施 安 孫文陽(yáng) 陳志龍 李 博 侯鵬霞* 梁小軍*

(1.寧夏農(nóng)林科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所,銀川 750002;2.寧夏農(nóng)林科學(xué)院固原分院,固原 756099;3.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,楊凌 712100)

西門(mén)塔爾(Simmental)和安格斯(Angus)是我國(guó)具有優(yōu)勢(shì)特色和發(fā)展?jié)摿Φ闹饕馀Ｆ贩N。研究發(fā)現(xiàn),安格斯牛肉有呈現(xiàn)低飽和脂肪酸(saturated fatty acid,SFA)、高亞麻酸(C18∶3n3)和不飽和脂肪酸(unsaturated fatty acid,UFA)含量的趨勢(shì),并且其肌內(nèi)脂肪(intramuscular fat,IMF)含量較高[1-2]。此外,安格斯牛肉在多汁、嫩度和風(fēng)味上均優(yōu)于中國(guó)西門(mén)塔爾牛肉[3-4],是打造高端牛肉市場(chǎng)上的主推品種。

IMF直接影響牛肉的品質(zhì)和風(fēng)味[5-6],其由肌原性干細(xì)胞和前脂肪細(xì)胞分化轉(zhuǎn)移形成[7],也可以從成纖維細(xì)胞樣前脂肪細(xì)胞到成熟脂肪細(xì)胞的多步驟分化形成[8];其中,前脂肪細(xì)胞還通過(guò)旁分泌因子的細(xì)胞間通訊、細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)和細(xì)胞-細(xì)胞黏附調(diào)節(jié)與周?chē)Y(jié)締組織的增殖、分化和脂肪生成[9]。前脂肪細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞的轉(zhuǎn)化是由一系列轉(zhuǎn)錄因子控制的,其中過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ,PPARγ)和CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α(CCAAT/enhancer binding protein α,C/EBPα)被認(rèn)為是關(guān)鍵的成脂因子,它們共同發(fā)揮多效轉(zhuǎn)錄激活因子的作用,包括脂肪酸結(jié)合蛋白4(fatty acid binding protein 4,FABP4)、脂蛋白脂肪酶(lipoprotein lipase,LPL)、脂肪酸轉(zhuǎn)位酶(fatty acid translocase,FAT)和產(chǎn)生脂肪細(xì)胞表型的周?chē)豙10-11]。在PPARγ和C/EBPα誘導(dǎo)之前,還有其他轉(zhuǎn)錄因子驅(qū)動(dòng)成脂程序,包括CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白β(CCAAT/enhancer binding protein β,C/EBPβ)、CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白δ(CCAAT/enhancer binding protein δ,C/EBPδ)、Krüpple樣轉(zhuǎn)錄因子(Krüppel-like factor,KLF)和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factor,FGF)等早期成脂因子[12-13]。

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(transcriptome sequencing,RNA-Seq)可精確獲得某一物種在特定條件下所有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)狀況。利用高通量測(cè)序計(jì)算mRNA表達(dá)量,結(jié)合生物信息分析可高效獲得性狀相關(guān)基因的表達(dá)模式與功能差異[14-15]。Zheng等[3]對(duì)安格斯牛和中國(guó)西門(mén)塔爾牛的糞便和背最長(zhǎng)肌進(jìn)行多組學(xué)分析發(fā)現(xiàn),安格斯牛的腸道微生物多樣性明顯高于中國(guó)西門(mén)塔爾牛,中國(guó)西門(mén)塔爾牛蛋白上調(diào)的差異表達(dá)基因(differentially expressed genes,DEGs)主要參與免疫和炎癥反應(yīng),而安格斯牛蛋白上調(diào)的DEGs主要參與肌肉系統(tǒng)和肌原纖維的調(diào)節(jié),且該研究鑒定出了17個(gè)與肌肉和脂肪代謝相關(guān)的基因,包括肌肉生長(zhǎng)抑制素(myostatin,MSTN)、肌球蛋白輕鏈磷酸化快肌(myosin light chain, phosphorylatable, fast skeletal muscle,MYLPF)、快速骨骼肌鈣蛋白T3(troponin T3, fast skeletal type,TNNT3)和脂肪酸結(jié)合蛋白3(FABP3)/FABP4等。Zhang等[16]對(duì)云嶺牛和中國(guó)西門(mén)塔爾牛的背肌轉(zhuǎn)錄組檢測(cè)出1 347個(gè)DEGs,且被差異調(diào)節(jié)的主要代謝途徑是脂肪分解和糖代謝。Ueda等[17]通過(guò)RNA-Seq鑒定出與日本和牛皮下和IMF形成的8個(gè)關(guān)鍵基因,包括羧肽酶E(carboxypeptidase E,CPE)、生腱蛋白C(tenascin C,TNC)、轉(zhuǎn)凝蛋白(transgelin,TAGLN)、Ⅳ型膠原α5(collagen type IV α5,COL4A5)、半胱氨酸和甘氨酸富集蛋白2(cysteine and glycine-rich protein 2,CSP2)、PDZ和LIM域3(PDZ and LIM domain 3,PDLIM3)、磷酸酶1調(diào)節(jié)抑制因子14A亞基(phosphatase 1 regulatory inhibitor subunit 14A,PPP1R14A)和鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶調(diào)節(jié)因子2(regulator of calcineurin 2,RCAN2)。本試驗(yàn)對(duì)寧夏地區(qū)西門(mén)塔爾和安格斯肉牛的背最長(zhǎng)肌肉質(zhì)特性進(jìn)行了對(duì)比研究及RNA-Seq,結(jié)合生物信息鑒定出可能影響IMF沉積的DEGs,并對(duì)其表達(dá)特性進(jìn)行分析,為闡明肉牛IMF沉積的調(diào)控機(jī)制和改善肉品質(zhì)提供一定的理論借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物和樣品采集

選用來(lái)自寧夏永寧某養(yǎng)殖場(chǎng)親緣關(guān)系和月齡相近、飼糧結(jié)構(gòu)相同以及飼養(yǎng)管理?xiàng)l件一致的西門(mén)塔爾和安格斯公牛各3頭,平均體重為(700±10) kg,組間差異不顯著(P>0.05)。

試驗(yàn)牛于2022年5月統(tǒng)一屠宰,采集胴體第12根肋骨處背最長(zhǎng)肌樣品。取500 g樣品于4 ℃熟化24 h,用于熟肉率和系水力(參考NY/T 1333—2007方法)、剪切力(參考NY/T 1180—2006方法)以及氨基酸(參考GB 5009.124—2016方法)和脂肪酸(參考GB 5009.168—2016方法)含量的測(cè)定;另取500 g樣品于-20 ℃保存,用于蛋白質(zhì)和IMF含量的測(cè)定(剔除表面筋膜和脂肪);采集5 g左右樣品組織于專(zhuān)用固定液保存,用于肌纖維組織特性的測(cè)定[蘇木精-伊紅(HE)染色];取1 cm3左右樣品錫紙包裹投入液氮于-80 ℃保存,用于RNA提取。

1.2 RNA的提取與建庫(kù)測(cè)序

采用TRIzol(Invitrogen,美國(guó))試劑盒從背最長(zhǎng)肌樣品中提取RNA樣本,通過(guò)Agilent 2100生物分析儀(Agilent Technologies,美國(guó))檢測(cè)RNA樣本的完整性和純度。篩選出符合28S rRNA∶18S rRNA≥1.0且RNA完整度(RIN)≥7條件的樣本,通過(guò)Oligo(dt)磁珠吸附法構(gòu)建mRNA文庫(kù),庫(kù)檢合格后,不同文庫(kù)按照有效濃度及目標(biāo)上機(jī)數(shù)據(jù)量的需求進(jìn)行Illumina NovaSeq 6000測(cè)序。

1.3 測(cè)序數(shù)據(jù)分析

對(duì)測(cè)序獲取的原始數(shù)據(jù)篩選過(guò)濾后得到高質(zhì)量數(shù)據(jù)(clean reads),利用HISAT2 2.0.5軟件與牛(Bostaurus)的參考基因組比對(duì)(參考基因組版本為USDA ARS-UCD1.2)[18]。采用FeatureCounts 1.5.0統(tǒng)計(jì)每個(gè)基因的每千個(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬(wàn)映射讀取的片段(fragments per kilobase of transcript per million mapped reads,FPKM),再結(jié)合StringTie 1.3.3b對(duì)基因進(jìn)行定量[19]。采用DESeq2 1.20.0軟件進(jìn)行2個(gè)肉牛品種之間的差異基因表達(dá)分析[20],顯著差異表達(dá)閾值為校正后的P值(Padj)<0.05及|log2[差異倍數(shù)(fold change,FC)]|>1,對(duì)DEGs進(jìn)行主成分分析(PCA),并可視化每個(gè)個(gè)體的基因表達(dá)譜。

1.4 DEGs富集分析

采用clusterProfile 3.8.1 R語(yǔ)言包對(duì)DEGs集進(jìn)行基因本體(gene ontology,GO)功能和京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路富集分析[21],均以Padj<0.05作為顯著性富集的閾值,根據(jù)DEGs的顯著性水平和肌纖維、脂質(zhì)發(fā)育關(guān)聯(lián)注釋信息篩選出與IMF沉積相關(guān)的主控基因和調(diào)控通路。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)分析

為驗(yàn)證RNA測(cè)序數(shù)據(jù),采用RT-qPCR檢測(cè)DEGs。背最長(zhǎng)肌組織分離的總RNA樣品采用PrimeScriptTMRT試劑盒(TaKaRa,日本)反轉(zhuǎn)錄成cDNA,去除基因組DNA。采用SYBR Green試劑盒(QIAGEN,美國(guó))進(jìn)行RT-qPCR分析。將所選DEGs的表達(dá)水平與內(nèi)參基因β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)進(jìn)行歸一化處理。PCR反應(yīng)條件為:95 ℃反應(yīng)10 min,40個(gè)循環(huán),95 ℃反應(yīng)15 s,60 ℃反應(yīng)60 s。采用2-ΔΔCt法計(jì)算DEGs的相對(duì)表達(dá)量。所有供試基因引物信息見(jiàn)表1。

表1 引物信息

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件中的獨(dú)立樣品t檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析,結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示,P<0.05為差異顯著,P<0.01為差異極顯著,P>0.05為差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 西門(mén)塔爾牛和安格斯牛肉品質(zhì)及肌纖維特性分析

由表2可知,安格斯牛IMF含量和系水力極顯著高于西門(mén)塔爾牛(P<0.01),肌纖維直徑顯著低于西門(mén)塔爾牛(P<0.05);安格斯牛肌肉粗蛋白質(zhì)含量、熟肉率和肌纖維密度都高于西門(mén)塔爾牛,但差異均不顯著(P>0.05)。

2.2 西門(mén)塔爾牛和安格斯牛肌肉氨基酸和脂肪酸含量分析

由表3可知,試驗(yàn)測(cè)定了非必需氨基酸(non essential amino acid,NEAA)和必需氨基酸(essential amino acid,EAA)各8種,2個(gè)品種牛肌肉的氨基酸組成成分一致,但含量存在差異。在NEAA中,安格斯牛肌肉酪氨酸含量極顯著高于西門(mén)塔爾牛(P<0.01),肌肉精氨酸含量極顯著低于西門(mén)塔爾牛(P<0.01)。在EAA中,2個(gè)品種牛肌肉各氨基酸含量差異均不顯著(P>0.05)。2個(gè)品種牛肌肉NEAA和EAA的總含量差異均不顯著(P>0.05),且EAA/TAA值均接近40%(理想值),即2個(gè)品種牛肌肉蛋白質(zhì)含量豐富。

肌肉中的脂肪酸可分為SFA、單不飽和脂肪酸(monounsaturated fatty acid,MUFA)和多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid,PUFA)。由表4可知,2個(gè)品種牛分別檢測(cè)到4種SFA、3種MUFA和4種PUFA,且各分類(lèi)中的脂肪酸含量差異均不顯著(P>0.05),但西門(mén)塔爾牛肌肉SFA總含量高于安格斯牛,肌肉MUFA總含量低于安格斯牛,且肌肉PUFA含量2個(gè)品種接近,脂肪酸組成整體差異不大。

表2 西門(mén)塔爾牛和安格斯牛肉品質(zhì)及肌纖維特性分析

表3 西門(mén)塔爾牛和安格斯牛肌肉氨基酸含量分析

表4 西門(mén)塔爾牛和安格斯牛肌肉脂肪酸含量分析

2.3 西門(mén)塔爾牛和安格斯牛肌肉RNA-Seq結(jié)果分析

由表5可知,采用Illumina NovaSeq 6000平臺(tái)對(duì)西門(mén)塔爾牛和安格斯牛背最長(zhǎng)肌進(jìn)行RNA-Seq,結(jié)果顯示,每組3個(gè)重復(fù)平均共產(chǎn)生45 677 571條cleanreads,150bp clean reads的堿基質(zhì)量值≥30的堿基所占百分比(Q30)平均值為93.96%,而每個(gè)樣品的平均鳥(niǎo)嘌呤和胞嘧啶(GC)含量為51.02%,表明測(cè)序數(shù)據(jù)的結(jié)果可靠,質(zhì)量穩(wěn)定。此外,每個(gè)樣本約96%被定位到參考基因組,有93%左右被定位到唯一參考基因組的基因區(qū)域。

表5 西門(mén)塔爾牛和安格斯牛肌肉RNA-Seq結(jié)果分析

2.4 西門(mén)塔爾牛和安格斯牛肌肉DEGs分析

由圖1可知,通過(guò)盒形圖展示西門(mén)塔爾牛和安格斯牛之間基因表達(dá)值FPKM分布的對(duì)比情況發(fā)現(xiàn),西門(mén)塔爾牛和安格斯牛肌肉DEGs的表達(dá)模式相似。PCA結(jié)果(圖2)表明,主成分1(PC1)和主成分2(PC2)分別為42.88%和20.57%。由圖3可知,安格斯牛3個(gè)重復(fù)樣本聚合緊密,重復(fù)性較好;而西門(mén)塔爾牛組內(nèi)分散,重復(fù)性較差,但2個(gè)品種之間比較分散,說(shuō)明所用樣本分組合理。由圖4可知,與安格斯牛相比,西門(mén)塔爾牛共有1 214個(gè)候選基因在肌肉組織中差異表達(dá),其中上調(diào)基因736個(gè),下調(diào)基因478個(gè)。

圖1 西門(mén)塔爾牛和安格斯牛肌肉基因

圖2 西門(mén)塔爾牛和安格斯牛肌肉FPKM PCA結(jié)果

2.5 西門(mén)塔爾牛和安格斯牛肌肉DEGs GO功能富集分析

DEGs注釋到GO數(shù)據(jù)庫(kù)中共顯著富集在了43個(gè)GO條目,在生物過(guò)程(biological process,BP)、細(xì)胞組分(cellular component,CC)和分子功能(molecular function,MF)分類(lèi)中,包含的亞類(lèi)分別為20、15和8個(gè)。從每個(gè)分類(lèi)中各選取最顯著的前10個(gè)(分子功能為8個(gè))條目繪制柱狀圖(圖5)。在生物過(guò)程分類(lèi)中,參與生物合成和代謝的DEGs最多,數(shù)量分別為103和121個(gè);在細(xì)胞組分分類(lèi)中,細(xì)胞質(zhì)部分和細(xì)胞內(nèi)無(wú)膜細(xì)胞器富集的DEGs最多,數(shù)量分別為123和117個(gè);在分子功能分類(lèi)中,DEGs主要參與核糖體結(jié)構(gòu)成分、結(jié)構(gòu)分子活性和磷酸酯水解酶活性,數(shù)量分別為71、82和50個(gè)。

2.6 西門(mén)塔爾牛和安格斯牛肌肉DEGs KEGG通路富集分析

從KEGG通路富集分析結(jié)果中,選取最顯著的20個(gè)注釋繪制散點(diǎn)圖(圖6),結(jié)合GeneCards在線查詢基因功能,進(jìn)一步篩選與IMF沉積相關(guān)的DEGs,發(fā)現(xiàn)其主要富集在了心肌收縮(cardiac muscle contraction)、非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver disease)和逆行內(nèi)源性大麻素信號(hào)(retrograde endocannabinoid signaling)通路中,數(shù)量分別為42和47個(gè);同時(shí),共篩選出3個(gè)可能與IMF沉積相關(guān)的DEGs。與安格斯牛相比,西門(mén)塔爾牛肌肉淀粉樣前體蛋白(APP)為下調(diào)基因,肌肉原肌球蛋白2(TPM2)和鈣電壓門(mén)控通道亞基α1 S(CACNA1S)為上調(diào)基因,這3個(gè)調(diào)控基因的關(guān)鍵信息見(jiàn)表6。

2.7 RT-qPCR驗(yàn)證結(jié)果

由圖7可知,在2種肉牛品種背最長(zhǎng)肌中,安格斯牛肌肉CACNA1SRNA-Seq表達(dá)量極顯著高于西門(mén)塔爾牛(P<0.01),肌肉TPM2 RNA-Seq表達(dá)量也顯著高于西門(mén)塔爾牛(P<0.05),表明這2個(gè)基因?qū)MF沉積有促進(jìn)作用;而肌肉APPRNA-Seq表達(dá)量在2種牛之間差異不顯著(P>0.05)。RT-qPCR驗(yàn)證結(jié)果與RNA-Seq結(jié)果相一致。

3 討 論

牛肉IMF含量與肉質(zhì)的細(xì)嫩多汁和口感風(fēng)味等特性密切相關(guān)[22]。通常來(lái)說(shuō),IMF與肌肉嫩度[23-25]、系水力[26]、多汁性[27]以及肌纖維密度[28]呈正相關(guān),與剪切力[29]和肌纖維直徑[28]呈負(fù)相關(guān)。本試驗(yàn)測(cè)定肉質(zhì)相關(guān)性狀發(fā)現(xiàn),安格斯牛的IMF含量和系水力極顯著高于西門(mén)塔爾牛,肌纖維直徑顯著低于西門(mén)塔爾牛,肌肉粗蛋白質(zhì)含量、熟肉率和肌纖維密度都高于西門(mén)塔爾牛,而剪切力低于西門(mén)塔爾牛。這與上述IMF與肉品質(zhì)的相關(guān)性規(guī)律一致,也與趙偉明等[30]和韓信嶸[2]研究發(fā)現(xiàn)安格斯牛IMF含量高、肉品質(zhì)好的結(jié)果一致。此外,2個(gè)品種肉牛肌肉氨基酸組成的分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),兩者EAA/TAA值都接近40%理想值,表明肌肉中都具有豐富的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)。不過(guò),與西門(mén)塔爾牛相比,安格斯牛肌肉的SFA總含量較低,而肌肉的MUFA總含量較高,但差異均不顯著,且兩者的PUFA總含量接近,總體而言,2個(gè)品種肌肉脂肪酸組成差異不大。通常來(lái)說(shuō),過(guò)高的肌肉SFA含量不利于人體健康,將會(huì)提升血液膽固醇水平[31],而不飽和脂肪酸不僅可以阻止動(dòng)脈硬化[32],還能預(yù)防高血脂和冠心病的發(fā)生[33]。Chambaz等[4]在背最長(zhǎng)肌平均IMF含量為3.25%的條件下,比較安格斯、西門(mén)塔爾、夏羅萊和利木贊閹牛的肉質(zhì)和大理石花紋特性發(fā)現(xiàn),安格斯牛的脂肪含量得分最高,IMF沉積最好,同時(shí)安格斯和利木贊牛比西門(mén)塔爾牛肉質(zhì)更嫩,這進(jìn)一步說(shuō)明了安格斯牛肉的優(yōu)秀品質(zhì)。為了進(jìn)一步確定影響這些表型差異的候選基因和通路,本試驗(yàn)采用Illumina NovaSeq 6000平臺(tái)對(duì)安格斯和西門(mén)塔爾2個(gè)肉牛品種的背最長(zhǎng)肌組織進(jìn)行RNA-Seq,并通過(guò)對(duì)DEGs GO功能和KEGG通路進(jìn)行富集分析,鑒定出與IMF沉積有關(guān)的功能基因,結(jié)果發(fā)現(xiàn),一些DEGs參與了脂肪形成的生物過(guò)程,一些DEGs參與了脂肪組織發(fā)育的重要信號(hào)通路,結(jié)合GeneCards和RT-qPCR對(duì)相關(guān)功能基因進(jìn)一步驗(yàn)證篩選,得出了APP、TPM2和CACNA1S這3個(gè)基因,可為肉牛的脂肪沉積機(jī)制研究提供參考依據(jù)。

圖3 西門(mén)塔爾牛和安格斯牛肌肉DEGs熱圖及聚類(lèi)分析

圖4 西門(mén)塔爾牛和安格斯牛肌肉DEGs火山圖

APP是一類(lèi)具有胞外N端區(qū)、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)C端尾短的大蛋白分子[34]。APP與阿爾茨海默病(Alzheimer disease,AD)斑塊相關(guān),已知存在于大腦突觸和成人神經(jīng)肌肉接頭中[35],還存在于小鼠骨骼肌和培養(yǎng)的肌源細(xì)胞中,成年小鼠骨骼肌中APPmRNA下調(diào),會(huì)抑制脂肪細(xì)胞的成脂分化[36-37]。此外,Wu等[38]研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)APP在小鼠肌肉中過(guò)度表達(dá)時(shí),會(huì)引起肌無(wú)力和萎縮,表明APP低表達(dá)有利于肌肉及脂肪的適度沉積;通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)證明,APP是miR-101-1的潛在靶基因,而miR-101-1是一種廣泛表達(dá)的微小RNA(miRNA),主要在牛骨骼肌中富集,其豐度在胎牛、犢牛和成年牛的骨骼肌中存在差異;在C2C12成肌細(xì)胞細(xì)胞系分化過(guò)程中,內(nèi)源性miR-101-1會(huì)上調(diào),轉(zhuǎn)染miR-101-1會(huì)抑制C2C12成肌細(xì)胞分化,同時(shí)顯著降低肌原分化(myogenic differentiation,MyOD)、肌細(xì)胞生成素(myogenin,MyOG)和肌球蛋白重鏈(myosin heavy chain,MyHC)的mRNA表達(dá)。APP與肉質(zhì)性狀有強(qiáng)相關(guān),可作為豬肉剪切力和嫩度的數(shù)量性狀位點(diǎn)(QTL)[39]。而Lee等[40]在人體脂肪組織中研究發(fā)現(xiàn),APP參與肥胖相關(guān)胰島素抵抗和脂肪組織炎癥,在脂肪組織和肥胖群體中均高表達(dá),其表達(dá)水平與脂肪沉積水平呈正相關(guān),這與本試驗(yàn)結(jié)果呈相反趨勢(shì),可能與研究對(duì)象不同有關(guān),其脂肪組織的細(xì)胞組成及成脂機(jī)制存在較大差異,具體原因需進(jìn)一步研究。

圖5 西門(mén)塔爾牛和安格斯牛肌肉DEGs GO功能富集分析

CACNA1S是編碼骨骼肌細(xì)胞中緩慢失活的L型電壓依賴性鈣通道的5個(gè)亞基之一,基因突變與骨骼肌代謝生長(zhǎng)和脂肪堆積相關(guān)[41]。骨骼肌電壓傳感器Cav1.1也是一個(gè)電壓依賴性鈣離子(Ca2+)通道,允許少量Ca2+內(nèi)流進(jìn)入哺乳動(dòng)物骨骼肌纖維[42]。Georgiou等[43]研究發(fā)現(xiàn),骨骼肌中發(fā)現(xiàn)了一條通路Cav1.1→鈣離子/鈣調(diào)蛋白依賴激酶Ⅱ(CaMKⅡ)→一氧化氮和酶(NOS),能調(diào)節(jié)脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白CD36在細(xì)胞內(nèi)的分布從而改變脂肪酸代謝。阻斷這一通路途徑可減少線粒體β氧化和能量消耗,促進(jìn)肌纖維密度增大,由此說(shuō)明CACNA1S能通過(guò)影響肌肉線粒體功能調(diào)節(jié)骨骼肌的能量消耗降低,從而導(dǎo)致IMF的沉積。Xue等[44]研究發(fā)現(xiàn),CACNA1S還涉及胰島素分泌、抵抗和信號(hào)通路相關(guān)的表觀遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò),通過(guò)調(diào)控長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,lncRNA)的變化和甲基化影響能量代謝、信號(hào)通路和細(xì)胞增殖相關(guān)過(guò)程,是脂質(zhì)代謝的上游調(diào)控途徑,還與其他靶基因共同調(diào)控肌內(nèi)沉積過(guò)程。Ma等[45]研究結(jié)果也證實(shí)了上述結(jié)果,CACNA1S在啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生甲基化,與修飾基因表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。Xue等[44]和Ma等[45]分別在蒙古羊和牦牛中均發(fā)現(xiàn)CACNA1S在啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生甲基化,參與脂質(zhì)代謝的上游調(diào)控途徑,調(diào)控動(dòng)物肌肉的發(fā)育和肉質(zhì)。方曉敏等[46]推測(cè)CACNA1S是一個(gè)適合作為影響豬肉品質(zhì)性狀QTL的候選基因。有研究發(fā)現(xiàn),基本螺旋-環(huán)-螺旋芳香烴受體核轉(zhuǎn)位蛋白樣1(BMAL1)通過(guò)反向定位c-erbA-1α(reverse orientation the c-erbA-1alpha,REV-ERBα)控制CACNA1S表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)鈣信號(hào),從而決定肌肉合成代謝或分解狀態(tài)的信號(hào)通路,可能是肌肉活動(dòng)的分子傳感器[47]。

圖6 西門(mén)塔爾牛和安格斯牛肌肉DEGs前20 KEGG通路富集氣泡圖

表6 IMF沉積相關(guān)DEGs

TPM2編碼β-原肌球蛋白,是肌動(dòng)蛋白纖維結(jié)合蛋白家族的一員,主要表達(dá)在慢速Ⅰ型肌纖維中,該基因的突變可改變其他肌原肌球蛋白蛋白的表達(dá)。TPM2在肌肉和非肌肉細(xì)胞中與肌動(dòng)蛋白纖維結(jié)合,與肌鈣蛋白復(fù)合物一起,在脊椎動(dòng)物橫紋肌收縮的鈣依賴調(diào)節(jié)中起核心作用[48]。Cho等[49]通過(guò)RNA和蛋白定量驗(yàn)證了原肌球蛋白家族成員在韓牛、閹牛和公牛的肌內(nèi)脂肪組織(intramuscular adipose tissue,IMAT)和大血管脂肪組織(macrovascular adipose tissue,MAT)中參與肌肉發(fā)育密切相關(guān)的調(diào)控通路,與奶牛或閹牛相比,IMAT中TPM2 mRNA和蛋白表達(dá)水平均較低,表明它們與大理石花紋評(píng)分和質(zhì)量等級(jí)呈正相關(guān)。本試驗(yàn)中,DEGs富集注釋結(jié)果顯示,TPM2與肌原纖維、收縮纖維部分和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的KEGG通路相關(guān),這與之前的研究結(jié)果[50-51]也一致,這為T(mén)PM2直接或間接參與脂肪沉積和脂肪酸代謝提供了證據(jù)。

*表示差異顯著(P<0.05),**表示差異極顯著(P<0.01),ns表示差異不顯著(P>0.05)。

在本研究中,在RT-qPCR驗(yàn)證DEGs表達(dá)結(jié)果中,安格斯牛肌肉CACNA1S和TPM2 RT-qPCR相對(duì)表達(dá)量顯著高于西門(mén)塔爾牛,表明其對(duì)IMF沉積有促進(jìn)作用,且與RNA-Seq的結(jié)果趨勢(shì)一致;而2種肉牛之間肌肉APP表達(dá)量差異不顯著,但相比于西門(mén)塔爾牛,安格斯牛肌肉APP表達(dá)量呈降低趨勢(shì),表明其對(duì)脂肪沉積有負(fù)調(diào)控作用,這與RNA-Seq結(jié)果也是一致的,這也進(jìn)一步支持了APP、CACNA1S和TPM2能夠參與調(diào)節(jié)IMF沉積關(guān)鍵通路,具有調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞分化和脂肪酸新陳代謝的分子功能的結(jié)論。

4 結(jié) 論

安格斯牛IMF沉積能力較強(qiáng),肉品質(zhì)較好。RNA-Seq共篩選出了3個(gè)(APP、CACNA1S和TPM2)與肉牛IMF沉積相關(guān)的候選基因,這為研究肉牛IMF沉積調(diào)控機(jī)制提供了參考。