揮重要作用[6,18]。然而,另有研究證實,PepT2在大鼠乳腺上皮細胞的頂膜側表達,在從乳汁重吸收小肽類物質(乳蛋白水解物和肽結構類似藥物)的過程中發(fā)揮作用[19-20]。所以,Met-Met等小肽對PepT2表達和乳蛋白合成的促進作用可能發(fā)生在乳腺上皮細胞頂膜側。因為在BMECs貼壁培養(yǎng)模式下,添加培養(yǎng)液側即為乳腺腺泡側(頂膜側),在培養(yǎng)液中添加Met-Met可使乳腺腺泡側Met-Met濃度升高,從而增加了PepT2表達和乳蛋白合成。乳腺上皮細胞屬于極性細胞,其物質的吸收和乳汁的分泌具有方向性,貼壁培養(yǎng)不能保證細胞的極性狀態(tài),破壞了物質吸收和乳汁分泌的方向性。小肽轉運載體是否在乳腺從血液攝取小肽過程中發(fā)揮作用需要進一步的研究。

圖3 Transwell上室和下室培養(yǎng)液中添加

圖4 Transwell下室培養(yǎng)液中添加Met-Met對mTOR、S6K1和AKT磷酸化的影響

鑒于此,本研究將BMECs在Transwell小室內進行培養(yǎng),探討B(tài)MECs對上室和下室培養(yǎng)液中Met-Met的攝取利用。采用BMECs結合Transwell小室進行極化培養(yǎng),上室代表上皮細胞頂膜側(腺泡腔),下室代表上皮細胞基底膜側(血液),這種屏障模型能代表BMECs的正常生理狀態(tài),便于更準確地研究小肽在BMECs中的攝取機理。試驗結果表明,BMECs接種于Transwell小室培養(yǎng)6 d后細胞層TEER達到平臺期,說明成功建立了細胞屏障,可用于跨膜轉運試驗。進一步研究發(fā)現(xiàn),Transwell上室和下室培養(yǎng)液中添加Met-Met均顯著增加了β-酪蛋白和PepT2的蛋白相對表達量。以上結果提示Transwell上室和下室培養(yǎng)液中的Met-Met均可被BMECs吸收用于乳蛋白的合成,PepT2在BMECs頂膜側和基底膜側小肽的攝取過程中均發(fā)揮作用。Wang等[17]研究表明,PepT2蛋白在BMECs頂膜側和底膜側均有表達,其在奶牛乳腺小肽攝取過程中發(fā)揮重要作用。Shennan等[19-20]研究證實,PepT2蛋白在大鼠乳腺上皮細胞的頂膜側表達,在從乳汁重吸收小肽類物質的過程中發(fā)揮作用。本試驗結果同以上研究結果一致。

被BMECs吸收后,小肽不僅可以作為底物參與乳蛋白合成,還可以作為信號分子調控乳蛋白的合成[21]。mTOR是一種哺乳動物絲氨酸/蘇氨酸激酶,它能感受來自營養(yǎng)素(氨基酸、小肽)等的信號來調控蛋白質合成和細胞生長[22]。S6K1是mTOR的直接靶元件。活化的S6K1促進mRNAs的5’端翻譯增加,這些mRNAs轉錄一些蛋白質翻譯相關的組分(核糖體蛋白、延長因子和PolyA結合蛋白),因而可以促進蛋白質的合成[23]。AKT是調控mTOR活性的一個關鍵的正調控因子[24]。本研究中,Transwell下室培養(yǎng)液中添加Met-Met顯著增加了BMECs中mTOR、S6K1和AKT的磷酸化水平,結果提示Met-Met通過激活mTOR和AKT信號通路促進了乳蛋白的合成。Wang等[17]研究結果亦表明,Met-Met通過激活BMECs中信號轉導和轉錄激活因子5(signal transducer and activator of transcription 5,STAT5)、Janus激酶2(Janus kinase 2,JAK2)、mTOR、4E-結合蛋白1(4E-binding protein 1,4EBP1)和S6K1等信號通路元件促進細胞增殖,提高了細胞活力和β-酪蛋白的合成;進一步研究表明,抑制JAK2和mTOR信號通路降低了Met-Met引起的BMECs活力增加和乳蛋白合成[17]。另有研究發(fā)現(xiàn),Met-Met可以通過激活磷酸肌醇3-激酶(phosphatidylinositide 3-kinase,PI3K)-AKT信號通路促進乳腺發(fā)育(提高42%)和泌乳過程(增加84%)[25]。本試驗結果同以上研究結果一致。

4 結 論

① BMECs接種于Transwell小室培養(yǎng)6 d后形成細胞層,建立細胞屏障。BMECs結合Transwell小室進行極化培養(yǎng),上室代表腺泡腔,下室代表血液側,比傳統(tǒng)的貼壁培養(yǎng)更接近乳腺上皮細胞的生理狀態(tài),能保障乳腺上皮細胞物質吸收和乳汁分泌的方向性,便于更準確地研究小肽在BMECs中的攝取機理。

② Transwell下室和上室培養(yǎng)液中的Met-Met均可被BMECs吸收用于乳蛋白的合成,PepT2在Met-Met的攝取過程中均發(fā)揮作用,提示血液和腺泡腔中的小肽均可被乳腺上皮細胞PepT2吸收或重吸收并用于乳蛋白的合成。

③ Transwell下室培養(yǎng)液中的Met-Met通過激活mTOR和AKT信號通路促進乳蛋白的合成。