李曉雙 劉宏睿 付鵬飛 張 萌 寇樂樂 張博熙 徐 彬 李士澤

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,農(nóng)村農(nóng)業(yè)部東北寒區(qū)牛病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,大慶 163000)

肝臟是許多生理過程的關(guān)鍵樞紐,也是哺乳動(dòng)物體內(nèi)最大的實(shí)質(zhì)性臟器和消化腺,具有代謝、解毒、排泄、凝血和免疫等功能[1]。肝細(xì)胞癌是目前臨床上最常見的原發(fā)性肝臟惡性腫瘤,也是癌癥死亡的主要原因,肝細(xì)胞癌的治療手段以肝移植為最佳[2],并且肝移植也面臨許多困難,其中肝源是最主要的。盡管病毒性肝炎和過度飲酒仍然是導(dǎo)致肝細(xì)胞癌的危險(xiǎn)因素,但非酒精性脂肪性肝病在近幾年逐漸成為肝細(xì)胞癌的主要原因[3]。非酒精性脂肪性肝病是由肝細(xì)胞內(nèi)脂肪過度儲存所引起的,而導(dǎo)致肝細(xì)胞內(nèi)脂肪過度儲存的主要因素是長期攝入高脂肪飲食,其可導(dǎo)致動(dòng)物機(jī)體肝臟內(nèi)脂肪過度儲存以及動(dòng)物肥胖。肝臟內(nèi)脂肪過度儲存是肝臟代謝紊亂造成的,例如脂質(zhì)合成增加、脂肪酸β氧化減少。肥胖對寵物的健康有著多種不利的影響,例如心臟病、糖尿病、非酒精性脂肪性肝病[4-6]。長期飼喂高脂肪飼料是導(dǎo)致肥胖的主要原因之一[7]。寵物貓發(fā)生肥胖之后其血清中高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和甘油三酯(TG)含量顯著增加[8];肥胖犬血清中的總膽固醇(T-CHO)、TG、總膽紅素和總蛋白含量顯著升高[9]。也有研究表明,在飼喂高脂飲食后大鼠肝臟受到嚴(yán)重?fù)p傷,表現(xiàn)出肝細(xì)胞空泡化和細(xì)胞邊界喪失等特征[10]。間歇性冷刺激可增加動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)熱,消耗棕色脂肪組織對抗動(dòng)物機(jī)體的肥胖[11],并降低肥胖小鼠體重及血清TG和T-CHO含量[12],改善葡萄糖穩(wěn)態(tài),增加肝臟的氧化能力并且具有減少蛋白質(zhì)、增加脂肪的作用[13-14]。為了探究間歇性冷刺激是否對高脂飲食小鼠肝臟脂質(zhì)代謝有影響,本研究以C57BL/6J小鼠為研究對象,構(gòu)建高脂模型,檢測血清中脂質(zhì)含量、觀察肝臟組織形態(tài)、檢測肝臟脂質(zhì)合成相關(guān)基因及蛋白的表達(dá),以明確間歇性冷刺激對高脂飲食小鼠肝臟脂質(zhì)代謝的具體影響,旨在為間歇性冷刺激對非酒精性脂肪性肝病的治療提供參考和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)選用的對照飼糧(TP23302)及高脂飼糧(TP23300)購自南京某飼料科技有限公司。主要試驗(yàn)材料如下:脂肪酸合成酶(FASN)抗體(Proteintech公司)、乙酰輔酶A羧化酶1(ACC1)抗體(Proteintech公司)、固醇元件結(jié)合蛋白1c(SREBP1c)抗體(Proteintech公司)、ATP-檸檬酸裂解酶(ACLY)抗體(Proteintech公司)、β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)抗體(Proteintech公司)、蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒(北京索萊寶生物科技有限公司)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)、YBR?Green Premix Ex TaqTM(TaKaRa)、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(新賽美生物科技有限公司)、RIPA裂解液(碧云天生物技術(shù)有限公司)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)配制試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)的研究對象為5周齡的雄性C57BL/6小鼠48只,隨機(jī)分為常溫對照組、常溫高脂組、冷刺激組和冷刺激高脂組,每組3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)4只,各組間體重?zé)o顯著差異(P>0.05)。對照組小鼠飼喂常規(guī)飼糧,高脂組小鼠飼喂高脂飼糧,構(gòu)建小鼠高脂模型。常溫組小鼠飼養(yǎng)溫度為(26±2) ℃,冷刺激組小鼠飼養(yǎng)溫度為4 ℃,試驗(yàn)期為30 d(每天6 h),每周冷刺激結(jié)束后,將1 000 mL塑料燒杯放在電子秤上去皮后將小鼠放入塑料燒杯中記錄其體重。待各組小鼠刺激完成后,采集小鼠肝臟組織和血液樣本以備后續(xù)試驗(yàn)。

1.3 血清生化指標(biāo)測定

采集各組小鼠的血液樣本于1.5 mL離心管中傾斜靜置2 h,用移液器吸出血清后,檢測血清中TG、T-CHO、游離脂肪酸(NEFA)、HDL-C、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)的含量。采用全自動(dòng)生化分析儀,按照南京建成生物工程研究所試劑盒說明進(jìn)行測定。

1.4 組織切片制備及染色方法

具體試驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[15]。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)

采集各組小鼠的肝臟組織,通過Trizol法提取RNA,合成cDNA后以β-actin為內(nèi)參基因,檢測小鼠肝臟中脂質(zhì)合成相關(guān)基因的mRNA相對表達(dá)量。擴(kuò)增反應(yīng)體系及反應(yīng)程序分別見表1和表2,基因引物序列見表3,反應(yīng)程序結(jié)束后采用2-△△Ct法進(jìn)行相對定量分析。

1.6 蛋白免疫印跡(Western blot)

采集小鼠肝臟組織,使用球磨儀將肝臟組織制備成組織勻漿。使用RIPA裂解液裂解組織提取總蛋白。測定蛋白濃度后配制SDS-PAGE,取30 μg的蛋白上樣量,以50 V,30 min;80 V,30 min;120 V,30 min條件完成電泳;使用聚偏二氟乙烯(PVDF)膜轉(zhuǎn)膜,條件為恒流250 mA,轉(zhuǎn)膜時(shí)間由目的蛋白大小確定,脫脂乳封閉1 h,洗膜緩沖液(TBST)洗3次加入一抗4 ℃過夜,3次洗膜后加入對應(yīng)二抗孵育1 h。使用蛋白成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光并定量分析。

表1 qRT-PCR反應(yīng)體系

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

本試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 8.0.2軟件和SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。其中單因素方差分析(one-way ANOVA)通過SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行;雙因素方差分析(two-way ANOVA)通過GraphPad Prism 8.0.2軟件進(jìn)行;多重比較通過Duncan氏法進(jìn)行。所有數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P>0.05為差異不顯著;P<0.05為差異顯著;P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 高脂小鼠模型的構(gòu)建

如表4所示,與常溫對照組相比,常溫高脂組小鼠終末體質(zhì)量在14周時(shí)極顯著升高(P<0.01),比常溫對照組提高20%,說明高脂模型構(gòu)建成功。

表2 qRT-PCR反應(yīng)程序

表3 引物序列

表4 小鼠體質(zhì)量

2.2 間歇性冷刺激對小鼠肝臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

如圖1所示,常溫對照組小鼠肝臟肝小葉結(jié)構(gòu)清晰,肝索排列規(guī)則有序,以中央靜脈為中心呈放射狀排列;肝細(xì)胞呈多邊形,未見水腫變性和壞死,核大而圓,位于肝細(xì)胞中央;小葉中央靜脈管壁完整,管腔無擴(kuò)大及紅細(xì)胞淤滯;肝竇無擴(kuò)大和充血;匯管區(qū)小葉間膽管結(jié)構(gòu)清晰,未見炎性細(xì)胞。冷刺激組小鼠的肝臟組織出現(xiàn)顆粒變性,炎性細(xì)胞浸潤,并觀察到充血和出血現(xiàn)象。常溫高脂組小鼠肝臟可見大小不一的圓形空泡,發(fā)生大泡性脂肪變性,其特征性表現(xiàn)為肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)1個(gè)或多個(gè)邊界清晰的脂滴,胞核和胞質(zhì)被擠至細(xì)胞邊緣。冷刺激高脂組小鼠肝臟肝小葉排列紊亂,肝細(xì)胞水腫可見空泡變性,炎性細(xì)胞浸潤。

圖1 小鼠肝臟組織HE染色結(jié)果

2.3 間歇性冷刺激對肥胖小鼠血清脂質(zhì)相關(guān)指標(biāo)的影響

如表5所示,常溫高脂組小鼠血清中TG、NEFA、T-CHO、HDL-C、LDL-C的含量極顯著高于常溫對照組(P<0.01)。冷刺激組小鼠血清中TG、NEFA、T-CHO、HDL-C、LDL-C的含量極顯著低于常溫對照組(P<0.01)。冷刺激高脂組小鼠血清中TG、NEFA、T-CHO、HDL-C、LDL-C的含量極顯著低于常溫高脂組(P<0.01)。

2.4 間歇性冷刺激對肥胖小鼠肝臟脂質(zhì)合成相關(guān)基因的mRNA相對表達(dá)量的影響

如圖2所示,與常溫對照組相比,常溫高脂組SREBP1c、ACC1、FASN和ACLYmRNA相對表達(dá)量極顯著升高(P<0.01);與常溫對照組相比,冷刺激組SREBP1c、ACC1、FASN和ACLYmRNA相對表達(dá)量無顯著差異(P>0.05);與常溫高脂組相比,冷刺激高脂組SREBP1c、ACC1、FASN和ACLYmRNA相對表達(dá)量極顯著降低(P<0.01)。

表5 小鼠血清中脂質(zhì)相關(guān)指標(biāo)的結(jié)果

2.5 間歇性冷刺激對肥胖小鼠肝臟脂質(zhì)合成相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

如圖3所示,小鼠高脂造模后,常溫高脂組小鼠SREBP1c、ACC1、FASN和ACLY蛋白表達(dá)量極顯著升高(P<0.01);小鼠間歇性冷刺激后,冷刺激組小鼠ACC1蛋白表達(dá)量極顯著降低(P<0.01),FASN蛋白表達(dá)量極顯著降低(P<0.01),SREBP1c和ACLY蛋白表達(dá)量無顯著差異(P>0.05);與常溫高脂組相比,冷刺激高脂組SREBP1c、ACC1、FASN和ACLY蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。

SREBP1c:固醇元件結(jié)合蛋白1c sterol regulatory element binding protein 1c;ACC1:乙酰輔酶A羧化酶 acety1 CoA carboxylase;FASN:脂肪酸合成酶 fatty acid synthase;ACLY:ATP-檸檬酸裂解酶 ATP-citrate lyase。圖3同 the same as Fig.3。

3 討 論

肝臟發(fā)生脂肪沉積時(shí)會形成大小不一的脂滴,通過組織學(xué)檢測肝臟形態(tài),發(fā)現(xiàn)常溫高脂組小鼠肝臟可見大小不一的圓形空泡,發(fā)生大泡性脂肪變性;冷刺激高脂組小鼠肝臟肝小葉排列紊亂,肝細(xì)胞水腫可見空泡變性,炎性細(xì)胞浸潤。有研究表明,飼喂小鼠高脂飲食后,小鼠肝臟出現(xiàn)明顯的脂肪變性、肝細(xì)胞氣球化等病理表現(xiàn)[16]。楊曉艷[17]研究發(fā)現(xiàn),在冷刺激之后肥胖小鼠的脂肪組織變得致密,細(xì)胞變小,這與本研究結(jié)果一致,均表明間歇性冷刺激對高脂飲食小鼠肝臟脂肪組織致密程度有影響。TG、T-CHO、NEFA是血清中脂質(zhì)相關(guān)指標(biāo),參與脂質(zhì)代謝。前人研究表明,在長期飼喂高脂肪飲食后,大鼠血清中TG、T-CHO、HDL-C、LDL-C含量增加[18],血清中TG、T-CHO、NEFA含量升高標(biāo)志著脂質(zhì)代謝異常[19]?；谝陨犀F(xiàn)象,本試驗(yàn)使用高脂肪飼料飼喂小鼠,構(gòu)建小鼠高脂模型,檢測血清中TG、NEFA、T-CHO、HDL-C、LDL-C含量,試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與常溫高脂組相比,冷刺激高脂組小鼠血清中TG、NEFA、T-CHO、HDL-C、LDL-C含量極顯著降低。童卓云[20]和程龍等[21]研究發(fā)現(xiàn),在冷刺激之后肥胖小鼠的體重和血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C含量降低,這與本研究結(jié)果一致,均表明間歇性冷刺激對高脂飲食小鼠血清中脂質(zhì)含量有影響。肝臟脂質(zhì)蓄積是由脂質(zhì)合成和分解之間不平衡引起的,與肝臟脂肪生成增加、脂質(zhì)攝取增加、TG輸出或脂肪酸β氧化減少有關(guān)[22-23]。肝臟的脂質(zhì)合成受許多重要轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié),例如肝臟X受體、碳水化合反應(yīng)元件結(jié)合蛋白和SREBP1c[24-26]。SEBP1c作為一種主要的轉(zhuǎn)錄因子,可廣泛調(diào)節(jié)合成脂肪酸的關(guān)鍵酶,包括FASN、ACC1[27-28]。ACC和FASN是負(fù)責(zé)肝臟新生脂肪生成的關(guān)鍵酶,ACC經(jīng)過乙酰輔酶A羧化酶催化生成丙二酰單酰輔酶A,并且丙二酰單酰輔酶A是FASN合成脂肪酸的底物[29]。本試驗(yàn)通過檢測小鼠肝臟組織中脂質(zhì)合成相關(guān)基因和蛋白的表達(dá),發(fā)現(xiàn)與常溫高脂組相比,冷刺激高脂組小鼠肝臟組織中脂質(zhì)合成基因SREBP1c、ACC1、FASN、ACLYmRNA相對表達(dá)量極顯著降低,脂質(zhì)合成蛋白SREBP1c、ACC1、FASN的表達(dá)極顯著降低,ACLY的蛋白表達(dá)顯著降低。Grefhorst等[30]的研究表明,長時(shí)間的冷暴露可減輕肝臟中SREBP1c的基因表達(dá)。Yoo等[31]也研究證明,寒冷刺激可以降低肝臟FASN和SREBP1c的蛋白表達(dá),這與本研究結(jié)果一致,均表明間歇性冷刺激會刺激脂肪分解,同時(shí)抑制新生脂肪生成。

圖3 小鼠肝臟組織脂質(zhì)合成相關(guān)蛋白的表達(dá)結(jié)果

在寵物飼養(yǎng)中,寵物犬、貓的肥胖變得越來越普遍,影響寵物犬、貓的生活質(zhì)量,甚至危害生命。相關(guān)研究表明,冷刺激使肩胛棕色脂肪組織切片內(nèi)的脂質(zhì)面積顯著減少,小鼠體重降低[32]。本研究中,在小鼠在間歇性冷刺激條件下,其機(jī)體肝臟組織中脂肪變性減輕、血清脂質(zhì)指標(biāo)降低、肝臟脂質(zhì)合成受到抑制,基于以上結(jié)果說明間歇性冷刺激可作為寵物肥胖及非酒精性脂肪性肝病治療的參考和理論依據(jù)。

4 結(jié) 論

間歇性冷刺激可使高脂飲食小鼠肝臟脂肪組織變得致密并對其血脂異常現(xiàn)象具有一定的緩解作用,并能抑制肝臟的脂質(zhì)合成。