龔 頻, 岳 山, 王小娟, 楊文娟, 姚文博, 陳福欣

(1.陜西科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院, 陜西 西安 710021; 2.西安科技大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院, 陜西 西安 710054)

0 引言

蛹蟲(chóng)草是一種人工培養(yǎng)的藥食同源真菌,早在5世紀(jì)便被廣泛使用,蛹蟲(chóng)草本身含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分,包括核苷類、多糖類、糖醇、甾醇類以及SOD酶在內(nèi)的多種有效成分,具有鎮(zhèn)靜催眠、提高機(jī)體免疫力、抗腫瘤、防止衰老、保護(hù)心肺組織等多種藥理作用[1],還有研究表明蛹蟲(chóng)草活性功能物質(zhì)在調(diào)節(jié)機(jī)體的各項(xiàng)生理機(jī)能和強(qiáng)身健體等方面都有著顯著的功效[1,2].有充分的研究表明蛹蟲(chóng)草與冬蟲(chóng)夏草具有相似的功能和藥效[1-3].蛹蟲(chóng)草作為一味使用歷史悠久的傳統(tǒng)中藥之一,在藥學(xué)研究中具有很大的藥用價(jià)值,現(xiàn)代科學(xué)對(duì)其研究越來(lái)越多,涉及到蛹蟲(chóng)草中的蟲(chóng)草多糖、蟲(chóng)草素、腺苷類等有效成分[3,4],但對(duì)蛹蟲(chóng)草蛋白的研究較少.對(duì)人工栽培的蛹蟲(chóng)草的成分進(jìn)行分析,表明人工培養(yǎng)的蛹蟲(chóng)草中蛋白質(zhì)含量在30%左右,脂肪含量在8%,是一種高蛋白低脂肪的滋補(bǔ)佳品,一種優(yōu)秀的蛋白補(bǔ)充劑,具有良好的開(kāi)發(fā)前景[5-7].

堿提酸沉法是最常用的提取蛋白質(zhì)的方法,利用的原理是植物蛋白易溶于堿性環(huán)境,在酸性等電點(diǎn)條件下析出.堿提酸沉法的優(yōu)點(diǎn)是蛋白質(zhì)的提取率和純度都較高,易操作,成本低;缺點(diǎn)是過(guò)高濃度的堿液會(huì)使部分提取出的蛋白質(zhì)產(chǎn)生不可逆的變性,使得營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的降低.但通過(guò)酶解生成生物活性肽可恢復(fù)其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,與蛋白質(zhì)相比生物活性肽具有更加良好的理化性質(zhì)、良好的水合性質(zhì)以及更高的生物利用度[8,9].蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)酶解成為小分子多肽后,隨著蛋白質(zhì)中氨基和羰基的暴露使得酶解后的多肽電荷分布改變,使得表面親水基團(tuán)增多,溶解性增大[10,11].同時(shí)人體處于水環(huán)境因此蛋白質(zhì)水解為多肽能顯著增加人體對(duì)多肽的吸收速度,提高蛋白質(zhì)的生物利用度,同時(shí)多肽相較于蛋白質(zhì)有更高的活性與多樣性,無(wú)論在吸收還是生物學(xué)功能上都有著顯著的優(yōu)勢(shì)[12].

本研究以蛹蟲(chóng)草作為原料,采用堿提酸沉法從蛹蟲(chóng)草中提取蛋白質(zhì)、確定最佳提取條件.通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)與響應(yīng)面分析確定蛹蟲(chóng)草蛋白提取的溫度、pH 值、料液比等最優(yōu)工藝指標(biāo),并分別針對(duì)蛹蟲(chóng)草多肽的體外抗氧化活性進(jìn)行測(cè)定與研究,以期為蛹蟲(chóng)草蛋白的深加工以及生物活性肽的制備提供參考.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)原料

蛹蟲(chóng)草超微粉,(經(jīng)過(guò)超微粉碎后過(guò)300目篩);牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品,北京奧博星生物技術(shù)有限公司;

實(shí)驗(yàn)藥品:考馬斯亮藍(lán)G250,上海源葉化學(xué)試劑有限公司;NaOH、無(wú)水乙醇、HCL、甲醛、三氯乙酸、雙氧水、鐵氰化鉀,天津市天力化學(xué)試劑有限公司,分析純.

實(shí)驗(yàn)儀器:Varioskan fiash全波長(zhǎng)掃描式多功能讀數(shù)酶標(biāo)儀,賽默飛世爾科技有限公司;HGZF-101-2型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱,上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司;FD-1D-50型真空冷凍干燥機(jī),無(wú)錫郎寧儀器制造有限公司;MODEL808型pH計(jì),美國(guó)奧麗龍公司;HH-2型電熱恒溫水浴鍋,金壇市江南儀器廠.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蛹蟲(chóng)草蛋白的提取

稱取蛹蟲(chóng)草粉末2.00 g放入燒杯中,按照一定料液比加入去離子水,攪拌均勻,使蛹蟲(chóng)草粉末與水充分接觸混合.滴加1 mol/L的氫氧化鈉溶液,調(diào)節(jié)pH到最適提取酸堿度.然后放入一定溫度的水浴鍋中水浴浸提一段時(shí)間,抽率取上清液,取用1 mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)pH值至等電點(diǎn),常溫靜止一段時(shí)間,8 000 r/min離心20 min去掉上清液,獲得蛋白,用少量去離子水溶解蛋白并轉(zhuǎn)移至平皿中,冷凍干燥得到粗蛋白[13].

1.2.2 等電點(diǎn)測(cè)定

蛹蟲(chóng)草蛋白粗提液用0.1 mol/L的鹽酸溶液調(diào)節(jié)其pH,在pH計(jì)的幫助下設(shè)計(jì)從3至5共10個(gè)點(diǎn)位分別為3、3.3、3.6、3.8、4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.在5 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離20 min,得粗蛋白質(zhì)沉淀,冷凍干燥后稱重[14].

1.2.3 蛋白質(zhì)提取工藝優(yōu)化

(1)單因素實(shí)驗(yàn)

取2 g蛹蟲(chóng)草超微粉末于燒杯中,分別以料液比(1∶12、1∶14、1∶16、1∶18和1∶20 g/mL)、體系pH(8、9、10、11、12、13)、提取時(shí)間(60、90、120、150、180 min)三個(gè)因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn),在研究某一因素時(shí),其他因素固定不變,以蛋白質(zhì)得率為指標(biāo)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)研究分析.

(2)Box-Behnken 實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,確定三因素三水平的最佳參數(shù)進(jìn)行響應(yīng)面分析[14-16].

1.2.4 蛋白質(zhì)酶的篩選

選取胃蛋白酶(37 ℃ pH 2)、木瓜蛋白酶(52 ℃ pH 6.5)、堿性蛋白酶(50 ℃ pH 8.0)三種酶,分別將其置于最適的酶解條件對(duì)提取的蛹蟲(chóng)草粗蛋白進(jìn)行酶解,通過(guò)甲醛滴定法測(cè)定酶解液中多肽的相對(duì)含量,以此判斷每種酶的酶解效果[12,17].

1.2.5 酶解工藝流程

準(zhǔn)確稱量蛹蟲(chóng)草粗蛋白0.50 g,用蒸餾水調(diào)節(jié)底物濃度使料液比為1∶100,加入50 mL的蒸餾水.調(diào)節(jié)溶液酸堿度使得溶液pH值到蛋白酶最適pH,水浴溫度調(diào)節(jié)到各蛋白酶的最適溫度,加入等體積的蛋白酶(10% m/M),混合均勻后,酶解12 h,水解完成后沸水浴滅活10 min,即得到蛹蟲(chóng)草蛋白的多肽水溶液[18,19].

1.2.6 抗氧化活性研究

(1)總還原力比較

分別取高、中、低(2 mg/mL、4 mg/mL、6 mg/mL)三種濃度的蛹蟲(chóng)草多肽提取液和蛋白質(zhì)溶液1 mL于試管中,依次加入2.50 mL pH 7.0的磷酸緩沖液、2.50 mL鐵氰化鉀溶液和1.50 mL蒸餾水混合均勻,在50 ℃的 條件下反應(yīng)20 min,冷卻后加入2.50 mL的三氯乙酸(蛋白質(zhì)溶液中加入2.50 mL蒸餾水),3 000 r/min條件下離心10 min,取上清液2.50 mL,再加入2.50 ml蒸餾水和0.50 mL三氯化鐵溶液,混合均勻后放置10 min.在波長(zhǎng)為700 nm處測(cè)量其吸光值[20,21].

(2) DPPH自由基清除力的比較

分別取高、中、低(6 mg/mL、4 mg/mL、2 mg/mL)三種濃度梯度的蛹蟲(chóng)草多肽提取液和蛋白質(zhì)溶液1 mL于試管中,添加1.50 mL的DPPH乙醇溶液.充分混勻后在室溫下反應(yīng)30 min.在527 nm處測(cè)量紫外吸收值,進(jìn)行比較[22].DPPH自由基的清除率為:

(1)

式(1)中:A1:DPPH溶液+待測(cè)液的吸光度;A2:95%的乙醇+待測(cè)液的吸光度;A3:DPPH溶液+蒸餾水的吸光度.

(3)羥自由基清除率

分別取高、中、低(6 mg/mL、4 mg/mL、2 mg/mL)三種濃度的蛹蟲(chóng)草多肽提取液和蛋白質(zhì)溶液1 mL于試管中,分別加入2 mL FeSO4溶液和2 mL的水楊酸-乙醇溶液,加入1 mL的H2O2啟動(dòng)反應(yīng),讓其置于37 ℃的水浴中反應(yīng)30 min,待其冷卻于510 nm處測(cè)其吸光值[23,24].羥自由基清除率為:

(2)

式(2)中:A1:H2O2+待測(cè)樣品的吸光度;A2:H2O+待測(cè)樣品的吸光度;A3:H2O2+蒸餾水的吸光度.

1.3 分析方法

1.3.1 蛋白質(zhì)檢測(cè)

Bradford檢測(cè)法

將提取液稀釋一定的倍數(shù),取稀釋液1 mL,加入5 mL考馬斯亮藍(lán)G-250溶液溶液,充分混勻后常溫下反應(yīng)10 min后,在波長(zhǎng)為595 nm處測(cè)得其光吸收,計(jì)算蛋白質(zhì)濃度.

1.3.2 甲醛滴定法

取2.50 mL的中性水解液,加入2.50 mL 10%的三氯乙酸,靜置10 min,在4 000 r/min的條件下離心15 min,取上清液5 mL,加入5滴30%的雙氧水,加入0.20 mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至pH 7,再用于0.02 mol/L氫氧化鈉滴定pH 8.1,加入10 mL的三氯甲醛溶液,靜置10 min,測(cè)量溶液pH,再用0.02 mol/L的氫氧化鈉緩慢地均勻滴定至溶液pH濃度等于8.1,并詳細(xì)記錄消耗的各種氫氧化鈉及其溶液的用量[18].

(3)

式(3)中:V:為待測(cè)液消耗標(biāo)準(zhǔn)NaOH的體積;C:標(biāo)準(zhǔn)NaOH的摩爾濃度.

所有數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)試驗(yàn)平均值±標(biāo)準(zhǔn)差,使SPSS19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,GraphPad 8.0.2進(jìn)行繪圖,使用 Design-Expert8.0.6 進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì).

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的測(cè)定

蛋白質(zhì)是帶有正負(fù)電荷的兩性電解質(zhì),蛋白質(zhì)處于等電點(diǎn)時(shí),其凈電荷為零,由于相鄰蛋白質(zhì)分子之間沒(méi)有靜電斥力而趨于聚集沉淀.因此在其他條件相同時(shí),它的溶解度達(dá)到最低點(diǎn).由圖1可知,當(dāng)pH為4.4時(shí),粗蛋白質(zhì)量為201.10±2 mg,達(dá)到最大值,蛋白提取液中沉降下來(lái)的粗蛋白質(zhì)量最高,粗蛋白質(zhì)得率達(dá)到最大值,由此可推斷出蛹蟲(chóng)草蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)在4.4.

圖1 蛹蟲(chóng)草蛋白質(zhì)沉淀點(diǎn)測(cè)定

2.1.2 料液比對(duì)蛋白質(zhì)提取的影響

由圖2可知,隨料液比的增大,蛹蟲(chóng)草蛋白質(zhì)的得率也增加,當(dāng)料液比為1∶18時(shí),蛋白質(zhì)的提取率達(dá)到最大值9.17%.這是因?yàn)楫?dāng)料液比增大時(shí),蛹蟲(chóng)草粉末與溶液接觸面積增大,加速了蛋白質(zhì)溶出,當(dāng)溶液體積達(dá)到一定量時(shí),可溶性雜志增多,降低蛋白質(zhì)對(duì)溶劑的親和力,降低了提取率.因此,確定最適的料液比為1∶18.

圖2 料液比對(duì)蛹蟲(chóng)草蛋白提取得率的影響

2.1.3 pH對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響

由圖3可知,隨著體系pH的提高,蛹蟲(chóng)草蛋白的得率逐漸變大,當(dāng)pH為12時(shí)蛹蟲(chóng)草蛋白的得率達(dá)到最大值10.01%±0.2%.這是因?yàn)橛枷x(chóng)草蛋白的溶解性,隨著溶液體系pH的增加而增大,當(dāng)體系pH達(dá)到12時(shí),蛋白質(zhì)得率基本穩(wěn)定.因此,蛹蟲(chóng)草蛋白提取的最適為pH 12.

圖3 pH對(duì)蛹蟲(chóng)草蛋白得率的影響

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)得率的影響

由圖4可知,蛹蟲(chóng)草粗蛋白得率,隨著提取時(shí)間增加而增大,150 min時(shí)達(dá)到最大值.是因?yàn)樵谔崛〉某跗谟捎谔崛r(shí)間較短,蛹蟲(chóng)草粉末未充分與溶液接觸,蛋白質(zhì)沒(méi)有完全析出.隨著提取時(shí)間的增加蛋白提取率逐漸趨于平穩(wěn).

圖4 提取時(shí)間對(duì)蛹蟲(chóng)草蛋白得率的影響

2.2 響應(yīng)面分析法優(yōu)化提取工藝

基于單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果擬確定的最佳條件,選取浸提時(shí)間、pH、和料液比三個(gè)條件進(jìn)行Box-Behnken 實(shí)驗(yàn),三個(gè)因素分別以A、B、C代替,每個(gè)變量的低、中、高,試驗(yàn)水平編碼分別為-1、0、1,如表1所示.

表1 試驗(yàn)因素水平及編碼

根據(jù)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn),試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果如表2所示.

表2 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果

對(duì)表2中的數(shù)據(jù)分析得到蛋白提取液中蛋白質(zhì)濃度試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合,獲得提取液中蛋白質(zhì)濃度對(duì)編碼自變量的二次元多項(xiàng)回歸模型如式(4)所示:

Y=5.32+0.23A+0.11B+0.2C-0.053AB+
0.3AC-0.16BC-0.85A2-0.83B2-0.26C2

(4)

表3 蛋白質(zhì)濃度回歸方程顯著性檢驗(yàn)

等高線圖和曲面圖能夠直觀地反映出不同因素之間的交互作用及其對(duì)響應(yīng)值的影響.由圖5可知,提取時(shí)間(A)與料液比(C)之間的交互作用對(duì)蛋白質(zhì)提取率影響最大,其次是提取時(shí)間(A)與pH(B)的交互作用,而pH(B)與料液比(C)的交互作用最小.

圖5 因素交互作用等高線圖和曲面圖

2.3 酶解實(shí)驗(yàn)

分別使胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶處于最適的酶解條件下酶解蛹蟲(chóng)草蛋白.通過(guò)滴定液的消耗量判斷-NH2與甲醛結(jié)合釋放的H+的量,判斷對(duì)蛹蟲(chóng)草蛋白水解效果最好的酶,三種蛋白酶消耗的滴定液的量如表4所示.由表可以看出,當(dāng)三種蛋白酶均處于自身最適酶解條件時(shí),堿性蛋白酶水解得到的蛹蟲(chóng)草多肽溶液中-NH2與甲醛結(jié)合后釋放的H+的量最多,說(shuō)明堿性蛋白酶對(duì)蛹蟲(chóng)草蛋白水解效果相較于胃蛋白酶和木瓜蛋白酶效果更好,胃蛋白酶和木瓜蛋白酶水解能力相當(dāng).因此選用堿性蛋白酶作為水解蛹蟲(chóng)草蛋白的主要水解酶.

表4 甲醛滴定法測(cè)水解液中氨基氮含量

2.4 體外抗氧化實(shí)驗(yàn)

2.4.1 總還原力變化

由圖6可知,酶解法制備的蛹蟲(chóng)草多肽高、中、低濃度均具有一定的還原力,且還原力普遍高于同等濃度下的蛹蟲(chóng)草粗蛋白.蛹蟲(chóng)草多肽的還原力隨著濃度的升高而上升,具有明顯的濃度依附性.蛹蟲(chóng)草粗蛋白的總還原性隨濃度變化不明顯.

圖6 蛹蟲(chóng)草蛋白與蛹蟲(chóng)草多肽還原力比較

2.4.2 DPPH清除率比較

由圖7 可知,蛹蟲(chóng)草蛋白與其酶解多肽相比較,同等濃度下蛹蟲(chóng)草多肽的DPPH清除率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于蛹蟲(chóng)草蛋白質(zhì),是蛹蟲(chóng)草蛋白的3～4倍.蛹蟲(chóng)草多肽的DPPH自由基清除率隨著濃度的增加而不斷增加.

圖7 蛹蟲(chóng)草蛋白與蛹蟲(chóng)草多肽DPPH清除率比較

2.4.3 羥自由基清除率

由圖8可知,酶解法制備的蛹蟲(chóng)草多肽高、中、低濃度對(duì)羥自由基都有明顯的清除作用,且對(duì)-OH的清除率普遍高于同等濃度下的蛹蟲(chóng)草粗蛋白.蛹蟲(chóng)草-OH清除率隨著濃度的升高而上升,具有明顯的濃度依附性.

圖8 蛹蟲(chóng)草蛋白與多肽羥自由基清除率比較

3 結(jié)論

研究結(jié)果表明,通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)與響應(yīng)面分析得到,堿提酸沉法提取蛹蟲(chóng)草蛋白的最佳工藝為,提取時(shí)間144 min,最適酸堿度為pH 12.01,最適料液比為1∶19.通過(guò)單一酶水解法制備蛹蟲(chóng)草多肽,使三種酶都處于其最適條件下進(jìn)行反應(yīng),通過(guò)甲醛滴定法證明堿性蛋白酶為最適的蛹蟲(chóng)草水解酶.通過(guò)體外抗氧化活性的測(cè)定,比較蛹蟲(chóng)草蛋白及其酶解產(chǎn)物的活性變化,證明蛹蟲(chóng)草蛋白酶解產(chǎn)物具備更好的體外抗氧化活性,為蛹蟲(chóng)草蛋白的深加工以及生物活性肽的制備提供參考.