謝永祥,肖陽平,左金巾,張晨云,劉 鑫,史 偉

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,廣西 南寧 530023;2.廣西中醫(yī)藥大學(xué),廣西 南寧 530001)

IgA腎病(IgAN)是一種在腎小球系膜區(qū)以IgA沉積為主的原發(fā)性腎小球疾病。在我國乃至全世界范圍內(nèi),IgAN是最常見的原發(fā)性腎小球疾病,且其患病率存在明顯的地理分布差異,在亞洲地區(qū)高于其他地區(qū)[1]。當前,對于多數(shù)IgAN患者的治療手段主要集中在生活方式的干預(yù)及腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)阻斷劑的應(yīng)用,皮質(zhì)類固醇激素因其抗炎及免疫抑制作用也被用于治療IgAN,但其風(fēng)險收益比仍不確定[2]。故目前仍沒有針對該疾病的特異性治療方法。近年來,愈多的研究表明中醫(yī)藥的合理運用能有效防治IgAN。中醫(yī)古籍中并無IgAN病名,但根據(jù)其臨床癥狀和體征,在中醫(yī)學(xué)角度可將其歸于“腎風(fēng)”“血尿”“水腫”“虛勞”等范疇,其具有起病隱匿、病情反復(fù)、遷延難愈的臨床特點,中醫(yī)觀點認為IgAN以上特點使其易演變成血瘀證,因此,為改善此類患者預(yù)后,“從瘀論治”至關(guān)重要[3-4]。研究發(fā)現(xiàn),活血化瘀類代表藥水蛭能針對腎小球硬化、系膜細胞增殖、血液流變學(xué)改變等血瘀證現(xiàn)代病理學(xué)相關(guān)系數(shù)來治療腎臟病[5-6],且藥效肯定。腎病血瘀證患者常伴出血即血尿,因此具有活血與止血雙重功效的三七也常用于此[7]。史偉教授在治療IgAN血瘀證經(jīng)驗總結(jié)中強調(diào):應(yīng)適時合理選擇蟲類、活血止血藥,并可通過藥對這種配伍形式來發(fā)揮其協(xié)同增效或減毒等作用的獨特優(yōu)勢,常用藥對“水蛭-三七”則是代表,兩者均在改善腎病患者預(yù)后、延緩腎功能進展的臨床應(yīng)用中療效顯著[8-10],但目前關(guān)于從細胞及分子水平來闡釋兩者聯(lián)合作用于IgAN機制的研究較少,因此本研究欲通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探究其中的分子機制。

1 數(shù)據(jù)庫及軟件

TCSMP(tcmsp-e.com)、TCMID(www.megabionet.org/tcmid)、SymMap(www.symmap.org)、FAF-Drugs4平臺(fafdrugs4.rpbs.univ-paris-diderot.fr)、中國知網(wǎng)(www.cnki.net)、PubMed(pubmed.ncbi.nlm.nih.gov)、PubChem(pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)、Pharmmapper平臺(www.lilab-ecust.cn/pharmmapper)、Uniprot(www.uniprot.org)、GeneCadrs(www.genecards.org)、DisGeNET(www.disgenet.org/home)、OMIM(omim.org)、Venny 2.1.0在線作圖工具(bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)、STRING(cn.string-db.org)、DAVID(david.ncifcrf.1gov)、RSCB PDB數(shù)據(jù)庫(www.rcsb.org)、Cytoscape 3.7.1軟件、Autodock Vina軟件、Pymol軟件。

2 方 法

2.1中藥活性成分篩選 本次研究運用TCSMP、TCMID、SymMap數(shù)據(jù)庫檢索水蛭、三七的活性成分,為嚴格篩選活性成分,利用FAF-Drugs4平臺[11]、TCSMP平臺評價成分的ADME(吸收、分布、代謝、排泄)參數(shù),分別選取評價為“accept”、OB(口服生物利用度)≥30%且DL(類藥性)≥0.18的成分。將不滿足以上條件而被平臺過濾掉的成分在中國知網(wǎng)、PubMed數(shù)據(jù)庫中進行檢索,選取其中具有潛在研究價值的成分列入后續(xù)分析對象。最后通過PubChem數(shù)據(jù)庫獲取所有活性成分的PubChem CID。

2.2中藥潛在作用靶點的預(yù)測 首先在PubChem數(shù)據(jù)庫下載中藥各成分的二維結(jié)構(gòu),然后通過Pharmmapper平臺[12]預(yù)測各成分的靶點,篩選出物種為“Homo sapiens”且Norm Fit Score≥0.8的靶點作為后續(xù)分析對象。然后將收集到的靶點通過Uniprot數(shù)據(jù)庫規(guī)范命名,整理得到“水蛭-三七”成分作用靶點集。

2.3疾病靶點檢索 在“GeneCadrs”“OMIM”“DisGeNET”數(shù)據(jù)庫中以“iga nephropathy”為關(guān)鍵詞進行檢索,去除重復(fù)后通過Uniprot數(shù)據(jù)庫以“Homo Sapiens”為條件進行篩選并規(guī)范命名,整理得到IgAN靶點集。

2.4網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 將中藥成分靶點集與疾病靶點集通過Venny 2.1.0作圖工具取交集。獲取兩者交集靶點,隨后使用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建“中藥-成分-交集靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖,并使用其內(nèi)置插件“Cyto NCA”作拓撲學(xué)分析。另外通過STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建交集靶點PPI網(wǎng)絡(luò)圖,再利用Cytoscape 3.7.1軟件對網(wǎng)絡(luò)圖作拓撲學(xué)分析,選取度值排在前5位的靶點進行后續(xù)分子對接模擬實驗。

2.5GO和KEGG富集分析 利用DAVID數(shù)據(jù)庫對交集基因進行GO和KEGG富集分析,其中GO分析包括生物過程(biological process,BP)、分子功能(molecular function,MF)和細胞組成(cellular component,CC)3個模塊。結(jié)果以氣泡圖、柱狀圖形式展現(xiàn)。

2.6分子對接模擬驗證 分別從PubChem數(shù)據(jù)庫及RSCB PDB數(shù)據(jù)庫下載上述網(wǎng)絡(luò)圖中度值較高的化合物及關(guān)鍵靶點的3D結(jié)構(gòu)式,即可在Autodock Vina軟件將化合物與關(guān)鍵靶點進行分子對接,最后,將對接結(jié)果在Pymol軟件中進行可視化,以預(yù)測化合物與蛋白質(zhì)靶點的結(jié)合模式及結(jié)合親合力。

3 結(jié) 果

3.1中藥活性成分篩選及其靶點預(yù)測 以評價為“accept”而獲得的水蛭活性成分共19個,以O(shè)B≥30%且DL≥0.18為條件篩選獲得三七活性成分共8個。另外,1個水蛭活性成分水蛭素(Hirudin)及3個三七活性成分人參皂苷 Rb1(Ginsenoside rb1)、人參皂苷Rg1(Ginsenoside rg1)、三七皂苷R1(Notoginsenoside R1)因分別不滿足篩選條件即評價為“accept”、OB≥30%且DL≥0.18而被相應(yīng)平臺過濾。通過查閱文獻[13-21]并研究后發(fā)現(xiàn)以上4種成分在人體能發(fā)揮生物學(xué)活性,具有一定研究價值。因此,將其一并納入后續(xù)研究。故最終獲得活性成分共31種,其中20種來自水蛭,11種來自三七?；钚猿煞株P(guān)鍵信息見表1。使用Pharmmapper平臺預(yù)測獲取化合物潛在靶點為:水蛭221個,三七73個;去除重復(fù)后共有217個靶點。

表1 “水蛭-三七”成分關(guān)鍵信息

3.2疾病靶點的篩選 通過疾病數(shù)據(jù)庫對IgAN靶點進行檢索,共獲得492個靶點,其中99個來自“GeneCadrs”、383個來自“DisGeNET”、10個來自“OMIM”,去除重復(fù)后獲得438個IgAN相關(guān)靶點。

3.3網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建與分析 將217個活性化合物靶點與438個IgAN靶點取交集,獲取交集靶點18個,見圖1。將以上2種中藥、31種化合物、18個交集靶點及1種疾病導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件,構(gòu)建“中藥-化合物-交集靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖,見圖2。圖中包含52個節(jié)點,154條邊。其中,中藥節(jié)點2個,活性成分節(jié)點31個,交集靶點節(jié)點18個,疾病節(jié)點1個。根據(jù)拓撲學(xué)參數(shù)─度值(表示某個節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中與其他節(jié)點相連接的線條數(shù)。度值愈大,則節(jié)點形狀愈大,節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中的重要性也愈加突出)對網(wǎng)絡(luò)圖進行分析發(fā)現(xiàn):度值排在前3的水蛭及三七活性化合物分別為SZ18、SZ3、SZ2及SZ19(兩者度值相同并列第3),SQ3、SQ6及SQ4(兩者度值相同并列第2)、SQ5,由此推測以上8種化合物可能是“水蛭-三七”藥對調(diào)控IgAN的關(guān)鍵成分,其詳細拓撲學(xué)參數(shù)見表2。

圖1 “水蛭、三七”成分靶點與IgA腎病靶點韋恩圖

注:黃色和綠色節(jié)點分別代表中藥:水蛭、三七;紅色和紫色節(jié)點分別代表水蛭、三七的活性成分;淺藍色節(jié)點代表中藥活性化合物與疾病的交集靶點;深藍色節(jié)點代表疾病。每條邊代表中藥與活性成分、活性成分與靶點、疾病與靶點間的相互作用關(guān)系

表2 關(guān)鍵成分拓撲學(xué)參數(shù)

將18個交集靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫,發(fā)現(xiàn)靶點FCAR因未與其他靶點產(chǎn)生相互作用而游離在網(wǎng)絡(luò)圖外,因此,將其剔除后續(xù)分析。最終在Cytoscape 3.7.1軟件中得到含有17個交集靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)圖,見圖3。以表2中所涉及的拓撲學(xué)參數(shù)分析網(wǎng)絡(luò)圖后發(fā)現(xiàn)ALB、CASP3、EGFR、HGF、NOS3、REN蛋白處在核心位置(詳細拓撲學(xué)參數(shù)見表3),提示以上蛋白可能是“水蛭-三七”藥對調(diào)控IgAN的關(guān)鍵點,是兩者之間相互作用的“橋梁”。

表3 核心靶點拓撲學(xué)參數(shù)

3.4GO功能注釋和KEGG信號通路富集分析通過DAVID數(shù)據(jù)庫對以上17個交集靶點進行GO與KEGG分析,兩者結(jié)果均以P<0.05(表示具有統(tǒng)計學(xué)意義)為條件進行篩選,最終GO分析得到61個條目,分為3個模塊,包括42個生物學(xué)過程(BP)條目,9個細胞組成(CC)條目,10個分子功能(MF)條目。KEGG分析則共得到47個條目。按照P值由小到大的順序選取兩者中主要條目進行可視化。GO富集結(jié)果見圖4,其中不同顏色的條目代表不同類型富集結(jié)果,GO中3個模塊各自的富集結(jié)果見氣泡圖5～7;KEGG富集結(jié)果見氣泡圖8。在氣泡圖中,Y軸為條目名稱,X軸為基因富集比例(即富集到某條目的基因數(shù)/進行富集分析的總基因數(shù)),氣泡顏色代表富集顯著性,氣泡大小則代表富集到該條目的基因數(shù)。BP分析(見圖5)顯示:交集靶點主要參與了凋亡過程的負向調(diào)控、脂多糖應(yīng)答、脂多糖介導(dǎo)的信號通路等生物學(xué)過程。CC分析(見圖6)表明:以上交集靶點主要在細胞外區(qū)域、膜小凹、細胞質(zhì)、膜筏、粘著斑等細胞組分中發(fā)生作用。MF分析(見圖7)提示:這些交集靶點主要涉及腸桿菌素結(jié)合、酶結(jié)合及活性、蛋白質(zhì)結(jié)合等分子功能。KEGG分析(見圖8)可以看到:交集靶點主要富集在糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、IL-17信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、MAPK信號通路及癌癥等多種通路和疾病上。

圖4 交集靶點的GO分析圖

圖8 交集靶點KEGG富集分析圖

3.5分子對接模擬驗證 將表2中的關(guān)鍵成分與表3中的核心靶點進行分子對接,兩者對接得分以熱圖展示,見圖9。以對接得分值 (docking score) 即結(jié)合能評價化合物與關(guān)鍵靶點之間的交互作用強度,當結(jié)合能<0時,則說明靶點與活性化合物成分之間可自發(fā)結(jié)合,且結(jié)合能愈小,兩者結(jié)合愈趨穩(wěn)定。一般認為,當結(jié)合能<-7 kcal/mol時,兩者則具有強烈的結(jié)合活性。從圖9中可知,所有關(guān)鍵成分與核心靶點均具有較強烈的結(jié)合活性。部分對接結(jié)果見圖10,從圖中可看出蛋白質(zhì)與小分子之間的結(jié)合模式,其中藍色為蛋白質(zhì)受體,綠色為小分子配體,黃色虛線表示氫鍵即兩者間所形成的相互作用力。

圖9 關(guān)鍵成分與核心靶點分子對接得分結(jié)果熱圖

A:Enoxaparin-ALB;B:Beta-sitosterol-ALB;C:Beta-sitosterol-CASP3;D:Ginsenoside rh2-HGF;E:Ginsenoside rh2-NOS3;F:Hirudin-REN

4 討 論

4.1“水蛭-三七”藥對干預(yù)IgAN的關(guān)鍵成分分析 本研究發(fā)現(xiàn),來自于水蛭的SZ18(Enoxaparin,低分子肝素)、SZ19(Hirudin,水蛭素)及來自于三七的SQ6(Ginsenoside rh2,人參皂苷rh2)、SQ4(beta-sitosterol,β-谷甾醇)在分子對接試驗中與各核心靶點之間的結(jié)合能總體高于藥物中的其他成分,因此,可預(yù)測以上成分在干預(yù)IgAN中將發(fā)揮主要作用。低分子肝素具有強大的抗凝作用,可改善血液黏稠度、抑制微血栓的形成,從而改善腎小球內(nèi)凝血功能以減少腎血栓形成的風(fēng)險;它還通過抗炎、修復(fù)損傷的內(nèi)皮細胞、促進細胞外基質(zhì)降解等機制減輕腎臟損傷[22-24]。以上研究表明低分子肝素在IgAN患者凝血功能障礙中的確切療效。凝血酶可通過促進成纖維細胞前膠原的產(chǎn)生而影響組織纖維化的進展過程[25],而腎組織纖維化與IgAN進展密切相關(guān),水蛭素現(xiàn)被認為是最有效的天然凝血酶抑制劑[26],因此可預(yù)測水蛭素能通過對凝血酶的抑制來防治腎纖維化,進而延緩IgAN的進展。人參皂苷rh2具有抗炎、抗氧化以及抑制纖維化等作用,可參與調(diào)控氧化應(yīng)激、細胞凋亡及組織纖維化等信號通路[27-28]。

研究證實,人參皂苷rh2可通過抑制腎臟組織細胞凋亡及纖維化進而改善糖尿病腎病腎損傷[29]。β-谷甾醇可通過抗氧化及抗炎等作用減輕腎臟損傷[30],研究顯示β-谷甾醇的抗氧化作用體現(xiàn)為抑制因脂質(zhì)過氧化和氧化性組織損傷而造成的急性近端小管壞死[31],其腎臟保護作用則體現(xiàn)在阻止TNF-α和IL-6的積累所誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[32]。綜上,可預(yù)測“水蛭-三七”藥對的關(guān)鍵成分通過調(diào)節(jié)凝血功能障礙、抑制腎纖維化、抗氧化應(yīng)激以及抗炎癥反應(yīng)等方式干預(yù)IgAN。

4.2“水蛭-三七”藥對干預(yù)IgAN的關(guān)鍵靶點分析 6個關(guān)鍵靶點:ALB、CASP3、EGFR、HGF、NOS3、REN,它們在PPI中具有重要位置(即相互作用程度高),且在分子對接試驗中與各關(guān)鍵成分具有較高的結(jié)合活性。ALB對腎小管上皮細胞及足細胞具有毒性作用,可刺激炎性、血管活性及纖維化物質(zhì)的產(chǎn)生,從而造成腎小管間質(zhì)損傷和纖維化[33]。ALB還與足突細胞足突消失、氧化應(yīng)激增加、TGF-β1上調(diào)等腎臟損害相關(guān)[34-35]。CASP3是一種負責執(zhí)行細胞凋亡的代表性效應(yīng)因子,被認為是細胞焦亡的中介物質(zhì)[36-37]。諸多研究表明CASP3是腎功能不全的關(guān)鍵因素,因為CASP3信號通路的激活可促進腎臟細胞凋亡,而中斷其表達則可顯著抑制急性腎損傷(AKI)相關(guān)的微血管減少和腎纖維化[38-39]。EGFR通路已被證實為腎臟疾病的潛在治療靶點,它的活化可促進腎小管細胞增殖、炎癥細胞浸潤并誘導(dǎo)腎纖維化,因此它與多囊腎病、糖尿病腎病等多種慢性腎臟疾病的發(fā)展密切關(guān)聯(lián)[40-41]。HGF作用于多種類型的上皮細胞,可調(diào)節(jié)細胞生長、細胞運動和形態(tài)發(fā)生。HGF可加速受損器官的組織再生,被認為是器官再生的關(guān)鍵因子[42]。HGF同時也是一種內(nèi)源性腎臟保護因子,對TGF-β1具有抑制作用,可延緩慢性腎纖維化的發(fā)展[43]。NOS3又稱為eNOS,是腎臟血流動力學(xué)的一種有效調(diào)節(jié)劑,它具有抑制血小板聚集、血管炎癥,激活內(nèi)皮祖細胞等作用[44]。eNOS被證明在防止尿毒癥血管鈣化方面有重要作用,有研究也反映維持eNOS對于降低心血管疾病和慢性腎臟病進展風(fēng)險的重要性[45]。REN是編碼腎素的基因,它的突變可致腎素失衡如誘導(dǎo)TGF-β1的高表達來刺激PAI-1、纖連蛋白和Ⅰ型膠原的增加,從而在腎纖維化疾病中發(fā)揮作用,在機體所有器官中,其對腎臟的影響最大[46]。

4.3“水蛭-三七”藥對干預(yù)IgAN關(guān)鍵信號通路分析 通過對交集靶點的富集分析發(fā)現(xiàn):脂質(zhì)和動脈粥樣硬化相關(guān)信號通路、TNF信號通路及糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路富集程度較高,可能是“水蛭-三七”藥對干預(yù)IgAN的關(guān)鍵信號通路。脂質(zhì)代謝紊亂及其介導(dǎo)的炎癥和氧化應(yīng)激被發(fā)現(xiàn)參與了CKD患者腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化的進展[47],另外,脂質(zhì)代謝紊亂還是動脈粥樣硬化和心血管疾病(目前CKD患者死亡的主要原因)以及CKD患者許多其他并發(fā)癥的主要驅(qū)動源之一[48],近來被認為是腎臟病進展的獨立危險因素。而具有控制脂質(zhì)代謝紊亂和動脈粥樣硬化作用的藥物(如他汀類)被愈來愈多的證據(jù)支持可延緩CKD患者腎功能進展及改善預(yù)后[49]。TNF信號通路存在多種細胞內(nèi)(如系膜細胞、腎小管上皮細胞和巨噬細胞),其產(chǎn)生的信號分子在促進腎小球炎癥和纖維化中發(fā)揮重要作用[50]。研究顯示,限制該通路中信號分子的作用可減輕腎臟炎癥和纖維化,同時可減輕蛋白尿及控制高血壓[51]。糖尿病并發(fā)癥中AGE-RAGE信號通路的激活可導(dǎo)致其下游多種細胞內(nèi)信號通路被啟動,包括MAPK/ERK、JAK-STAT、NF-κB以及PI3K/Akt/mTOR,這些不同途徑的共同終點是在腎臟中發(fā)動炎癥和纖維化并在其中形成一個惡性循環(huán),進而損傷腎臟。另一研究發(fā)現(xiàn),AGE-RAGE信號通路被阻斷的糖尿病小鼠其糖尿病腎病進展發(fā)生延遲且腎臟組織中炎癥和纖維化介質(zhì)的表達也有減少,對抗腎細胞凋亡的能力也有所增強;這一發(fā)現(xiàn)反映出該通路在糖尿病腎病發(fā)病機制中的重要作用[52]。

綜上所述,本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接技術(shù)實現(xiàn)了關(guān)于“水蛭-三七”藥對干預(yù)IgAN的潛在靶點和機制的初步預(yù)測,發(fā)現(xiàn)水蛭素、肝素、人參皂苷rh2及β-谷甾醇4個關(guān)鍵成分通過調(diào)控ALB、CASP3、EGFR、HGF、NOS3、REN共6個關(guān)鍵靶點以實現(xiàn)調(diào)節(jié)凝血功能,對抗氧化應(yīng)激、炎癥及腎纖維化等作用干預(yù)IgAN。這為“水蛭-三七”藥對干預(yù)IgAN的實驗研究及臨床運用提供了一定的科學(xué)依據(jù)和研究方向。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。