陳 沛 趙 煜 楊元金 楊 菁 曲煥韜*

(1.中國長江三峽集團有限公司,中華鱘研究所,宜昌 443100;2.三峽工程魚類資源保護湖北省重點實驗室,宜昌 443100)

圓口銅魚(Coreiusguichenoti)主要分布于金沙江中下游、長江上游干流等水域,棲息于激流性生境,為典型的河道洄游性魚類。多年來,由于過度捕撈、環(huán)境污染、涉水工程等人類活動造成圓口銅魚產(chǎn)卵場破壞、洄游通道被阻斷,導致其自然種群規(guī)模急劇下降[1-2],因此,加強圓口銅魚種群資源的保護和恢復非常迫切。目前,人工增殖放流是快速恢復珍稀瀕危魚類自然種群最為有效手段之一。

為了擴大增殖放流的規(guī)模,關于圓口銅魚物種保護的相關研究已在生殖發(fā)育[1,3]、人工養(yǎng)殖[4]、食性組成[5]、遺傳多樣性[6]、種群生物學[2,7]、機體免疫和病害[8-9]等方面開展。然而,關于圓口銅魚營養(yǎng)代謝的研究還處于剛起步階段,目前只是對圓口銅魚全魚、肝臟、肌肉和性腺組織營養(yǎng)成分進行了相關報道[10-13]。在自然條件下,野生圓口銅魚全魚的脂肪含量為7.11%～10.96%,肝臟脂肪含量高達22%,高于大多數(shù)魚類正常水平[12]。董純等[13]發(fā)現(xiàn),圓口銅魚性腺從Ⅱ期到Ⅳ期的發(fā)育過程中,肌肉粗脂肪含量會顯著升高。李學梅等[9]對人工養(yǎng)殖圓口銅魚親本與子代肝臟進行轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-seq)分析發(fā)現(xiàn),差異表達基因(differential expression genes,DEGs)在脂肪酸的消化吸收、代謝、合成通路上顯著富集。從以上結果可以推測,圓口銅魚對脂肪具有較強的蓄積和利用能力,這可能是為其長距離生殖洄游提供必要的能量儲備[14-16]。然而,在人工養(yǎng)殖的條件下,圓口銅魚棲息水環(huán)境變得平穩(wěn)、生殖洄游通道受阻,魚體脂肪不能及時進行轉(zhuǎn)運或消耗,容易引起脂肪過度蓄積導致魚體損傷。

肝臟是魚體脂質(zhì)合成和代謝的中心,維持肝臟的健康對魚體生長、免疫力、應激耐受性等方面都至關重要[17]。本課題組前期研究表明,隨著投飼率的增加,圓口銅魚幼魚肝臟脂肪積累也逐漸增多,且投飼率超過3%會誘發(fā)脂肪肝表型[18]。為此,本研究探討高投飼率導致圓口銅魚脂肪肝形成的原因,旨在為圓口銅魚營養(yǎng)代謝性肝病預防等方面提供科學的理論依據(jù),為圓口銅魚苗種健康培育奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

根據(jù)前期研究結果,圓口銅魚幼魚投飼率超過3%,肝臟脂肪蓄積逐漸增多,并誘發(fā)脂肪肝表型[18],因此本試驗設置2%(對照組)和5%(高投飼率組)2個投飼率(其中5%為表觀飽食投飼率),每組設3個重復,每個重復30尾,以重復為單位養(yǎng)殖于6個圓形玻纖缸培育池內(nèi)。圓形玻纖缸培育池直徑1.0 m,高1.2 m,池底部四周延中央略微下陷,池底中心為排水口,布置有防漏網(wǎng),養(yǎng)殖水深維持在0.7 m,并配備有循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng),每天水體交換量為13 t。試驗魚來自四川省宜賓市向家壩增殖放流站2022年人工繁育的圓口銅魚幼魚。養(yǎng)殖期間,每天08:00和16:00各投喂1次,每2周對試驗魚進行1次稱重,并根據(jù)體重重新調(diào)節(jié)投喂量。循壞水養(yǎng)殖系統(tǒng)水溫為(20.5±1.8) ℃,光照周期為12 h∶12 h,氨氮濃度≤0.1 mg/L,溶解氧濃度≥7.5 mg/L。試驗飼料為山東升索飼料科技有限公司生產(chǎn)的S5型號微粒子配合飼料,主要原料包括:進口特種魚粉、南極磷蝦粉、精制魚油、卵磷脂、氯化膽堿、維生素及類維生素、礦物質(zhì)元素;主要營養(yǎng)成分含量(干物質(zhì)基礎)如下:粗蛋白質(zhì)52.66%,粗脂肪14.33%,淀粉10.60%,水分6.92%,粗灰分12.74%,鈣3.27%,總磷2.07%。

養(yǎng)殖8周后,所有試驗魚饑餓24 h后,進行稱重及計數(shù)。每組隨機撈取12尾魚,經(jīng)100 mg/L 2-苯氧基乙醇(Sigma)麻醉,測量體長和體重后,取肝臟組織,一部分放入4%的多聚甲醛溶液固定,用于蘇木精-伊紅(HE)和油紅O染色,一部分放入液氮快速冷凍,用于轉(zhuǎn)錄組測序、熒光定量表達以及生理生化指標分析。

1.2 指標測定

1.2.1 生長性能指標測定

增重率(weight gain rate,WGR,%)=
100×(終末均重-初始均重)/初始均重;
特定生長率(specific growth rate,SGR,%/d)=
100×(ln終末均重-ln初始均重)/56;
肥滿度(CF,g/cm3)=100×終末體重/
終末體長3;
存活率(survival rate,SR,%)=100×
存活尾數(shù)/30。

1.2.2 肝臟生理生化指標檢測

將肝臟用液氮研磨后,加入9倍體積的磷酸鹽緩沖液(PBS)進行振蕩,4 ℃條件下4 000 r/min離心10 min,取上清液用于生理生化指標測定?？偟鞍?total protein,TP)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、甘油三酯(triglyceride,TG)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、游離脂肪酸(nonesterified fatty acids,NEFA)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)、總膽汁酸(total bile acid,TBA)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、總抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)、還原性谷胱甘肽(reduced glutathione,GSH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、過氧化氫酶(catalase,CAT)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所;活性氧(Reactive oxygen species,ROS)、免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)、免疫球蛋白M(immunoglobulin M,IgM)、免疫球蛋白Z(immunoglobulin Z,IgZ)和溶菌酶(lysozyme,LYS)檢測試劑盒均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。以上指標檢測步驟參考試劑盒說明書。

1.2.3 肝臟組織切片分析

肝臟組織在4%多聚甲醛溶液中固定處理48 h后,經(jīng)過脫水、透明、包埋、切片后進行HE染色。肝臟組織切片油紅O染色參照Wei等[19],切片用油紅O染液染色,經(jīng)60%異丙醇沖洗后,用蘇木精進行復染。將染色后的切片置于光學顯微鏡(DM2500生物顯微鏡,Leica,德國)下觀察拍照,油紅O染色中脂滴的相對面積使用Image J軟件分析。

1.2.4 轉(zhuǎn)錄組測序及基因功能注釋

中國的農(nóng)業(yè)保險起步于1930年代，新中國成立后，又經(jīng)歷了從政府引導到純商業(yè)化運作，再到政策性補貼的衍變，可謂一波三折。李曉林告訴記者，我國的政策性農(nóng)業(yè)保險體系是在“摸著石頭過河”中逐步形成的：2004年，原中國保監(jiān)會選取9個省區(qū)（市）正式啟動政策性農(nóng)業(yè)保險試點工作；2007年，財政部選取6個省區(qū)拿出10億元進行農(nóng)業(yè)保險保費補貼試點；2011年財政部又選取四川省和內(nèi)蒙古自治區(qū)進行農(nóng)業(yè)保險保費補貼績效評價試點工作；2012年，財政部將試點范圍擴大到4個省區(qū)；2013年，農(nóng)業(yè)保險補貼績效評價試點的范圍進一步擴大到了10個省區(qū)，至此，我國政策性農(nóng)業(yè)保險體系初步形成。

根據(jù)肝臟切片的結果,選取無明顯異常肝臟和脂肪肝表型各4個樣品,進行RNA提取。將肝臟組織置于液氮預冷的研缽中,研磨至粉末狀,之后使用RNA Purification Reagent試劑盒(Invitrogen,美國)對肝臟組織總RNA進行抽提,然后通過TruseqTMRNA sample prep Kit(Illumina)試劑盒建庫。采用第2代測序技術,基于Illumina NovaSeq 6000測序平臺,對這些文庫進行雙末端150 bp測序。首先對原始下機數(shù)據(jù)進行過濾,將帶接頭、長度小于50 bp、序列平均質(zhì)量在Q20以下的Reads進行去除,對得到的高質(zhì)量序列用Trinity軟件進行從頭拼接得到Unigene轉(zhuǎn)錄本序列。轉(zhuǎn)錄組的測序工作由上海派森諾生物科技有限公司完成。

采取無參考基因組,對Unigene進行基因功能注釋。功能注釋數(shù)據(jù)庫包括GO(http://geneontology.org/)、KEGG(http://www.kegg.jp/)、eggNOG(http://eggnog.embl.de/version_3.0/)、UniProt(http://www.uniprot.org/help/uniprotkb)。

1.2.5 轉(zhuǎn)錄組DEGs篩選

每個Unigene在樣本中的RPKM(reads per kilobase of exon per million fragments mapped)值作為該轉(zhuǎn)錄本的表達量。轉(zhuǎn)錄本豐度越高,則基因表達水平越高,通過對每個轉(zhuǎn)錄本的表達量進行樣本間差異顯著性分析,獲得DEGs。采用DESeq對基因表達進行差異分析,篩選DEGs條件為:|log2[差異倍數(shù)(FC)]|>1、q<0.05。

轉(zhuǎn)錄因子的預測是與Plant TFDB(https://ngdc.cncb.ac.cn/databasecommons/database/id/307)和Animal TFDB(https://ngdc.cncb.ac.cn/databasecommons/database/id/8)數(shù)據(jù)庫比較,從而預測得到轉(zhuǎn)錄因子以及轉(zhuǎn)錄因子所屬的家族信息。通過|log2(FC)|>2、q<0.05來篩選導致脂肪肝形成的差異表達轉(zhuǎn)錄因子。

1.2.6 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)分析

提取對照組和高投飼率組圓口銅魚肝臟RNA,通過定量PCR(qPCR)對10個DEGs進行驗證,以此評價轉(zhuǎn)錄組測序方法鑒定DEGs的可靠性。依據(jù)說明書,使用HiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit(上海吉真生物科技有限公司)將8個肝臟樣品的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,并以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板,以延長因子1α(elongation factor 1α,EF1α)為內(nèi)參基因,使用AceQ qPCR SYBR Green Master Mix(上海吉真生物科技有限公司),采用CFX96熒光定量PCR儀(Bio-Rad,美國)進行RT-qPCR檢測,引物序列見表1。擴增條件為:95 ℃預變性5 min,然后95 ℃變性10 s,60 ℃退火延伸30 s,循環(huán)40次。每個樣品設3個操作重復,采用2-△△Ct方法計算出各候選基因的mRNA相對表達量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗結果用平均值±標準誤(mean±SE)的方式表示。組間差異及兩者間相關性分別使用SPSS 26.0軟件中獨立樣本t檢驗和線性回歸分析,其中P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著。文中圖片使用GraphPad軟件繪制。

表1 本研究所用的引物序列

2 結果與分析

2.1 高投飼率對圓口銅魚幼魚生長性能的影響

與對照組相比,高投飼率顯著提高圓口銅魚幼魚終末體重、增重率、特定生長率和肥滿度(P<0.05),而對存活率無顯著影響(P>0.05)(表2)。

2.2 高投飼率對圓口銅魚幼魚肝臟生理生化指標的影響

與對照組相比,高投飼率顯著提高圓口銅魚幼魚肝臟TG、TC、NEFA、ALT、AST、AKP和TBA的含量/活性(P<0.05),而對TP和LDL-C含量沒有顯著影響(P>0.05)(表3)。

表2 高投飼率對圓口銅魚幼魚生長性能的影響

2.3 高投飼率對圓口銅魚幼魚肝臟抗氧化和免疫功能的影響

與對照組相比,高投飼率顯著提高圓口銅魚幼魚肝臟ROS、GSH和MDA含量與T-AOC(P<0.05),顯著降低CAT和SOD活性(P<0.05),并且顯著提高IgG、IgM含量和LYS活性(P<0.05)(表4)。與對照組相比,高投飼率顯著上調(diào)圓口銅魚幼魚肝臟促炎因子腫瘤壞死因子α(TNFα)和白細胞介素1β(IL1β)的mRNA相對表達量(P<0.05),而顯著下調(diào)抗炎因子轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGFβ1)的mRNA相對表達量(P<0.05)(圖1)。

表3 高投飼率對圓口銅魚幼魚肝臟生理生化指標的影響

表4 高投飼率對圓口銅魚幼魚肝臟抗氧化和免疫指標的影響

2.4 圓口銅魚幼魚肝臟組織病理分析

通過HE和油紅O染色觀察到2種典型的肝臟表型(圖2):一種是無明顯異常肝臟表型,肝細胞輪廓和細胞核非常清晰,脂滴顆粒和數(shù)量都較少;另一種是脂肪肝表型,肝細胞輪廓和肝索不清晰,肝細胞中明顯有脂質(zhì)的空泡,脂滴顆粒增大和數(shù)量增多(圖2-A)。與無明顯異常肝臟表型相比,脂肪肝表型脂肪蓄積程度顯著加劇(圖2-B)。與對照組相比,高投飼率導致圓口銅魚幼魚脂肪肝出現(xiàn)的比例高達75%(9/12)(圖2-C)。

2.5 轉(zhuǎn)錄組DEGs KEGG通路富集分析

與無明顯異常肝臟表型相比,脂肪肝表型有2 438個基因發(fā)生了顯著變化,其中顯著上調(diào)1 195個,顯著下調(diào)1 243個。通過KEGG富集分析,DEGs主要參與到生物系統(tǒng)(organismal systems,25.95%)、代謝(metabolism,23.32%)、人類疾病(human diseases,27.99%)、細胞過程(cellular processes,6.41%)、環(huán)境信息處理(environmental information processing,10.20%)和遺傳信息處理(genetic information processing,6.12%)6大類以及38小類,共343條代謝通路中(圖3),其中信號轉(zhuǎn)導(signal transduction,29條)、傳染性疾病(infectious disease,29條)、內(nèi)分泌系統(tǒng)(endocrine system,23條)、免疫系統(tǒng)(immune system,22條)、特定類型癌癥(cancer:specific types,17條)、感覺系統(tǒng)(sensory system,15條)、輔助因子和維生素代謝(metabolism of cofactors and vitamins,15條)這7個小類都超過14條代謝通路。圖4表示DEGs富集的前15條KEGG通路主要參與物質(zhì)生物合成與代謝途徑,其中主要富集的通路為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工(protein processing in endoplasmic reticulum,34個DEGs)、過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferators-activated receptor,PPAR)信號通路(PPAR signaling pathway,27個DEGs)、氨基糖和核苷酸糖代謝(amino sugar and nucleotide sugar metabolism,18個DEGs)、甘油酯代謝(glycerolipid metabolism,16個DEGs)、半胱氨酸和蛋氨酸代謝(cysteine and methionine metabolism,16個DEGs)、谷氨酸代謝(glutathione metabolism,15個DEGs)、精氨酸和脯氨酸代謝(arginine and proline metabolism,14個DEGs)、蛋白酶體(proteasome,13個DEGs)、淀粉和蔗糖代謝(starch and sucrose metabolism,12個DEGs)、脂肪酸生物合成(fatty acid biosynthesis,9個DEGs)、類固醇生物合成(steroid biosynthesis,8個DEGs)、萜類化合物生物合成(terpenoid backbone biosynthesis,7個DEGs)。

數(shù)據(jù)柱標注不同小寫字母表示組間有差異顯著(P<0.05)。

A:肝臟組織病理2種表型(比例尺=50 μm),黑色箭頭表示脂滴(LD);B:油紅O染色脂滴相對面積分析,圖中數(shù)據(jù)柱標注不同小寫字母表示組間有差異顯著(P<0.05);C:脂肪肝表型數(shù)量的統(tǒng)計。

圖3 差異表達基因的KEGG分析

2.6 脂質(zhì)代謝DEGs及差異表達轉(zhuǎn)錄因子分析

對與脂質(zhì)代謝相關的DEGs進行分析(圖5),發(fā)現(xiàn)脂肪肝表型中脂合成相關基因,如甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶3(GPAT3)、脂素1(LPIN1)、磷脂磷酸酶1(PLPP1)、脂肪酸合成酶(FASN)、乙酰輔酶A羧化酶1(ACC1)和線粒體?；d體蛋白(ACPM)顯著上調(diào);而脂肪肝表型中脂解相關基因,如含Patatin樣磷脂酶域包含蛋白2(PNPLA2)、單甘油酯脂肪酶(MGLL)、脂蛋白脂肪酶(LPL)、二?；视图っ甫?DGKB)和長鏈脂肪酸乙酰輔酶A連接酶6(ACSL6)顯著下調(diào)。

對DEGs進行篩選得到15個差異表達轉(zhuǎn)錄因子(表5),脂肪肝表型中上調(diào)的轉(zhuǎn)錄因子有8個,分別為芳香烴受體1(AHR1)、雙性和單抗3相關轉(zhuǎn)錄因子2(DMRT2)、泛素蛋白連接酶E3(UHRF1)、DNA J同源B家族11(DNAJB11)、生長抑素b和血小板反應蛋白1型結構域含蛋白(SBSPON)、核因子白細胞介素3調(diào)節(jié)蛋白(NFIL3)、核受體亞家族B0組成員2(NR0B2)和無機焦磷酸酶(PPA),下調(diào)的轉(zhuǎn)錄因子有7個,分別為叉頭蛋白M1(FOXM1)、同源異型盒蛋白(OTPB)、肝性白血病因子(HLF)、核受體亞家族D1組成員1(NR1D1)、Krueppel樣因子9(KLF9)、Krueppel樣因子11(KLF11)和GLIS家族鋅指1(GLIS1)。差異表達轉(zhuǎn)錄因子中AHR1、NR0B2、NR1D1、KLF9和KLF11與脂質(zhì)代謝密切相關,其中AHR1和NR0B2與脂合成相關基因呈正相關,與脂解相關基因呈負相關,可能有利于肝臟脂肪沉積;而NR1D1、KLF9和KLF11與脂合成相關基因呈負相關,與脂解相關基因呈正相關,可能利于肝臟脂肪消耗(圖6)。

圖4 差異表達基因富集的前15條KEGG通路

NL表示無明顯異常肝臟,FL表示脂肪肝。NL represents no abnormality liver, and FL represents fatty liver.

表5 差異表達轉(zhuǎn)錄因子

圖中各基因和轉(zhuǎn)錄因子的中文和英文名稱見圖5和表5。圖中*表示相關性顯著(P<0.05)。

2.7 轉(zhuǎn)錄組測序結果的qPCR驗證

選取10個通過轉(zhuǎn)錄組測序篩選獲得的DEGs進行qPCR驗證,結果發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)錄組測序篩選出的DEGsLPL、LPIN1、1α,25-二羥維生素D3-24-羥化酶(CYP24A1)、維生素D-25-羥化酶(CYP2R1)、聚合酶α催化亞基(POLA1)、DNA連接酶1(LIG1)、增殖細胞核抗原(PCNA)、FOXM1、AHR1和KLF9的變化趨勢與qPCR結果相一致,并且具有顯著相關性(圖7),說明轉(zhuǎn)錄組測序篩選獲得的DEGs結果可靠,可以用于后續(xù)的研究。

A:qPCR檢測基因表達情況,圖中各基因的中文和英文名稱見表1。數(shù)據(jù)用平均值±標準誤差表示。*表示差異顯著(P<0.05),**表示差異極顯著(P<0.01)。B:qPCR數(shù)據(jù)與轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)間的相關性。

3 討 論

圓口銅魚與北極紅點鮭(Salvelinusalpinus)[14]、北鱈(Boreogadussaida)[15]和高首鱘(Acipensertransmontanus)[16]一樣,洄游期間需要消耗機體大量脂肪/能量來完成洄游生活史。因此,野生圓口銅魚魚體各組織脂肪積累可能是為長距離生殖洄游提供能量儲備。然而,在人工養(yǎng)殖的條件下,圓口銅魚棲息水環(huán)境變得平穩(wěn)、生殖洄游通道受阻,魚體脂肪不能及時進行轉(zhuǎn)運或消耗,容易引起脂肪過度蓄積導致魚體損傷。本研究發(fā)現(xiàn),高投飼率雖然顯著提高了圓口銅魚幼魚的生長性能,但75%的圓口銅魚出現(xiàn)了脂肪肝表型,主要表現(xiàn)為肝細胞輪廓和肝索不清晰,大量的脂滴蓄積。魚類脂肪肝是現(xiàn)代集約化養(yǎng)殖業(yè)中常見的疾病,肝臟過度蓄積脂肪會引起代謝紊亂、免疫力降低,危害養(yǎng)殖魚類的生長和健康[20]。飼料能量過剩、蛋能比不合理、高脂、高糖以及過量投喂都會造成肝臟脂肪合成量超過需要量,進而導致脂肪沉積,形成脂肪肝[21-22]。過高的能量攝入是養(yǎng)殖魚類出現(xiàn)脂肪肝的常見原因,在養(yǎng)殖過程中主要是由于投喂量/投飼率過高導致。研究顯示,投飼率從1%提高到3%,草魚(Ctenopharyngodonidellus)幼魚肝臟脂肪含量(濕重)由3.54%上升至15.55%左右[23]。飽食投喂會提高大口黑鱸(Micropterussalmoides)血漿TG、TC和TBA含量以及肝臟脂肪含量,損害肝細胞完整性,誘發(fā)其肝細胞凋亡[24],而在斑馬魚(Daniorerio)[25]、草魚[26]、金鯽魚(Carassiusauratusred var.)[27]和烏蘇里擬鲿(Pseudobagrusussuriensis)[28]中也被證實過多投喂是誘發(fā)魚類脂肪肝的主要原因。在許多魚類中,飽和投喂導致的過剩能量會以脂肪形式在魚體中儲存,特別是在肝臟中蓄積,進而引起魚體肝臟損傷,引發(fā)代謝性肝病[25,29]。本試驗結果與以上研究結果一致,高投飼率顯著提高圓口銅魚幼魚肝臟TG、TC和NEFA含量,導致肝臟脂肪蓄積,而肝臟ALT、AST、AKP活性和TBA含量的升高進一步表明肝臟過多脂肪蓄積導致肝功能損傷。

在正常情況下,肝臟內(nèi)ROS的產(chǎn)生和清除維持著動態(tài)平衡。肝臟過多脂肪蓄積會造成魚體應激反應,引起ROS含量顯著增加,導致魚體氧化損傷[30]。MDA被認為是氧化應激的指標,而SOD和CAT是抗氧化的指標。越來越多的研究表明,脂代謝的紊亂、TG和TC蓄積都可引起強烈的氧化應激[31-32]。在本研究中,高投飼率導致的圓口銅魚幼魚肝臟ROS和MDA含量顯著升高,而SOD和CAT活性顯著下降,這表明高投飼率導致圓口銅魚幼魚肝臟脂肪蓄積會引起氧化應激反應,進而降低肝臟的抗氧化能力。魚體產(chǎn)生過多的ROS也可引起機體炎癥反應,如果肝臟炎癥未被清除,持續(xù)發(fā)展會進一步損傷肝功能,進而誘導細胞凋亡,嚴重會導致凋亡和壞死[33]。本研究發(fā)現(xiàn),高投飼率顯著上調(diào)圓口銅魚幼魚肝臟促炎因子TNFɑ和IL1β的表達,而顯著下調(diào)抗炎因子TGFβ的表達。在本研究中,高投飼率也引起圓口銅魚幼魚肝臟IgG、IgM含量和LYS活性顯著升高,提高了魚體的免疫力,這可能是一種免受氧化應激和炎癥反應損傷的自我保護性機制[34],相似的結果也在大口黑鱸[33]和中華鱘(Acipensersinensis)[35]中被報道。因此,高投飼率易誘導圓口銅魚幼魚肝臟的蓄積,伴隨著氧化應激和炎癥反應,會進一步加劇肝臟的損傷。

轉(zhuǎn)錄因子是一組獨特的DNA結合蛋白,可直接或間接調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄水平參與機體很多生物學過程[39]。本研究在脂肪肝表型中發(fā)現(xiàn),調(diào)控脂質(zhì)代謝的轉(zhuǎn)錄因子AHR1和NR0B2的表達顯著上調(diào),而NR1D1、KLF9和KLF11的表達顯著下調(diào)。肝臟過表達芳香烴受體(AHR)會上調(diào)小鼠肝細胞脂肪酸轉(zhuǎn)位酶(fatty acid translocase,CD36)的表達,促進肝細胞對脂肪酸的攝取,導致脂質(zhì)沉積和肝臟損傷,而抑制或沉默AHR可降低肝臟對脂質(zhì)的攝取和改善肝臟健康[40-41]。高同型半胱氨酸血癥可通過激活AHR/CD36信號通路增加肝細胞對脂質(zhì)的攝取,誘導肝臟脂肪變性[42];激活AHR信號通路可間接誘導大鼠肝細胞的脂滴蓄積[43]。根據(jù)以上結果,推測本研究中高投飼率引起的肝臟AHR1表達上調(diào)可促進肝臟對脂肪吸收并誘導脂肪肝的形成。在肝臟中,NR0B2可通過參與膽固醇降解、膽汁酸生成以及脂肪生成等途徑調(diào)控肝臟脂質(zhì)代謝,過表達NR0B2可引起肝臟脂肪蓄積,而抑制或敲除NR0B2則會改善脂肪肝癥狀[44-45]。NR1D1不僅在調(diào)節(jié)生物鐘過程中發(fā)揮核受體的作用,還可直接調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝[46]。小鼠敲除NR1D1后,可引起肝細胞線粒體含量和氧化功能降低,進而導致脂肪蓄積并伴隨肝纖維化癥狀發(fā)生[47-48]。Solt等[49]通過NR1D1激動劑處理正常小鼠和肥胖小鼠,發(fā)現(xiàn)小鼠骨胳肌CD36和CPT1的表達上調(diào),而硬脂酰輔酶A去飽和酶1(stearoyl-CoA desaturase 1,SCD1)的表達受到抑制,引起體脂含量下降。隨后,Burris[50]和Ramakrishnan等[51]也表明NR1D1與CD36、SCD1和CPT1存在密切聯(lián)系。因此,推測本研究中NR0B2表達上調(diào)和NR1D1表達下調(diào)可誘導肝臟脂肪蓄積。已有研究報道KLF9和KLF11通過招募轉(zhuǎn)錄共抑制因子在脂質(zhì)代謝過程中發(fā)揮調(diào)控作用[52-53]。黃金燦等[54]利用腺病毒在小鼠肝原代細胞和高脂小鼠中都過表達KLF9,發(fā)現(xiàn)過氧化物酶體增殖物激活受體γ共同激活劑1α(peroxisome proliferator activated receptor-gamma coactivator 1α,PGC1α)等脂質(zhì)氧化相關基因的表達水平顯著升高,促進脂質(zhì)氧化,從而改善脂肪肝癥狀。本研究在脂肪肝中發(fā)現(xiàn)KLF9的表達下調(diào),其會導致脂合成增加、脂分解降低,可能與脂肪肝形成有關。陸俊宇等[55]利用腺病毒感染的方法在小鼠肝臟中特異性過表達KLF11,結果可以顯著降低血清和肝臟TG含量,改善肝臟脂肪堆積。Zhang等[56]研究發(fā)現(xiàn),過表達KLF11能夠激活過氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxisome proliferators-activated receptor α,PPARα)信號通路,下調(diào)FAS的表達,提高肝臟脂肪氧化能力,進而抑制脂質(zhì)合成。本研究發(fā)現(xiàn),高投飼率導致KLF11的表達下調(diào),可能會降低肝臟脂肪氧化能力,進而促進肝臟脂肪蓄積。轉(zhuǎn)錄因子與脂質(zhì)代謝相關基因的相關性分析結果進一步表明,AHR1和NR0B2表達上調(diào),NR1D1、KLF9和KLF11表達下調(diào),可促進脂質(zhì)合成、抑制脂質(zhì)分解,利于肝臟脂肪沉積,最后導致脂肪肝形成。

4 結 論

本研究結果表明,高投飼率引起圓口銅魚幼魚肝臟脂質(zhì)合成增加、脂質(zhì)分解降低,從而導致肝臟脂肪蓄積,最終誘導脂肪肝的形成,并引發(fā)氧化應激和炎癥反應,加劇肝臟的損傷;此外,圓口銅魚幼魚脂肪肝的形成與轉(zhuǎn)錄因子AHR1和NR0B2存在正相關,與轉(zhuǎn)錄因子NR1D1、KLF9和KLF11存在負相關。