劉開(kāi)輝, 劉 月, 陳 妮, 丁小維, 張智維, 劉婉婷

(陜西科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院, 陜西 西安 710021)

0 引言

芽孢桿菌(Bacillus)屬于厚壁菌門(mén),芽孢桿菌科,芽孢桿菌屬的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌[1].這類(lèi)微生物廣泛存在于土壤、植物體內(nèi)、動(dòng)物腸道、空氣以及水體等環(huán)境中,具有抗逆性強(qiáng),營(yíng)養(yǎng)要求簡(jiǎn)單,繁殖速度快且穩(wěn)定性強(qiáng)等特性[2,3],多數(shù)菌株具有固氮、解磷、解鉀等生物活性[4],有利于提高作物產(chǎn)量,一些被開(kāi)發(fā)為微生物菌劑已廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、食品發(fā)酵、生命健康及環(huán)境修復(fù)等方面[5-7],并發(fā)揮重要作用.

植物根際芽孢桿菌在促進(jìn)植物生長(zhǎng)、預(yù)防植物病害和增強(qiáng)宿主抗逆性方面具有重要作用[8].這類(lèi)細(xì)菌能在植物根際長(zhǎng)期定殖,釋放多種植物激素、抗菌酶、抗菌肽以及其它活性物質(zhì)調(diào)控植物生長(zhǎng)和保護(hù)宿主免受病原菌的侵害[9-11].例如,Goswami等[12]從耐鹽植物Suaedafruticosa的根際分離的地衣芽孢桿菌B.licheniformisA2能促進(jìn)花生耐滲透脅迫.Hou等[13]發(fā)現(xiàn)玉米根際芽孢桿菌B.atrophaeusWZYH01能促進(jìn)玉米生長(zhǎng),該菌株有利于宿主吸收K+.李虹梅等[14]報(bào)道了貝萊斯芽孢桿菌B.velezensisMC2-1基因組序列,發(fā)現(xiàn)該菌株基因組編碼可分解植物病原真菌細(xì)胞壁組分的功能酶以及多個(gè)參與抗菌物質(zhì)合成的基因簇.以前的研究表明,挖掘植物根際芽孢桿菌對(duì)開(kāi)發(fā)新型生物菌肥、生防菌劑具有重要意義.

本研究從陜西省花馬鹽湖區(qū)鹽蒿根際中分離出一株植物耐鹽促生芽孢桿菌A-1,經(jīng)鑒定該菌株屬于芽孢桿菌B.swezeyi.通過(guò)拮抗試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)A-1菌株對(duì)油菜黑脛病(Leptosphaeriabiglobosa)具有良好的抑制效果.全基因組測(cè)序及功能分析發(fā)現(xiàn),該菌株具合成多種抗菌活性物質(zhì)的基因簇,具有編碼水解病原真菌細(xì)胞壁的功能酶基因和合成IAA的相關(guān)基因.本研究為芽孢桿菌B.swezeyi的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

菌株和供試植物:菌株A-1分離自鹽蒿根際土壤,該菌株已保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(保藏號(hào):CGMCC25411).油菜黑脛病由陜西科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保藏.供試油菜種子購(gòu)買(mǎi)于陜西楊凌種子產(chǎn)業(yè)園.

培養(yǎng)基:PDA培養(yǎng)基(g/L):馬鈴薯200.0,葡萄糖20.0,瓊脂18.0;LB培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10.0,酵母提取物5.0,NaCl 10.0;TGY培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨5.0,酵母提取物2.5,葡萄糖1.0,瓊脂15.0.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株A-1細(xì)胞的掃描電子顯微鏡觀(guān)察

菌株A-1在LB液體培養(yǎng)基中30 ℃、160 r/min培養(yǎng)至OD600為0.8,8 000 r/min離心5 min 收集菌體,用2.5%戊二醛固定液固定2 h,用50%～100%乙醇梯度溶液對(duì)固定的細(xì)胞進(jìn)行洗滌脫水,再用乙酸異戊酯置換2次,經(jīng)10 000 r/min離心5 min后,菌體置于冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行冷凍干燥,最后取少許干燥細(xì)胞于硅片碳導(dǎo)電膠上,離子濺射金后,利用掃描電子顯微鏡(Applied Biosystems公司)對(duì)細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀(guān)察.

1.2.2 菌株A-1的16S rRNA基因擴(kuò)增及序列分析

提取細(xì)菌基因組DNA,使用細(xì)菌鑒定16S rRNA基因序列的通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)對(duì)其擴(kuò)增.PCR擴(kuò)增體系:2×Taq Master Mix 10 μL,27F/1492R引物(10 μmol/L)各1 μL,DNA模板1 μL,ddH2O補(bǔ)至20 μL.PCR擴(kuò)增條件:95 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性40 s,55 ℃退火30 s,72 ℃擴(kuò)增1.5 min,30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min.PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后送至生物公司進(jìn)行雙向測(cè)序,所得序列在NCBI中進(jìn)行比對(duì),下載同源序列,利用MEGA 4.0軟件Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù).

1.2.3 菌株A-1對(duì)油菜的促生研究

挑取菌株A-1單菌落接種至LB液體培養(yǎng)基中,于30 ℃、160 rpm搖床中培養(yǎng)24 h,離心收集菌體,加無(wú)菌水稀釋成1×108CFU/mL的菌懸液備用.挑選飽滿(mǎn)均勻的油菜種子,用10% NaClO溶液對(duì)種子浸泡消毒15 min,用無(wú)菌水洗滌5～6次.20 mL(120 mM/L)鹽溶液同100 g營(yíng)養(yǎng)土混勻,置于聚乙烯瓶中滅菌.試驗(yàn)組消毒種子接種A-1菌懸液(對(duì)照組未接菌劑),混勻后種植于上述滅菌土中,放于恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(18 ℃～20 ℃、光暗周期16 h/8 h、光照強(qiáng)度18 000 Lux).各組試驗(yàn)分別進(jìn)行6次生物學(xué)重復(fù).培養(yǎng)21天測(cè)定植株株高、根長(zhǎng)及鮮重生物量.

1.2.4 抗菌活性研究

以油菜黑脛病為供試菌株,在PDA上進(jìn)行平板生測(cè)并計(jì)算菌絲的抑制率.病原菌重復(fù)6次拮抗試驗(yàn),設(shè)不接種A-1的空白對(duì)照,于培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)7 d.

1.2.5 基因組DNA測(cè)序分析

挑取A-1菌株單菌落,提取高質(zhì)量基因組DNA,利用Nanodrop、Qubit 4.0熒光計(jì)和0.35%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后,委托商業(yè)公司通過(guò)Nanopore和Illumina Nova Seq 6000平臺(tái)對(duì)菌株A-1進(jìn)行全基因組測(cè)序.使用Unicycler軟件[15]對(duì)有效數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝,采用Glimmer3[16]分析編碼基因,通過(guò)軟件(tRNAscan-SE、rRNAmmer及cmsearch)預(yù)測(cè)tRNA、rRNA及sRNA[17-19].利用RepeatMasker預(yù)測(cè)基因重復(fù)序列[20].在NR、Swiss-prot、KEGG、GO等數(shù)據(jù)庫(kù)中完成基因功能注釋.利用antiSMASH分析菌株的次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因簇[21].

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株A-1的分類(lèi)鑒定

菌株A-1在TGY固體培養(yǎng)基上,菌落呈乳白色,表面干燥、不光滑、褶皺、隆起,如圖1(a)所示;在掃描電鏡下觀(guān)察到菌株A-1的形態(tài)為黏連桿狀,上下兩端呈圓弧狀,平均大小為(0.3～0.5)～(0.6～1.5)μm,如圖1(b)所示.該菌株VP試驗(yàn)、接觸酶試驗(yàn)陽(yáng)性,甲基紅試驗(yàn)、檸檬酸鹽試驗(yàn)為陰性,該菌株產(chǎn)生IAA,能利用淀粉、葡萄糖、山梨醇及甘露糖,但不能利用乳糖.對(duì)菌株A-1的16S rRNA基因序列進(jìn)行同源性比對(duì),其16S rRNA基因同NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中芽孢桿菌(Bacillus)多個(gè)種的相似性在99%～100%之間.NJ系統(tǒng)發(fā)育分析顯示(圖1(c)),該菌株與已報(bào)道的Bacillusswezeyi(NR_157608)親緣性高達(dá)99%,在進(jìn)化樹(shù)中聚于同一個(gè)分支,步長(zhǎng)值為100%.結(jié)合形態(tài)學(xué)、生理生化特征及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系,菌株A-1被鑒定為芽孢桿菌B.swezeyi.

2.2 菌株A-1對(duì)油菜的耐鹽促生作用

在鹽脅迫下,菌株A-1對(duì)油菜生長(zhǎng)的影響如圖2所示.接種菌株A-1的油菜長(zhǎng)勢(shì)旺盛、葉片肥厚、根系發(fā)達(dá)(圖2(a)).與對(duì)照組相比,A-1菌液灌根處理的油菜植株根長(zhǎng)、株高和鮮重分別增加了42.35%、27.24%和105.61%(圖2(b)和圖2(c)),由此可見(jiàn),菌株A-1提高了油菜對(duì)鹽堿脅迫的抗性,并促進(jìn)其生長(zhǎng).

圖2 菌株A-1對(duì)油菜幼苗的耐鹽促生作用

2.3 抗菌活性研究

抗菌活性研究發(fā)現(xiàn)(圖3),油菜黑脛病在PDA上菌落呈灰白色,菌絲粗壯、菌絲體發(fā)達(dá)(圖3(a)和圖3(b));拮抗試驗(yàn)(圖3(c)和圖3(d))發(fā)現(xiàn),芽孢桿菌A-1顯著抑制油菜黑脛病菌絲的生長(zhǎng)(抑制率為88.06%),其菌絲多處出現(xiàn)不規(guī)則球狀膨大的畸形結(jié)構(gòu),膨大部分易破裂并釋放出細(xì)胞內(nèi)容物.這些結(jié)果表明,菌株A-1可能產(chǎn)生活性物質(zhì)抑制該病原菌菌絲生長(zhǎng),并引起細(xì)胞溶解死亡.

圖3 菌株A-1對(duì)病原菌的拮抗作用

2.4 菌株A-1基因組測(cè)序及組裝分析

B.swezeyiA-1全基因組測(cè)序及組裝最終得到一條完整的線(xiàn)性基因組序列,長(zhǎng)度為4 591 993 bp,GC含量為44.39%,測(cè)序精確度為99.962%,編碼4 948個(gè)基因,編碼基因平均長(zhǎng)度811.11 bp,編碼區(qū)總長(zhǎng)度占基因組的87.40%.基因組預(yù)測(cè)到85個(gè)tRNA、24個(gè)rRNA和38個(gè)sRNA,9個(gè)散在重復(fù)序列和91個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列(表1和圖4).菌株A-1和B.swezeyiCH43_1T(GCA_008180465.1)基因組同源性為97.2%.B.swezeyiA-1基因組數(shù)據(jù)提交至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù),登錄號(hào)為SRR21869158.

表1 A-1全基因組信息

圖4 基因組圈圖(由外至內(nèi):基因組大小,正向鏈上蛋白編碼基因,反向鏈上蛋白編碼基因,正向鏈上tRNA(黑色)和rRNA(紅色)基因,反向鏈上tRNA(黑色)和rRNA(紅色)基因,GC含量,GC-skew值)

2.5 基因組的功能注釋

B.swezeyiA-1基因組序列分別在NCBI的NR、KEGG、Swissprot及COG數(shù)據(jù)庫(kù)中分別注釋了4 365、4 330、3 758和3 594個(gè)編碼基因.比對(duì)到B.swezeyiCH43_1T菌株基因數(shù)最多(3 892個(gè)).GO功能注釋發(fā)現(xiàn),分子功能(molecular function)共注釋1 842個(gè)基因,生物過(guò)程(biological process)注釋1 638個(gè)基因,細(xì)胞組分(cellular component)注釋593個(gè)基因.KEGG富集分析發(fā)現(xiàn),共4 330個(gè)編碼基因富集到209條代謝通路中,主要包括雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)(two-component system)、氨基酸的生物合成(biosynthesis of amino acids)、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ABC transporters)、碳代謝(carbon metabolism)和細(xì)菌群體感應(yīng)(quorum sensing)等.

2.6 拮抗物質(zhì)分析

在B.swezeyiA-1基因組中發(fā)現(xiàn)14個(gè)次級(jí)代謝產(chǎn)物合成相關(guān)基因簇,其中7個(gè)基因簇參與合成多烯類(lèi)(bacillaene)、丁酰苷菌素(butirosin)、抗霉枯草菌素(mycosubtilin)、豐原素(fengycin)和兒茶酚型嗜鐵素(bacillibactin)等多種抗菌化合物(表2).Cluster 1與BGC0001089來(lái)源的多烯類(lèi)合成基因簇相似性為100%;Cluster 9與BGC0000310來(lái)源的桿菌肽合成基因簇相似性為100%;Cluster14與BGC0000527來(lái)源的mersacidin合成基因簇相似性為100%;Cluster 6與BGC0000195來(lái)源的豐原素合成基因簇相似性為93%.兒茶酚型嗜鐵素可以競(jìng)爭(zhēng)性?shī)Z取真菌生長(zhǎng)所需的鐵離子[22].豐原素(屬于環(huán)脂肽)能穿透細(xì)胞膜并形成離子孔道,導(dǎo)致細(xì)胞死亡,對(duì)植物病原真菌具有強(qiáng)烈的抑制活性[23].菌株A-1基因組中存在7種功能未知的基因簇(Cluster2、4、7、8、10、11和13),這些可能參與其他新抑菌物質(zhì)的生物合成.此外,B.swezeyiA-1基因組還中存在多個(gè)編碼幾丁質(zhì)水解酶、幾丁質(zhì)脫乙酰酶及葡聚糖苷酶的功能基因(表3),這些酶能催化真菌細(xì)胞壁的水解[24],在拮抗植物真菌感染方面具有重要作用.

表2 菌株A-1次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因簇

表3 菌株A-1功能基因注釋結(jié)果

續(xù)表3

菌株A-1基因組中存在生物膜合成有關(guān)的基因(abrB,sigW,sinI,sinR和spo0A)、吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因(yhcX,dhaS和patB)(表3).生物膜的形成是影響菌株在植物根際的長(zhǎng)期定殖的關(guān)鍵因素[25],其中Spo0A是枯草芽孢桿菌生物膜發(fā)育形成的關(guān)鍵基因[26].yhcX,dhaS和patB參與吲哚-3-乙酸(IAA)的生物合成[27],調(diào)節(jié)植物激素水平、提高抗逆性[10].由此說(shuō)明,菌株A-1通過(guò)形成生物膜和合成吲哚-3-乙酸調(diào)控其在宿主植物根際定殖并促進(jìn)植株生長(zhǎng).

3 結(jié)論

本研究對(duì)芽孢桿菌A-1進(jìn)行分類(lèi)鑒定,該菌株屬于B.swezeyi.菌株A-1導(dǎo)致蔬菜黑脛病菌絲畸形生長(zhǎng)和細(xì)胞溶解,對(duì)植株具有耐鹽促生作用.全基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn),該菌株基因組具有合成多烯類(lèi)、丁酰苷菌素、抗霉枯草菌素、豐原素和兒茶酚型嗜鐵素等多種抗菌活性物質(zhì)的基因簇以及編碼水解真菌細(xì)胞壁的幾丁質(zhì)水解酶、葡聚糖苷酶等.此外,該菌株能編碼生物膜合成和吲哚-3-乙酸合成相關(guān)基因.本研究表明B.swezeyiA-1在生物菌肥開(kāi)發(fā)以及生防領(lǐng)域具有重要應(yīng)用前景.