馬 蘭,楊 磊,丹 丹,賈 慧,來衛(wèi)東

(邯鄲市口腔醫(yī)院,河北 邯鄲 056001)

牙周炎是微生物相關(guān)導(dǎo)致牙周附著喪失的炎癥,已經(jīng)成為成人牙列缺損、牙列缺失的主要病因,其對(duì)機(jī)體的損傷不僅限于口腔,細(xì)菌可通過血運(yùn)循環(huán)進(jìn)入全身,是許多全身系統(tǒng)性疾病的危險(xiǎn)因素[1-2]?？谇环N植修復(fù)技術(shù)逐漸成為恢復(fù)口腔美觀、功能的首選方式,遠(yuǎn)期預(yù)后良好[3]。但牙周炎患者自身存在牙周致病菌,口腔固有菌群失調(diào)、術(shù)中致病菌清理困難、常規(guī)種植體表面處理無抗菌性能,使常規(guī)種植的種植體周圍炎發(fā)生率較高,故改進(jìn)種植體材料成為重點(diǎn)研究方向[4]。此外,種植體成功修復(fù)的前提為良好骨礦化及骨結(jié)合能力,種植體材料則是影響其能力的重要因素[5]。種植體表面的羥基磷灰石(hydroxyapatite,HA)涂層與哺乳動(dòng)物牙齒無機(jī)質(zhì)成分相同,結(jié)構(gòu)相似,生物活性、相容性較好,但HA易吸附蛋白質(zhì)、氨基酸及其他有機(jī)質(zhì),給細(xì)菌提供營養(yǎng),利于細(xì)菌生長繁殖[6]。為增加HA抗菌性,常將其與不同具有抑制性的金屬結(jié)合,其中Ag+具有微動(dòng)效應(yīng),對(duì)種植體周圍炎中革蘭陰性細(xì)菌有較強(qiáng)殺菌作用[7],因此將Ag+與HA混合形成新骨結(jié)合材料Ag-HA,無論是在富營養(yǎng)還是貧營養(yǎng)環(huán)境都表現(xiàn)出抗菌性能,可加強(qiáng)細(xì)胞附著,促進(jìn)成骨性能[8-9]。本研究觀察了Ag-HA涂層種植體對(duì)牙周炎大鼠牙周炎癥及種植體骨結(jié)合能力的影響,旨在為Ag-HA涂層種植體的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 40只牙周健康清潔雄性大鼠,確認(rèn)大鼠無真菌感染、系統(tǒng)性疾病,5～8周齡,體重225～255 g,由河北醫(yī)科大學(xué)(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公共服務(wù)平臺(tái))提供,合格證號(hào):SYXK(冀)2020-002。大鼠于層流架內(nèi)由專人負(fù)責(zé)管理分籠飼養(yǎng),飼養(yǎng)環(huán)境定期消毒,環(huán)境溫度22～25 ℃,相對(duì)濕度40%～60%,飼養(yǎng)墊以干凈的木屑為主,自來水、普通飼料喂養(yǎng),自由飲食、飲水,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)邯鄲市口腔醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(IRM-DWLL-2019036)。

1.2Ag-HA涂層制備方法 將97%的HA粉末(瑞士Sulzer Metco,粉末粒徑15～50 μm)和3%Ag粉混合2 h,使用瑞士Sulzer Metco真空等離子噴涂設(shè)備在30 mm×30 mm×2 mm鈦合金基材上制備HA涂層和載Ag抗菌劑的Ag-HA涂層,噴涂參數(shù)設(shè)置:等離子氣體Ar 40 L/min,等離子氣體H210 L/min,噴涂距離300 mm,涂層厚度200 μm,真空室氣壓100 Pa,送粉載氣Ar 2.0 L/min,送粉率20 g/min,電流650 A,電壓60 V。根據(jù) ASTM C-633標(biāo)準(zhǔn),HA和Ag-HA涂層結(jié)合強(qiáng)度分別為20.1 MPa、23.4 MPa。Ag-HA涂層由HA、磷酸三鈣、氧化鈣、Ag+組成,磷酸三鈣、氧化鈣由HA噴涂中分解而得。電解液中Ag+濃度0.5 mmol/L,溶液溫度40 ℃,pH 4.0,脈沖電位-2 V,沉積時(shí)間2 h,熱處理溫度700 ℃,利用CHl660D電化學(xué)工作站,肽片為工作電極、鉑盒板為對(duì)電極、飽和汞電極為參比電極進(jìn)行電化學(xué)沉積,用燒杯取電解液100 mL,將其置于恒溫加熱磁力攪拌器中,溫度設(shè)置40 ℃,初始電位為3次開路電位測(cè)量均值,高電位0.30 V、低電位-2 V,階躍72 次,脈沖寬度100 s,間隔1 s采樣,靜置0.5 s,完成電沉積,將制得樣品放入馬弗爐高溫處理,升溫速率5 ℃/min,然后進(jìn)行熱處理、保溫得出沉淀物,將沉淀物用去離子水5 L洗滌,放入高溫箱干燥,溫度設(shè)置為70 ℃,得到的晶體首先進(jìn)行馬爾文粒度測(cè)試及其他性能測(cè)試,從而檢測(cè)獲得材料的小大、含Ag量及HA合成情況,使用瑪瑙研磨器研磨,得到Ag-HA顆粒。

1.3實(shí)驗(yàn)方法 40只大鼠采用絲線結(jié)扎和10%的高糖水飼養(yǎng)方法建立牙周炎模型:采用5%的水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠,將其仰臥位固定后撐開上下切牙,暴露上頜第一磨牙和第二磨牙間隙,擴(kuò)大間隙后用0.2 mm正畸結(jié)扎絲于大鼠第一磨牙穿入腭側(cè)遠(yuǎn)中鄰間隙,頰側(cè)穿出,結(jié)扎絲位于齦溝,防止脫落,再用10%的高糖水和黏性飲食飼養(yǎng),每日更換新鮮食物、水,每3 d檢查1次結(jié)扎絲有無脫落,發(fā)現(xiàn)脫落重新結(jié)扎。結(jié)扎飼養(yǎng)8周后隨機(jī)抽取3只大鼠,內(nèi)眥靜脈采血,采用ELISA法檢測(cè)炎癥因子[腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)]水平,然后麻醉大鼠,使用牙周探針重復(fù)測(cè)量3次齦溝出血指數(shù)、牙齦指數(shù)、探診深度,均由一人統(tǒng)一完成測(cè)量,再根據(jù)牙齦炎癥、牙槽骨破壞情況確定牙周炎是否造模成功。確認(rèn)造模成功后,去除結(jié)扎絲,恢復(fù)正常飲食,然后將大鼠隨機(jī)分為牙周炎組5只、Ag-HA涂層組18只和HA涂層組17只。牙周炎組大鼠不給予任何干預(yù);其余2組大鼠禁食、禁飲12 h后,肌內(nèi)注射1.5 mL速眠新,10 min后再將30 g/L的戊巴比妥鈉按1 mL/kg肌肉注射,麻醉成功后消毒固定大鼠,Ag-HA涂層組植入Ag-HA涂層種植體,HA涂層組植入HA涂層種植體,縫合創(chuàng)口,術(shù)后肌肉注射頭孢唑啉鈉預(yù)防感染。

1.4檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.4.1牙周指標(biāo) 分別于術(shù)前及術(shù)后1周、2周、4周、8周對(duì)各組大鼠進(jìn)行牙周檢查,記錄齦溝出血指數(shù)、牙齦指數(shù)、探診深度。齦溝出血指數(shù)測(cè)量分級(jí):0為牙齦健康,無炎癥、出血;1為牙齦有炎癥改變,探診不出血;2為探診后出現(xiàn)點(diǎn)狀出血;3為探診后出血呈線狀;4為出血溢滿、溢出齦溝;5為自動(dòng)出血。牙齦指數(shù)測(cè)量分級(jí):0為牙齦正常;1為炎癥輕,牙齦顏色輕度改變、水腫;2為炎癥中度,牙齦顏色紅、水腫,探診出血;3為炎癥重,牙齦顏色紅腫或有潰瘍形成,有自發(fā)性出血傾向。記錄頰側(cè)近中、中央、遠(yuǎn)中,舌側(cè)近中、中央、遠(yuǎn)中共6個(gè)部位牙周探診深度,正常牙齦齦溝深度不超過3 mm。

1.4.2血清炎癥因子水平 分別于術(shù)前及術(shù)后1周、2周、4周、8周內(nèi)眥靜脈采血,3 000 r/min離心10 min獲取血清,采用大鼠TNF-α、IL-6、IL-1β ELISA試劑盒(上海初態(tài)生物科技有限公司)檢測(cè)相應(yīng)指標(biāo)水平。

1.4.3骨結(jié)合能力 根據(jù)血清堿性磷酸酶(ALP)水平和種植體-骨結(jié)合率評(píng)估骨結(jié)合能力。分別于術(shù)后1周、2周、4周、8周內(nèi)眥靜脈采血和處死動(dòng)物(術(shù)后1周、2周、4周時(shí)間點(diǎn)Ag-HA涂層組、HA涂層組各4只,牙周炎組1只,術(shù)后8周Ag-HA涂層組、HA涂層組各5只,牙周炎組2只),采用大鼠ALP ELISA試劑盒(上海初態(tài)生物科技有限公司)檢測(cè)3組大鼠血清ALP水平。Ag-HA涂層組、HA涂層組取大鼠種植體及其周圍3 mm范圍內(nèi)骨組織,牙周炎組取牙周炎周圍3 mm范圍內(nèi)的骨組織,采用美國西門子Inveon MM CT系統(tǒng)行顯微CT掃描,進(jìn)行三維重建、骨形態(tài)計(jì)量,種植體周圍1 mm的區(qū)域設(shè)為感興趣區(qū)域,將掃描完成的組織塊用德國E300CP EXAKT硬組織切片機(jī)、德國E400CS艾卡特硬組織磨片機(jī)及其配套平行粘合壓片裝置制作硬組織切片,厚度30 μm,每個(gè)標(biāo)本取2張切片進(jìn)行亞甲基藍(lán)-酸性品紅染色,用Image-ProPlus 6.0 專業(yè)圖像處理軟件計(jì)算種植體-骨結(jié)合率。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠牙周指數(shù)比較 研究期間Ag-HA涂層組大鼠因麻醉意外死亡1只。Ag-HA涂層組和HA涂層組大鼠術(shù)后1周、2周、4周、8周的齦溝出血指數(shù)、牙齦指數(shù)、探診深度均明顯低于同組術(shù)前及同期牙周炎組(P均<0.05),且Ag-HA涂層組術(shù)后1周、2周、4周的探診深度均明顯低于同期HA涂層組(P均<0.05)。見表1。

表1 牙周炎各組大鼠術(shù)前及術(shù)后不同時(shí)間牙周指標(biāo)比較

2.2各組大鼠血清炎癥因子水平比較 Ag-HA涂層組和HA涂層組大鼠術(shù)后4周、8周的血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平均明顯低于同組術(shù)前及同期牙周炎組(P均<0.05),且Ag-HA涂層組術(shù)后4周、8周的血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平均明顯低于同期HA涂層組(P均<0.05);3組大鼠術(shù)前及術(shù)后1周、2周的血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表2。

表2 牙周炎各組大鼠術(shù)前及術(shù)后不同時(shí)間血清炎癥因子水平比較

2.3各組大鼠骨結(jié)合能力比較 Ag-HA涂層組和HA涂層組大鼠術(shù)后1周、2周、4周、8周的血清ALP水平均明顯高于同期牙周炎組(P均<0.05);Ag-HA涂層組和HA涂層組大鼠術(shù)后1周、2周的血清ALP水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05),Ag-HA涂層組大鼠術(shù)后4周、8周的血清ALP水平和術(shù)后2周、4周、8周的種植體-骨結(jié)合率均明顯高于同期HA涂層組(P均<0.05)。見表3。

表3 牙周炎各組大鼠術(shù)后不同時(shí)間骨結(jié)合能力比較

3 討 論

牙周炎是導(dǎo)致成年人牙齒缺失的主要原因,種植牙與正常牙結(jié)構(gòu)相似,咀嚼效率高、舒適美觀,因此種植修復(fù)成為牙缺失治療最常用的手段[10-11],但存在種植修復(fù)后易感染問題。種植體與骨間無牙周膜保護(hù),一旦發(fā)生感染,炎癥會(huì)迅速進(jìn)展,種植體和周圍骨結(jié)合被破壞,影響新骨形成,導(dǎo)致種植修復(fù)失敗[12]。傳統(tǒng)抗生素治療對(duì)細(xì)菌生物被膜引起的感染效果欠佳,但種植體抗菌涂層的出現(xiàn)賦予了種植體抗菌性能,為牙周炎患者種植修復(fù)術(shù)后感染提供了新思路。

隨著國內(nèi)口腔種植技術(shù)的廣泛開展,各種植體廣泛應(yīng)用于臨床,種植體周圍炎的發(fā)生率也在不斷提高[13-14]。HA是高溫熔融霧化后高速噴射在種植體表面而形成的涂層,因其具有良好的生物相容性、生物安全性而成為最經(jīng)典的種植體涂層,能增加種植體與骨組織接觸的表面積,增強(qiáng)了生物-金屬間的結(jié)合能力,因此術(shù)后前期穩(wěn)定性較好,但HA涂層種植體的高純度結(jié)晶涂層會(huì)被逐漸吸收,之后骨組織直接與種植體接觸[15]。Ag+具有抑菌作用,它可直接與細(xì)菌接觸,可抑制、殺滅細(xì)菌[16]。本研究比較了HA涂層種植體和Ag-HA涂層種植體修復(fù)對(duì)牙周指標(biāo)的影響,結(jié)果顯示2組大鼠術(shù)后1周、2周、4周、8周的齦溝出血指數(shù)、牙齦指數(shù)、探診深度均降低,且Ag-HA涂層組大鼠術(shù)后1周、2周、4周的探診深度低于HA涂層組,提示Ag-HA涂層種植體在改善牙周炎大鼠探診深度方面更有優(yōu)勢(shì),同時(shí)提示探診深度的改變與齦溝出血指數(shù)、牙齦指數(shù)關(guān)系不大。炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β可通過旁分泌、自分泌形式調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞,增強(qiáng)破骨細(xì)胞活性,參與種植體周圍炎的發(fā)生發(fā)展[17-18]。生物材料引發(fā)感染中有45%是細(xì)菌黏附在材料表面破壞材料結(jié)構(gòu)造成的。HA用于種植體表面涂層,因其抑菌效果不佳,故常在材料中加入抗生素,但抗生素易被體液迅速?zèng)_洗,不能長期保護(hù)材料,另外微生物在抗生素長期作用下可產(chǎn)生耐藥性[19]。Ag+在低濃度范圍即可對(duì)致病菌表現(xiàn)出較強(qiáng)抗菌活性[20],其從Ag-HA涂層種植體表面緩慢釋出,通過靜電力吸附于帶負(fù)電的細(xì)菌細(xì)胞壁,與細(xì)胞壁發(fā)生肽聚糖反應(yīng),破壞細(xì)菌固有成分;Ag+穿透細(xì)胞壁,導(dǎo)致其破裂,細(xì)胞質(zhì)外流,可導(dǎo)致細(xì)菌死亡;Ag+還能破壞DNA復(fù)制,其與DNA相結(jié)合,置換DNA分子雙螺旋結(jié)構(gòu)中的氫,導(dǎo)致細(xì)菌DNA分子結(jié)構(gòu)變形,使細(xì)菌失活[21-22]。本研究結(jié)果顯示,Ag-HA涂層組大鼠術(shù)后2周、4周血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平明顯低于術(shù)前及同期HA涂層組,提示Ag-HA涂層種植體有助于減輕牙周炎大鼠術(shù)后炎癥反應(yīng),利于種植體存活和種植成功。

種植體涂層可通過改變種植體表面微觀形態(tài)、化學(xué)形成,在種植體-骨結(jié)合過程中起作用[23]。骨結(jié)合概念于1969年由Branemark教授提出,當(dāng)時(shí)需取出種植體和部分軟硬組織才可觀察骨結(jié)合情況,切片技術(shù)的發(fā)明使得骨結(jié)合理論得到證實(shí)[24]。種植體表面粗化可增加表面張力,獲得更大骨結(jié)合面積,促進(jìn)成骨細(xì)胞吸附、分化、擴(kuò)增,可增加種植體-骨結(jié)合能力,促進(jìn)成骨細(xì)胞ALP表達(dá)[25]。ALP在骨礦化中起重要作用,是成骨細(xì)胞表型的可靠標(biāo)志,其活性可反映成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成骨細(xì)胞的趨勢(shì)。黃正非等[26]研究顯示,氧化鋯涂層鈦種植體植入組兔的骨-種植體結(jié)合率較純鈦種植體植入組高,涂層后種植體表面粗糙度增加,粗糙度大利于成骨細(xì)胞礦化,促進(jìn)種植體-骨結(jié)合形成。本研究結(jié)果顯示,Ag-HA涂層組大鼠術(shù)后4周、8周的血清ALP水平和術(shù)后2周、4周、8周的種植體-骨結(jié)合率均明顯高于同期HA涂層組,提示Ag-HA涂層種植體中Ag+可改變材料表面粗糙度,使得種植體-骨結(jié)合能力更好。

綜上所述,Ag-HA涂層種植體有助于改善牙周炎大鼠牙周指標(biāo),減輕炎癥反應(yīng),提高大鼠種植體骨結(jié)合能力。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。