高小麗,何海濤,王 啟,姚翔媚,秦 濤,張海溪,趙 婕,馮 帥,胡 芃,楊同華(云南省第一人民醫(yī)院血液科,云南省血液系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學研究中心,昆明 650032)

異基因造血干細胞移植(allo-HSCT)是目前血液系統(tǒng)惡性疾病治療的重要方法[1]。allo-HSCT的成功常受到急性移植物抗宿主病(aGVHD)的限制,由于缺乏有效的預測靶點和治療措施,降低移植物抗宿主病的發(fā)病率和嚴重程度仍是目前allo-HSCT治療的主要挑戰(zhàn)[2-3]。多項證據表明,allo-HSCT后自然殺傷細胞(NK細胞)的早期重建與aGVHD的發(fā)病有著緊密聯(lián)系,其活性的恢復對于allo-HSCT的成功至關重要[4-7]。因此,NK細胞的重建成為近年來allo-HSCT研究的熱門話題。中醫(yī)認為急性髓系白血病、骨髓增生異常綜合征或淋巴瘤等血液疾病大都具有共同的病機——脾腎陽虛,而脾腎兩虛可造成陽氣耗損、氣血虧虛,治療應以扶正固本為原則[8-10]?；仃柟瘫緶哂醒a腎溫陽、健脾固本的功效,是我院臨床上脾腎陽虛型患者的常用藥。本研究前期發(fā)現allo-HSCT患者在移植前服用回陽固本湯可以顯著提高外周血NK細胞數量與活性,表明回陽固本湯可能作為allo-HSCT的輔助治療藥物。于是,本研究開展了相應的臨床與基礎實驗以明確其具體功效和分子調節(jié)機制,為回陽固本湯在allo-HSCT治療中的應用提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 臨床研究

1.1.1 資料來源:選取2021年7月至2022年9月于我院血液科行allo-HSCT的患者40例。納入標準:年齡14～55歲,原發(fā)疾病為血液系統(tǒng)惡性疾病,均為首次接受allo-HSCT;中醫(yī)辨證為脾腎陽虛型,即四肢怕冷、納差、便溏、乏力、腰膝酸軟,脈沉或細,舌淡或胖大、苔白或白膩。排除標準:合并嚴重的心、肝、腎等臟器衰竭者;不能配合治療與服藥者;臨床資料不全者。本研究為開放研究,根據患者選擇的治療方式分組,將20例allo-HSCT聯(lián)合回陽固本湯的患者納入HYGB組,將另外20例選擇allo-HSCT單獨治療的患者作為對照組。兩組患者的年齡、性別、原發(fā)疾病、供者類型、CD34+細胞輸注量及移植后住院時間等一般資料具有可比性,見表1。本研究已通過我院醫(yī)學倫理委員會審批(倫理審批號:KHLL2022-KY125),患者及其家屬對本研究內容均已知情,并簽署知情同意書。

表1 兩組患者一般資料比較Tab 1 Comparison of general information between two groups

1.1.2 方法:所有患者均接受髓性預處理,親緣全相合供者allo-HSCT的aGVHD預防采用環(huán)孢素A+甲氨蝶呤方案;親緣單倍體供者采用環(huán)孢素A+甲氨蝶呤+嗎替麥考酚酯方案預防aGVHD。HYGB組患者在最后1次化療結束至移植預處理前服用回陽固本湯,連續(xù)干預4周?；仃柟瘫緶浞?附子顆粒9 g,生姜30 g,炙甘草9 g,肉桂9 g,生曬參9 g,砂仁5 g,鹽小茴香5 g,五味子5 g,當歸9 g,黃連5 g,醋烏梅5 g,花椒5 g,雞內金9 g,焦麥芽9 g;1日1劑,水煎服,分早晚2次溫服。

1.1.3 療效評定標準:造血重建標準:allo-HSCT結束后,在未使用粒細胞集落刺激因子的情況下,當中性粒細胞絕對值>0.5×109/L持續(xù)3 d,以第1日作為中性粒細胞植入日期;同時,在脫離血小板輸注情況下,當血小板計數>20×109/L持續(xù)7 d,以第1日作為血小板植入日期[11]。中性粒細胞與血小板植入時間未超過28 d視作造血重建良好,否則視為造血重建不良。同時,統(tǒng)計90 d內復發(fā)及死亡例數。

1.2 細胞實驗

1.2.1 材料:(1)儀器。CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher公司);流式細胞儀(美國BD公司);聚合酶鏈反應(PCR)儀(美國ABI公司);電泳儀(北京六一生物科技有限公司);酶標儀(美國Molecular Devices公司);離心機(湖南湘儀離心機儀器有限公司);凝膠成像分析儀(美國Bio-Rad公司)。

(2)試劑。人外周血單個核細胞(PBMC)分離試劑盒與人NK細胞分離試劑盒均購自天津科維諾生物科技有限公司;IMDM培養(yǎng)基、Hanks溶液購自美國Sigma公司;RNeasy提取試劑盒、逆轉錄試劑盒與SYBR Green試劑均購自德國QIAGEN公司;CCK-8溶液、磷酸鹽緩沖液、重組白細胞介素(IL)15、胰蛋白酶與RIPA裂解緩沖液購自上海碧云天生物技術有限公司;所有抗體購自英國Abcam公司;10%人血清購自武漢艾美捷科技有限公司;Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2.2 方法:(1)NK細胞計數。分別于allo-HSCT前、allo-HSCT后第30、60和90日采集兩組患者外周血4～5 mL,采用Hanks溶液等體積稀釋后,使用人PBMC分離試劑盒、根據密度梯度離心法于1 500 r/min離心15 min(離心半徑10 cm),獲取PBMC,以磷酸鹽緩沖液重新懸浮細胞,避光條件下采用PerCP-Cy5.5-抗CD3抗體、PE-抗CD56抗體、FITC-抗CD16抗體標記20 min,采用流式細胞儀分析CD3-CD56+CD16+NK細胞比例,以對照組作為基準,計算相對比例。

(2)NK細胞分離培養(yǎng)。隨機選取對照組與HYGB組患者外周血各3份來提取NK細胞,分離PBMC,使用人NK細胞分離試劑盒分離NK細胞,分離后采用流式細胞儀鑒定CD3-CD56+CD16+,純度為94.1%～96.8%。隨后重懸1×106個細胞于IMDM培養(yǎng)基(含有10%人血清、0.5 g/mL IL-15),將培養(yǎng)基置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后,進行以下實驗。每實驗設置3個復孔。

(3)實時熒光定量PCR。采用PCR檢測外周血中CD15與CD56的表達量,首先使用RNeasy提取試劑盒提取PBMC中的總RNA,然后使用逆轉錄試劑盒合成cDNA,最后使用SYBR Green試劑進行實時熒光定量PCR,于PCR儀上分析并計算相對甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的表達量(2-ΔΔCt法)。

(4)細胞活性檢測。采用CCK-8法評價細胞活性,將分離培養(yǎng)的NK細胞以2×103細胞/孔的密度接種于96孔板中,分別培養(yǎng)0、24、48和96 h,向每個孔中加入CCK-8溶液(10 μmol/L)于37 ℃孵育2 h后,用酶標儀測量細胞在450 nm波長下的吸光度(OD值)。

(5)細胞凋亡分析。收集細胞并將細胞密度調整為1×106個/mL,使用胰蛋白酶消化后,分別與Annexin V-FITC、PI結合緩沖液混合,孵育30 min,采用流式細胞儀分析細胞凋亡率。

(6)蛋白質印跡法。以RIPA裂解緩沖液提取NK細胞總蛋白,凝膠電泳分離蛋白條帶并轉膜,使用1∶1 000稀釋的一級抗體進行蛋白質印跡分析,隨后與辣根過氧化物酶標記的二抗孵育,使用凝膠成像分析儀進行拍照,并使用Image J軟件量化條帶強度,以GAPDH作為內參,計算相對表達量。每樣本設置3個重復,計算平均值。

(7)細胞分組干預。從患者外周血中分離培養(yǎng)NK細胞,分為對照組、HYGB組和LY294002組,HYGB組細胞采用回陽固本湯干預,LY294002組細胞在回陽固本湯干預的同時加入LY294002 50 μmol/L干預24 h,隨后分別檢測各組細胞活性與凋亡情況。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 allo-HSCT患者近期臨床效果評價及不良反應發(fā)生情況分析

兩組患者在移植后90 d內均未發(fā)生移植相關死亡,對照組90%(18/20)的患者造血重建良好,HYGB組100%(20/20)的患者造血重建良好。在移植后3個月內,對照組患者復發(fā)2例,非移植相關死亡1例;HYGB組患者復發(fā)1例,未出現死亡。兩組患者近期療效比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表2。同時統(tǒng)計患者不良反應發(fā)生率,結果顯示,兩組患者消化道癥狀(惡心、嘔吐和腹瀉)、感染和肝功能損害的發(fā)生率比較,差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05);HYGB組患者aGVHD發(fā)生率顯著低于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表3。

表2 兩組患者allo-HSCT后臨床效果比較[例(%)]Tab 2 Comparison of clinical effects between two groups after allo-HSCT [cases (%)]

表3 兩組患者allo-HSCT后90 d內不良反應比較[例(%)]Tab 3 Comparison of adverse drug reactions within 90 d after allo-HSCT between two groups [cases (%)]

2.2 回陽固本湯對allo-HSCT后患者體內CD3-CD56+CD16+ NK細胞比例的影響

allo-HSCT進行0 d時,兩組患者CD3-CD56+CD16+NK細胞比例,CD56、CD16表達量的差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05);但allo-HSCT后30、60和90 d時,HYGB組患者CD3-CD56+CD16+NK細胞比例,CD56、CD16表達量顯著高于對照組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖1。

2.3 回陽固本湯對allo-HSCT患者來源NK細胞體外活性的影響

與對照組相比,HYGB組患者NK細胞活性顯著升高,細胞凋亡率顯著降低,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖2。

A.CCK8實驗檢測NK細胞在450 nm處的吸光值;B—C.流式細胞術測定兩組NK細胞Annexin V-FITC/PI雙染情況與細胞凋亡率;n=3,*P<0.05。A. absorbance of NK cells at 450 nm detected by CCK8 assay; B-C. Annexin V-FITC/PI double staining and apoptosis rate of NK cells in both groups detected by flow cytometry; n=3, *P<0.05.圖2 回陽固本湯對allo-HSCT患者來源NK細胞體外活性影響Fig 2 Effects of Huiyang Guben decoction on in vitro activity of NK cells derived from allo-HSCT patients

2.4 回陽固本湯對患者來源NK細胞內PI3K/Akt信號通路的影響

與對照組相比,HYGB組患者NK細胞內磷酸化的PI3K(p-PI3K)和磷酸化的Akt(p-Akt)的表達水平顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而HYGB組與對照組總的Akt和PI3K表達水平的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見圖3。

2.5 PI3K抑制劑對回陽固本湯提高NK細胞體外活性的影響

與HYGB組比較,HYGB+LY294002組NK細胞活性顯著降低,而細胞凋亡比例顯著升高,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),該結果逆轉了HYGB提高NK細胞活性的效果,見圖4。

A.CCK8實驗檢測三組NK細胞在450 nm處的吸光值;B—C.流式細胞術測定三組NK細胞Annexin V-FITC/PI雙染情況與細胞凋亡率;n=3,*P<0.05。A. absorbance of three groups of NK cells at 450 nm detected by CCK8 assay; B-C: Annexin V-FITC/PI double staining and apoptosis rate of NK cells in three groups detected by Flow cytometry; n=3, *P<0.05.圖4 PI3K抑制劑對回陽固本湯提高NK細胞體外活性的影響Fig 4 Effects of PI3K inhibitor on enhancement of NK cell activity in vitro by Huiyang Guben decoction

3 討論

NK細胞是機體免疫防御的前線細胞,能夠識別并殺死惡性腫瘤細胞或病毒感染細胞[12-13]。目前,人們對NK細胞相關分子調節(jié)通路的理解仍顯不足,NK細胞在防止allo-HSCT后aGVHD的潛力,值得更進一步研究探索。

目前,中藥湯劑已被廣泛用于多種疾病的臨床治療,包括各類血液系統(tǒng)疾病。張國梁等[14]指出,采用髓白1號方聯(lián)合化療治療急性髓細胞白血病,顯著提高了患者的緩解率,降低了復發(fā)率;王永敏等[15]發(fā)現,益髓補腎方可以顯著增強患者的免疫功能,改善惡性淋巴瘤化療患者相關性貧血。本研究首先采用回陽固本湯輔助allo-HSCT治療血液系統(tǒng)惡性疾病患者,結果發(fā)現,回陽固本湯雖然在療效改善方面與對照組的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),可能是由于樣本數量偏小導致的差異不顯著;但數據顯示,回陽固本湯可顯著降低患者移植后9個月內aGVHD的發(fā)生率。中醫(yī)認為,各類血液系統(tǒng)惡性疾病,無論是急性髓細胞白血病、急性淋巴細胞白血病、骨髓增生異常綜合征或高侵襲性淋巴瘤等,都源于氣血不足,毒邪侵體,與西醫(yī)的自身免疫功能低下的病因相通[16-18]。因此,其治療應以扶正為主,鼓舞正氣,解毒為輔,抵御毒邪,增強機體免疫功能,恢復各臟器功能,為移植后造血干細胞的存活、分化創(chuàng)造條件。回陽固本方中,制附片回陽救逆、補火助陽;生姜與黃連解毒;炙甘草作為補益劑,具有益氣滋陰、通陽復脈的功效;姜半夏消痞散結;生曬參具有補元養(yǎng)血、調節(jié)心血管系統(tǒng)及免疫功能的作用;當歸補血活血;各藥合用,共奏回陽固本之效。

在分子機制上,本研究結果發(fā)現,接受回陽固本湯干預的患者,其外周血NK細胞比例顯著升高,且NK細胞體外增殖活性增強,凋亡率降低。該結果說明,回陽固本湯可以促進NK細胞的早期重建,提高NK細胞活性。此外,本研究結果顯示,回陽固本湯顯著激活了NK細胞中的PI3K/Akt通路。PI3K/Akt信號與細胞增殖、凋亡等細胞生物學過程密切相關,并且多項研究結果證實該信號參與了NK細胞活性的調控[19-20]。本研究通過體外細胞實驗繼續(xù)探究PI3K/Akt是否參與了回陽固本湯對NK細胞活性的調控,采用PI3K抑制劑LY294002協(xié)同回陽固本湯一起干預NK細胞,結果顯示,LY294002導致NK細胞增殖活性降低、凋亡率升高,逆轉了回陽固本湯在體外促進NK細胞活性的效果。

本研究報道了回陽固本湯用于輔助allo-HSCT治療的增益作用,并揭示了詳細的分子調控機制。但是本研究也存在一定的局限性:(1)由于實驗條件的限制,本研究中未能探究回陽固本湯對于NK細胞分型及殺傷活性的影響機制;(2)本研究中的臨床研究僅為單中心、小樣本研究,可能導致結果呈現一定程度的偏倚,未來或可聯(lián)合多中心進行更大樣本的臨床研究,以驗證本研究結論。

綜上所述,回陽固本湯通過激活PI3K/Akt通路促進了allo-HSCT后NK細胞的重建與活性維持,將有助于預防治療過程中aGVHD的發(fā)生,并可能進一步提升allo-HSCT成功率。本研究結果可能為回陽固本湯在allo-HSCT治療中的應用提供科學的理論依據。