陳攀攀 王 穎 郭得政 郗學(xué)鵬 王紅芳 胥保華 劉振國*

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院,泰安 271018;2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,泰安 271018)

蜜蜂是自然界最重要的傳粉媒介昆蟲。世界上約400種農(nóng)作物部分或全部依賴蜜蜂或其他昆蟲授粉[1],提供全球90%食物的100種作物中,有70多種是由蜜蜂授粉的[2-3]。在養(yǎng)蜂生產(chǎn)中,蜜蜂常面臨轉(zhuǎn)地運(yùn)輸、高溫等環(huán)境脅迫[4-5],導(dǎo)致幼蟲發(fā)育不良、成年蜜蜂暴躁和采集積極性下降等,給養(yǎng)蜂效益帶來不利影響[6]。因此,研究一種能緩解蜜蜂高溫脅迫的添加劑迫在眉睫,而養(yǎng)蜂業(yè)中有關(guān)緩解蜜蜂高溫脅迫的研究鮮有報(bào)道。

?；撬嵊址Qβ-氨基乙磺酸,是動物體內(nèi)一種可溶于水、對熱穩(wěn)定的含硫氨基酸,主要存在于動物組織(包括大腦、視網(wǎng)膜、肌肉和全身器官)[7]。牛磺酸具有抗高溫脅迫作用和營養(yǎng)調(diào)節(jié)功能,已在畜牧生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用。研究顯示,?；撬峋哂猩险{(diào)肉雞空腸組織熱休克蛋白70(HSP70)表達(dá)的作用[8];在虹鱒遭受熱刺激時(shí),?；撬釡p輕了機(jī)體熱應(yīng)激反應(yīng)[9];在熱應(yīng)激條件下,?；撬釋壷械奶幣壍膲勖醒娱L作用[10];在仔豬的飼糧中添加?；撬?具有增加機(jī)體抗氧化能力的作用[11];牛磺酸可顯著改善慢性應(yīng)激導(dǎo)致的大鼠行為學(xué)異常,減輕焦慮恐懼情緒[12],這表明?；撬峋哂锌箲?yīng)激作用。動物體中?；撬岬膩碓粗饕?個(gè):一個(gè)是膳食供給,另一個(gè)是自身的內(nèi)源性合成,但由于自身合成?；撬岬囊恍┟富钚暂^低,需通過外源添加?；撬醽硌a(bǔ)充[13]。在蜜蜂的天然食物中,?；撬岬暮繛?蜂王漿20.89 mg/100 g、玉米花粉202.7 mg/100 g、蕎麥花粉198.1 mg/100 g、水稻花粉56.21 mg/100 g、油菜花粉59.39 mg/100 g、油茶花粉61.34 mg/100 g、蜂蜜4.417 mg/100 g[14-17]。由此可見,蜜蜂通過食物可以獲得?；撬?但由于其?；撬岷枯^低,需通過補(bǔ)飼的方式提高?；撬嵩诜潴w內(nèi)的水平,以達(dá)到緩解高溫脅迫造成的不利影響。本試驗(yàn)通過在飼糧中添加?；撬?研究其對高溫脅迫下意大利蜜蜂7日齡工蜂生理功能的影響,以期緩解蜜蜂遭受高溫癥狀,提高蜜蜂壽命,為提高養(yǎng)蜂效益和蜜蜂福利提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用?；撬峒兌葹?9%,購自上海某生化科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)動物

試驗(yàn)用意大利蜜蜂工蜂取自山東農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)蜂群。選取蜂群群勢、封蓋子數(shù)、子脾數(shù)和蜂王產(chǎn)卵力相當(dāng)?shù)脑囼?yàn)蜂群15群,巢內(nèi)粉蜜貯存充足。試驗(yàn)開展時(shí)間為2022年8月,外界氣候晴暖、無蜜粉源。

1.3 試驗(yàn)飼糧

配制添加不同水平(0、0.2%和0.4%)?；撬岬?種試驗(yàn)飼糧,其組成見表1。

表1 試驗(yàn)飼糧組成

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及飼養(yǎng)管理

從上述蜂群中隨機(jī)抓取1日齡意大利蜜蜂工蜂1 500只,放置在20 cm×15 cm×10 cm的飼喂盒中,隨機(jī)分為3組,每組5個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)(每盒)100只,置于恒溫恒濕的培養(yǎng)箱(34 ℃,相對濕度為70%),對照組飼喂未添加?；撬岬脑囼?yàn)飼糧(50%糖水),2個(gè)試驗(yàn)組則分別飼喂添加了0.2%和0.4%牛磺酸的試驗(yàn)飼糧,飼喂至7日齡時(shí)模擬高溫環(huán)境(42 ℃,相對濕度為70%)進(jìn)行高溫脅迫。試驗(yàn)期間對蜜蜂存活狀況進(jìn)行監(jiān)測,每天固定時(shí)間更換飼糧,用鑷子將已死亡的蜜蜂移除,直至試驗(yàn)結(jié)束。試驗(yàn)所用蜂盒及培養(yǎng)箱需提前擦拭干凈、酒精消毒、紫外照射24 h滅菌,保持整個(gè)試驗(yàn)過程中的飼養(yǎng)環(huán)境,避免人為或環(huán)境因素等產(chǎn)生不必要的誤差。統(tǒng)計(jì)高溫脅迫離群工蜂的存活天數(shù)、采食量、體重、體成分、血淋巴生化指標(biāo)、蜂體免疫和抗氧化指標(biāo)的測定,并觀察中腸發(fā)育情況。

1.5 測定指標(biāo)及相關(guān)方法

1.5.1 離群工蜂壽命的測定

高溫脅迫24 h后,每組隨機(jī)選取3個(gè)重復(fù)的工蜂繼續(xù)進(jìn)行高溫脅迫(42 ℃,相對濕度為70%),直至全部死亡。根據(jù)各組工蜂存活天數(shù),計(jì)算每組工蜂的平均壽命。

1.5.2 離群工蜂采食量的測定

固定每盒蜂的糖水飼喂量(16孔×200 μL),每日稱量剩余糖水重并記錄,每組5個(gè)重復(fù),計(jì)算工蜂1～7日齡的采食量,計(jì)算公式為:

采食量=(全部糖水-剩余糖水)/工蜂個(gè)數(shù)。

1.5.3 離群工蜂1和7日齡體重的測定

1日齡體重:試驗(yàn)開始時(shí)從每組的每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選取10只工蜂,用電子天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司,FA2104,精確至0.000 1 g)稱重,計(jì)算10只工蜂的平均體重并記錄。

7日齡體重:高溫脅迫前從每組的每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選取10只7日齡工蜂,用上述電子天平(精確至0.000 1 g)稱重,計(jì)算10只工蜂的平均體重并記錄為7日齡體重。

1.5.4 離群工蜂體成分的測定

高溫脅迫24 h后,每個(gè)重復(fù)取10只工蜂,用鑷子去除蜜蜂的整個(gè)腸道和蜜囊后,將蜂體置于已稱重的稱量瓶于105 ℃烘箱中烘至恒重,并用電子天平(精確至0.000 1 g)記錄蜜蜂放入烘箱前的鮮重與烘后的干重,計(jì)算干物質(zhì)含量[干物質(zhì)含量=(鮮重-烘后的干重)/鮮重];粗蛋白質(zhì)和粗脂肪含量的測定見參考文獻(xiàn)[18]中的方法。

1.5.5 離群工蜂血淋巴生化指標(biāo)的測定

高溫脅迫24 h后,每個(gè)重復(fù)取50只工蜂,將1.5 mL離心管中加入少量的苯基硫脲,放置在預(yù)先制冷(0 ℃)的金屬浴中。選用20 μL規(guī)格的毛細(xì)血管吸取高溫脅迫24 h的工蜂胸部的血淋巴200 μL,用洗耳球?qū)⒀馨痛等腚x心管中,采集完立即將樣品放入-80 ℃冰箱保存。檢測前,將血淋巴樣品置于4 ℃冰箱內(nèi)解凍后,用4 ℃離心機(jī)12 000×g離心5 min,采用全自動生化分析儀(Roche Diagnostic System Inc.,美國)測定血淋巴中總膽固醇(TCHO)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、甘油三酯(TG)、葡萄糖(GLU)、高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)的含量。

1.5.6 離群工蜂蜂體免疫和抗氧化指標(biāo)的測定

每個(gè)重復(fù)取2只高溫脅迫24 h的工蜂(去直腸),用1×磷酸鹽緩沖液(PBS)按照質(zhì)量體積比1∶9進(jìn)行組織勻漿,然后用冷凍離心機(jī)3 000×g4 ℃離心10 min,取上清液,采用美聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)測定工蜂蜂體的酸性磷酸酶(ACP)、酚氧化酶(PO)、溶菌酶(LZM)、超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化物酶(POD)活性。儀器操作及試劑盒使用均按照說明書的方法進(jìn)行。組織勻漿上清液中蛋白質(zhì)濃度用BCA蛋白定量試劑盒(江蘇康為世紀(jì)生物科技股份有限公司)測定。

1.5.7 離群工蜂中腸形態(tài)學(xué)觀察

每個(gè)重復(fù)取5只高溫脅迫24 h的工蜂,取中腸,置于4%多聚甲醛溶液內(nèi)固定,脫水后進(jìn)行包埋、切片,將切片進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色,光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行中腸形態(tài)學(xué)觀察,拍照并測量腸壁厚度。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

所有數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”形式表示,采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件的單因素方差分析(one-way ANOVA)和Turkey’s檢驗(yàn)進(jìn)行比較分析,設(shè)定P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼糧中添加牛磺酸對高溫脅迫意大利蜜蜂工蜂壽命的影響

由表2可知,與對照組相比,飼糧中添加0.2%的?；撬釙r(shí)工蜂的平均壽命提高了36.84%(P<0.05),飼糧中添加0.4%的牛磺酸時(shí)工蜂的平均壽命提高了17.58%(P<0.05),以飼喂添加0.2%?；撬犸暭Z的工蜂的壽命最長。

表2 飼糧中添加?；撬釋Ω邷孛{迫意大利蜜蜂工蜂壽命的影響

2.2 飼糧中添加?；撬釋σ獯罄鄯涔し洳墒沉康挠绊?/h3>

由表3可知,與對照組相比,飼糧中添加0.2%的?；撬釙r(shí)1～7日齡工蜂的采食量提高了11.23%(P<0.05),飼糧中添加0.4%的牛磺酸時(shí)1～7日齡工蜂的采食量提高了17.98%(P<0.05)。以飼糧中添加0.4%?；撬釙r(shí)1～7日齡工蜂的采食量最大,說明添加0.4%牛磺酸對于提高夏季處于高溫脅迫狀態(tài)的離群工蜂的采食量效果最好。

表3 飼糧中添加牛磺酸對意大利蜜蜂工蜂采食量的影響

2.3 飼糧中添加?；撬釋σ獯罄鄯涔し潴w重的影響

由表4可知,各組工蜂的1日齡體重?zé)o顯著差異(P>0.05);飼喂添加0.2%?；撬犸暭Z的7日齡工蜂的體重較對照組提高了6.67%(P<0.05),說明飼糧中添加?；撬崮軌蛴行岣呦募咎幱诟邷孛{迫狀態(tài)的工蜂的體重。

表4 飼糧中添加?；撬釋σ獯罄鄯涔し潴w重的影響

2.4 飼糧中添加?；撬釋Ω邷孛{迫24 h意大利蜜蜂工蜂體成分的影響

由表5可知,在高溫脅迫24 h下,飼糧中添加0.2%和0.4%的牛磺酸時(shí)工蜂的干物質(zhì)含量與對照組無顯著差異(P>0.05);飼糧中添加0.4%的?；撬釙r(shí)工蜂的粗蛋白質(zhì)含量顯著高于對照組(P<0.05);飼糧中添加0.2%的?；撬釙r(shí)工蜂的粗脂肪含量顯著高于對照組(P<0.05)。

表5 飼糧中添加?；撬釋Ω邷孛{迫24 h意大利蜜蜂工蜂體成分的影響

2.5 飼糧中添加牛磺酸對高溫脅迫24 h意大利蜜蜂工蜂血淋巴生化指標(biāo)的影響

由表6可知,在高溫脅迫24 h下,與對照組相比,飼糧中添加0.2%和0.4%的?；撬峋@著降低了血淋巴中TCHO和TG含量(P<0.05),顯著增加了血淋巴中TP、ALB和HDL含量(P<0.05);并且,0.2%牛磺酸組血淋巴中TCHO和TP含量顯著高于0.4%?；撬峤M(P<0.05),血淋巴中HDL含量顯著低于0.4%牛磺酸組(P<0.05);工蜂血淋巴中GLU和LDL含量各組間沒有顯著差異(P>0.05)。

表6 飼料中添加?；撬釋Ω邷孛{迫24 h意大利蜜蜂工蜂血淋巴生化指標(biāo)的影響

2.6 飼糧中添加牛磺酸對高溫脅迫24 h意大利蜜蜂工蜂蜂體免疫和抗氧化指標(biāo)的影響

由表7可知,在高溫脅迫24 h下,與對照組相比,飼糧中添加0.2%和0.4%的?；撬峋@著提高了工蜂蜂體的ACP、LZM、SOD和POD活性(P<0.05);0.4%?；撬峤M工蜂蜂體的ACP、PO和POD活性顯著高于0.2%牛磺酸組(P<0.05),但LZM和SOD活性2組間無顯著差異(P>0.05)。

表7 飼糧中添加?；撬釋Ω邷孛{迫24 h意大利蜜蜂工蜂蜂體免疫和抗氧化指標(biāo)的影響

2.7 飼糧中添加?；撬釋Ω邷孛{迫24 h意大利蜜蜂工蜂中腸形態(tài)的影響

圖1為光學(xué)顯微鏡下20倍觀察到的7日齡意大利蜜蜂工蜂的中腸形態(tài),添加?；撬岬慕M腸壁發(fā)育完整。對中腸腸壁厚度進(jìn)行測量及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn),0.2%?；撬峤M和0.4%?；撬峤M工蜂中腸腸壁厚度均顯著高于對照組(P<0.05,表8)。

3 討 論

3.1 飼糧中添加?；撬釋Ω邷孛{迫下7日齡意大利蜜蜂工蜂生長發(fā)育的影響

蜜蜂養(yǎng)殖生產(chǎn)過程中,環(huán)境溫度的變化直接影響蜜蜂的個(gè)體發(fā)育、群體活動、蜂群繁殖、群勢強(qiáng)弱等方面,蜂群溫度是對蜜蜂生命活動影響最大的環(huán)境因素[19]。蜜蜂遭受高溫脅迫使蜂群情緒異常、行為錯(cuò)亂、生理節(jié)律紊亂,甚至死亡。早在2006年,研究人員就指出全球正面臨“蜜蜂危機(jī)”,全世界的蜜蜂正在以超高的速度死亡。2004年美國在發(fā)表蜜蜂基因組序列的評論中稱“如果沒有蜜蜂,整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)將會崩潰”[20]。因此,本研究通過在飼糧中添加?；撬醽硖骄科鋵Ω邷孛{迫蜜蜂生長發(fā)育的影響,以期能緩解蜜蜂高溫脅迫。本研究結(jié)果顯示,在高溫條件下,在飼糧中添加0.2%或0.4%的?；撬犸@著增加了7日齡意大利蜜蜂工蜂的平均壽命,其中添加0.2%?；撬釙r(shí)工蜂的存活時(shí)間最長,說明?；撬峥梢蕴岣?日齡意大利蜜蜂工蜂在高溫脅迫下的耐受能力,增加了生存時(shí)間,提高了壽命。

A:對照組 control group;B:0.2%?；撬峤M 0.2% taurine group;C:0.4%牛磺酸組 0.4% taurine group。

有研究表明,牛磺酸可以直接刺激動物食欲,在哺乳期母豬飼糧中添加0.1%的?；撬崮軌蝻@著提高母豬的采食量,減少背膘損失,提高仔豬斷奶重和成活率[21]。據(jù)報(bào)道,補(bǔ)充?；撬峥梢蕴岣呷怆u在慢性熱應(yīng)激下的體增重[22]。本研究通過測定意大利蜜蜂工蜂的采食量,得出飼糧添加0.2%和0.4%的?；撬釙r(shí)工蜂的采食量較對照組顯著增加,且添加0.2%的?；撬釙r(shí)工蜂7日齡體重顯著高于對照組,表明添加0.2%?；撬崮軌蛴行У靥岣?日齡意大利蜜蜂工蜂的體重,而添加0.4%?；撬釙r(shí)工蜂7日齡體重與對照組無顯著差異,推測高劑量的?；撬峥赡軣o法提高蜜蜂體重,該現(xiàn)象在其他物種上已被發(fā)現(xiàn)[23-25]。此外,添加適量?；撬峥梢栽黾庸し涞拇值鞍踪|(zhì)和粗脂肪含量,有利于工蜂生長發(fā)育。

表8 飼糧中添加?；撬釋Ω邷孛{迫24 h意大利蜜蜂工蜂中腸腸壁厚度的影響

有研究表明,在小鼠腸道缺血再灌注的情況下,添加牛磺酸可以防止腸道黏膜上皮的損傷,修復(fù)腸道上皮黏膜損傷,抑制腸道上皮細(xì)胞凋亡[26];添加?；撬崮軌蛟黾哟笫竽c道黏膜重量,使腸道細(xì)胞代謝增強(qiáng),從組織學(xué)上看,添加?；撬岷笤黾恿丝漳c和回腸絨毛高度,表明腸道的吸收表面積增大,而這與細(xì)胞質(zhì)量增加密切相關(guān)[27];補(bǔ)充?；撬峥删徑庵嗵且鸬娜庾须u十二指腸促凋亡蛋白表達(dá)增加和抗凋亡蛋白表達(dá)減少,提高十二指腸SOD活性,降低丙二醛(MDA)含量,增強(qiáng)十二指腸抗氧化狀態(tài),改善腸道炎癥[28]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),在飼糧中添加0.2%或0.4%的?；撬犸@著增加了高溫脅迫下7日齡意大利蜜蜂工蜂中腸腸壁厚度,說明添加牛磺酸可以促進(jìn)蜜蜂腸道發(fā)育。

3.2 飼糧中添加牛磺酸對高溫脅迫下7日齡意大利蜜蜂工蜂血淋巴生化指標(biāo)的影響

研究發(fā)現(xiàn),飼糧中添加0.15%的?；撬犸曃褂善诘傍?2 d,可顯著提高血清中TP和ALB含量[29];?；撬犸@著降低了肉雞血清TCHO、TG、游離脂肪酸(FFA)含量,并提高了粗脂肪消化率,增加了胰腺和小腸脂肪酶活性[30];此外,牛磺酸還可顯著增加慢性熱應(yīng)激肉雞胸肉和皮下腹部脂肪的脂肪酶活性,顯著提高血清FFA含量[30]。在高溫脅迫24 h下,飼糧中添加0.2%或0.4%的牛磺酸顯著降低了7日齡意大利蜜蜂工蜂血淋巴中TCHO和TG含量,顯著增加了血淋巴中TP、ALB和HDL含量,且0.2%?；撬峤M血淋巴中TCHO和TP含量顯著高于0.4%?；撬峤M,血淋巴中HDL含量顯著低于0.4%?；撬峤M,說明?；撬崮芴岣叩鞍踪|(zhì)利用率,有利于高溫脅迫下7日齡意大利蜜蜂工蜂的生長發(fā)育。

3.3 飼糧中添加?；撬釋Ω邷孛{迫下7日齡意大利蜜蜂工蜂免疫和抗氧化能力的影響

?；撬峋哂锌寡趸兔庖咦饔?可促進(jìn)鈣穩(wěn)態(tài)并顯示出很強(qiáng)的抗氧化特性[31],并對砷誘導(dǎo)的心臟氧化應(yīng)激具有保護(hù)作用[32]。飼喂添加1.25%牛磺酸的飼料可以顯著提高黃鰭鰓肝臟總抗氧化能力(T-AOC)和抗氧化酶活性,同時(shí)顯著降低其肝臟MDA含量[33]。飼料中添加適量的牛磺酸可以顯著提高草魚肝臟SOD、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和過氧化氫酶(CAT)活性,證明?；撬岱e極參與對氧化應(yīng)激的防御[34]。在高溫脅迫24 h下,飼糧中添加0.2%或0.4%的?；撬犸@著提高了高溫脅迫下7日齡意大利蜜蜂工蜂蜂體的ACP、LZM、SOD和POD活性;添加0.2%?；撬犸@著提高了蜂體的LZM活性;添加0.4%?；撬犸@著提高了蜂體的ACP、PO和POD活性。上述結(jié)果表明飼糧中添加?；撬峥商岣吒邷孛{迫下7日齡意大利蜜蜂工蜂免疫和抗氧化能力,其中0.4%牛磺酸組蜂體的ACP、PO和POD活性顯著高于0.2%牛磺酸組,但該組工蜂的壽命卻不及0.2%?；撬峤M,推測牛磺酸可能存在劑量效應(yīng),高劑量會導(dǎo)致死亡率升高[35-36]。因此,適量添加?；撬崮芨玫匕l(fā)揮其抗高溫脅迫作用,其適宜添加劑量還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

飼糧中添加?；撬犸@著提高了高溫脅迫下7日齡意大利蜜蜂工蜂的壽命,提高了蜂體粗蛋白質(zhì)和粗脂肪含量,增強(qiáng)了工蜂的免疫和抗氧化能力,表明飼糧中添加?；撬峥梢蕴岣?日齡意大利蜜蜂工蜂在高溫脅迫下的耐受能力。