李麗琴,莫雪妮,袁 莉,陳 煒,秦紅玲,胡躍強,姚 春

(1.廣西中醫(yī)藥大學,廣西 南寧 530012;2.廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院,廣西 南寧 530020)

缺血性中風是中風病中最常見的一種,約占所有中風病例的87%,其特點是血栓形成或栓塞導致血流突然減少,阻塞了供應大腦特定區(qū)域的腦血管[1],是世界上第三大死因,也是最常見的致殘病因[2]。線粒體鐵死亡是最近發(fā)現(xiàn)的一種非凋亡性細胞死亡形式,其特征在于鐵過載,谷胱甘肽(GSH)消耗,谷胱甘肽過氧化物酶4(GPX4)失活以及脂質(zhì)和氨基酸代謝失衡[3]。有研究報道,在腦缺血和腦缺血再灌注損傷的發(fā)生發(fā)展中,線粒體鐵死亡既誘發(fā)又加重腦組織損傷[4]。因此靶向調(diào)控線粒體鐵死亡通路可以為缺血性中風的治療提供新的視角?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)鐵離子負載的轉(zhuǎn)鐵蛋白與大多數(shù)體細胞表面的鐵調(diào)節(jié)蛋白1(Iron regulatory protein1,IRP1)結(jié)合,并且在復合物內(nèi)吞作用后進入細胞質(zhì)[5];96序列相似家庭成員A(Family with sequence similarity 96 member A,FAM96A)是新近發(fā)現(xiàn)的細胞質(zhì)基質(zhì)鐵硫蛋白質(zhì)組裝機制的成員和細胞鐵穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)劑[6]。在細胞鐵充足的情況下,IRP1能夠在FAM96A的幫助下轉(zhuǎn)換成含有鐵硫族的順烏頭酸酶[7-8],調(diào)控其表達可能會對腦缺血再灌注損傷發(fā)揮保護作用。既往研究證實,四逆湯能夠提升機體谷胱甘肽過氧化物酶活力,減輕自由基損害和抑制脂質(zhì)過氧化物反應的作用[9],而以四逆湯為底方的溫陽復元方在治療缺血性中風方面取得了較好的臨床療效[10],故推測溫陽復元方可能通過抗氧化應激反應進而抑制線粒體鐵死亡。本實驗通過觀察溫陽復元方對線粒體鐵死亡相關(guān)蛋白IRP1和FAM96A表達的影響,旨在闡明該方對腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護作用機制,為其臨床應用提供更多的、科學的理論依據(jù)。

1 實驗材料與方法

1.1動物 健康雄性SPF級SD大鼠84只,12月齡,體重(250±50)g,由廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院動物實驗中心提供,生產(chǎn)許可證號:SCXK(湘)2019-0014。實驗方案通過廣西中醫(yī)藥大學動物倫理委員會批準(DW20211204-195)。

1.2藥物 溫陽復元方由白附片30 g、黃芪30 g、黨參30 g、石菖蒲20 g、淫羊藿15 g、田三七15 g、干姜10 g、炙甘草6 g組成。補陽還五湯由黃芪60 g、桃仁15 g、紅花6 g、地龍10 g、赤芍15 g、當歸6 g、川芎15 g組成。以上藥物均由廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院藥劑科統(tǒng)一采購,要求同一批次(批號:20190701)、同一質(zhì)量、同一產(chǎn)地。所有藥物浸泡30 min,白附片先煎1 h,后加入其他藥物,分2次煎煮;再大火濃縮至含原生藥濃度1.0 g/mL的藥液。根據(jù)成人(70 kg)與大鼠體表面積換算,確定溫陽復元方和補陽還五湯大鼠灌胃劑量分別為14.04 g/kg和11.43 g/kg。

1.3主要試劑和儀器 MCAO線栓(河南平頂山豫順生物科技有限公司,批號:2543);Trizol Reagent(美國Ambion公司,批號:284909),mRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海新貝生物科技有限公司,批號:F2967);mRNA擴增試劑盒(上海新貝生物科技有限公司,批號:F2967);IRP1一抗(北京Solarbio公司,貨號:K111307P,1∶2 000);FAM96A一抗(上海Affinity公司,貨號:DF12272,1∶2 000);山羊抗兔HRP-IgG(北京Biosharp公司,貨號:BL003A,1∶20 000);DEPC水、GAPDH抗體(北京Biosharp公司,貨號分別是BL510A和BL0068);DAB顯色液(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司,貨號:ZLI-9017,ZLI-9018,ZLI-9019)。LightCycler 96型PCR儀(瑞士Roche公司);H-600型透射電鏡(日本日立公司);M200PRO型多功能酶標儀(瑞士TECAN公司);Centrifuge 5418R型低溫離心機(德國Eppendorf公司)。

1.4實驗方法 將84只SD大鼠隨機分為假手術(shù)組、腦缺血再灌注組、溫陽復元方組、補陽還五湯組,每組21只。腦缺血再灌注組、溫陽復元方組、補陽還五湯組大鼠在Longa線栓法[11]的基礎(chǔ)上加以改良制備右側(cè)大腦中動脈栓塞模型,線栓插入大鼠右側(cè)頸內(nèi)動脈大約17 mm,2 h后拔出線栓實現(xiàn)缺血再灌注,大鼠清醒后用Zea-Longa 5級評分法進行神經(jīng)功能缺損評分,評分1～3分且無蛛網(wǎng)膜下腔出血的大鼠證實造模成功。溫陽復元方組、補陽還五湯組在制作缺血再灌注模型前30 min分別給予溫陽復元方14.04 g/kg和補陽還五湯11.43 g/kg灌胃,術(shù)后大鼠清醒后1 h繼續(xù)予以原方灌胃,每日上、下午各1次;腦缺血再灌注組造模后灌胃等體積的生理鹽水;假手術(shù)組除線栓只插入頸內(nèi)動脈9 mm外,其余的實驗步驟同腦缺血再灌注組。

1.5檢測指標及方法 再灌注12 h、24 h、3 d時對各組大鼠進行神經(jīng)功能缺損評分,然后取各組大鼠腦組織,一部分液氮冷凍后通過RT-qPCR檢測IRP1、FAM96A mRNA表達情況;一部分進行脫水和包埋,通過免疫組化檢測缺血灶腦組織中IRP1、FAM96A蛋白表達情況。

1.5.1神經(jīng)功能缺損評分評定方法 采用Zea-Longa 5級評分法對大鼠神經(jīng)功能缺損情況進行評分。0分:神經(jīng)功能正常;1分:提尾時左側(cè)前肢不能完全伸展;2分:追尾現(xiàn)象;3分:行走時向左側(cè)轉(zhuǎn)圈;4分:無法自主行走,意識喪失。評分越高說明大鼠神經(jīng)功能障礙越嚴重。

1.5.2缺血灶腦組織中IRP1、FAM96A mRNA表達檢測方法 使用Trizol試劑提取大鼠總RNA,測定RNA 的濃度和純度,37 ℃ 15 min和85 ℃ 5 s進行反轉(zhuǎn)錄,得到在RNA各個位置反轉(zhuǎn)錄效率均一的cDNA,最后進行擴增,過程如下:95 ℃預變性30 s,95 ℃變性10 s,60 ℃退火30 s,使用全自動實時熒光定量儀器進行PCR產(chǎn)物的檢測。所用引物序列見表1。實驗所得CT值采用2-ΔΔCT法計算分析。

表1 引物序列

1.5.3缺血灶腦組織中IRP1、FAM96A蛋白表達檢測方法 石蠟切片4 μm,玻片65 ℃烘烤2 h后脫蠟,在二甲苯中浸泡4次,每次10 min,去除多余液體后,梯度乙醇復水后在蒸餾水中沖洗1 min,置于檸檬酸鈉中高壓高溫修復5～10 min,后滴水冷卻至常溫,水洗3遍,免疫組化筆劃圈,加入適量內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑,室溫孵育10 min,PBS緩沖液洗3遍,每次3 min;加入一抗,4 ℃冰箱過夜,用自來水洗去一抗,PBS緩沖液沖洗;滴加適量的山羊抗兔HRP-IgG,蓋上蓋子防止揮發(fā),室溫孵育20 min后沖洗;加入新鮮配置的DAB顯色液(1∶19)染色直到顯淺黃色為止,蘇木素染色30 s,梯度乙醇中脫水后,中性樹膠封片,觀察結(jié)果,光學顯微鏡拍照,采用Image J軟件檢測圖片的陽性細胞面積,算出平均光密度值。

1.6統(tǒng)計學方法 使用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計學分析。多個樣本間的比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較方差齊者用LSD檢驗,方差不齊者用Tamhane’sT2檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較 假手術(shù)組大鼠各時間點神經(jīng)功能缺損評分均為0分,腦缺血再灌注組大鼠各時間點神經(jīng)功能缺損評分均明顯高于假手術(shù)組(P均<0.05);溫陽復元方組大鼠神經(jīng)功能缺損評分隨再灌注時間延長逐漸降低,再灌注3 d時最低,與腦缺血再灌注組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05);補陽還五湯組僅在再灌注12 h時神經(jīng)功能缺損評分明顯低于腦缺血再灌注組(P<0.05),再灌注24 h、3 d時與腦缺血再灌注組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05);與補陽還五湯組比較,溫陽復元方組再灌注3 d時神經(jīng)功能缺損評分更低(P<0.05)。見圖1。

A為假手術(shù)組;B為腦缺血再灌注組;C為溫陽復元方組;D為補陽還五湯組

2.2各組大鼠缺血灶腦組織中IRP1、FAM96A mRNA相對表達量比較 腦缺血再灌注組再灌注12 h、24 h、3 d時IRP1、FAM96A mRNA相對表達量均明顯高于同期假手術(shù)組(P均<0.05)。溫陽復元方組IRP1、FAM96A mRNA相對表達量隨再灌注時間延長逐漸降低,再灌注3 d時最低,與腦缺血再灌注組相應時間點比較差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05),且再灌注3 d時IRP1 mRNA相對表達量和再灌注24 h、3 d時FAM96A mRNA相對表達量均明顯低于同期補陽還五湯組(P均<0.05);補陽還五湯組IRP1、FAM96A mRNA相對表達量隨再灌注時間延長逐漸升高,但再灌注12 h、24 h時均明顯低于同期腦缺血再灌注組(P均<0.05),再灌注3 d時與腦缺血再灌注組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見表2。

表2 假手術(shù)組和腦缺血再灌注各組大鼠腦組織中IRP1和FAM96A mRNA相對表達量比較

2.3各組大鼠 缺血灶腦組織中IRP1、FAM96A蛋白表達情況比較 腦缺血再灌注組再灌注12 h、24 h、3 d時IRP1、FAM96A蛋白表達平均光密度值均明顯高于同期假手術(shù)組(P均<0.05)。溫陽復元方組IRP1、FAM96A蛋白表達平均光密度值隨再灌注時間延長逐漸降低,再灌注3 d時最低,與腦缺血再灌注組相應時間點比較差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05),且再灌注24 h、3 d時IRP1、FAM96A 蛋白表達平均光密度值均明顯低于同期補陽還五湯組(P均<0.05);補陽還五湯組IRP1、FAM96A蛋白表達平均光密度值隨再灌注時間延長逐漸升高,但再灌注12 h、24 h時均明顯低于同期腦缺血再灌注組(P均<0.05),再灌注3 d時與腦缺血再灌注組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見表3及圖2、圖3。

圖2 假手術(shù)組和腦缺血再灌注各組大鼠腦組織中IRP1蛋白表達情況(免疫組化染色,×400)

圖3 假手術(shù)組和 腦缺血再灌注各組大鼠腦組織中FAM96A 蛋白表達情況(免疫組化染色,×400)

表3 假手術(shù)組和腦缺血再灌注各組大鼠腦組織中IRP1和FAM96A平均光密度值比較

3 討 論

目前,中醫(yī)對于缺血性中風的治療存在較多的觀點,根據(jù)患者發(fā)病的病因病機,常用的治療方法主要包括養(yǎng)陰熄風、清火平肝或益氣活血、化瘀通絡或泄熱通腑、化痰開竅等[12]。受《內(nèi)經(jīng)》重陽思想和“火神派”思想的影響,并依據(jù)多年以來對缺血性中風的認識,胡躍強教授團隊認為元陽虧虛為本病的病機根本,元陽虧虛,臟腑溫煦功能失調(diào),陰寒內(nèi)生,導致寒凝血瘀;痰瘀阻滯又進一步阻遏陽氣的化生,導致肝風夾痰上蒙清竅,發(fā)為中風[10,13-14],故基于此病機創(chuàng)制了溫陽復元方治療本病。該方中附片剛中帶柔,可溫坎水,大補少陰之腎陽為君藥。臣以黃芪補氣升陽,大補脾胃之氣,氣行則血行,有行滯通絡之效;黨參助黃芪補脾肺之氣;辛熱之干姜溫中散寒,助附子溫脾胃之陽。淫羊藿祛風除濕、補腎壯陽,引陽入陰,通達內(nèi)外;石菖蒲化痰開竅,安神定志;田三七活血化瘀止血;上三藥為佐藥,炙甘草為使藥。諸藥合用,共奏溫陽益氣、化痰通絡之功。為探討該方對腦缺血再灌注大鼠線粒體鐵死亡的影響,本研究以治療缺血性中風的經(jīng)典方補陽還五湯為對照進行了相關(guān)研究。

線粒體鐵死亡是一種鐵依賴的調(diào)節(jié)性壞死,通過影響鐵代謝或脂質(zhì)過氧化在缺血性中風的發(fā)展中起著重要作用,有研究發(fā)現(xiàn)抑制線粒體鐵死亡可以成功逆轉(zhuǎn)缺血性損傷[3,15]。細胞的鐵離子平衡受到嚴格的調(diào)控,在細胞缺鐵時最大限度地增加鐵的供應,而當細胞缺鐵時限制鐵離子的供應,并促進其儲存。這種調(diào)節(jié)可以發(fā)生在不同的層面,但最常見的是IRP1和IRP2與編碼各種鐵離子相關(guān)蛋白[16]的信使RNA非翻譯區(qū)(UTRs)中的干細胞環(huán)結(jié)構(gòu)[鐵反應元件(IRE)]的鐵依賴性結(jié)合[17]。當細胞鐵濃度低時,IRP1處于與mRNA結(jié)合的構(gòu)象。IRP1與鐵蛋白mRNA的5′UTR的結(jié)合阻止了翻譯,從而確保在不需要儲存鐵的時候產(chǎn)生少量的鐵蛋白;同時,IRP1與TfR1 mRNA的3′UTR中的鐵調(diào)節(jié)蛋白(IRPs)結(jié)合,從而保護信息不被降解,使更多的TfR1在細胞膜上表達。這種作用反過來使細胞能夠最大限度地攝入鐵離子。當細胞鐵離子濃度高時,IRP1不與IREs結(jié)合,從而允許鐵蛋白mRNA的翻譯繼續(xù)進行,并使TfR1 mRNA暴露與降解。這些條件限制了細胞對鐵離子的吸收并促進了其儲存。FAM96A僅存在于少數(shù)生物體中,并作為IRP1的專用Fe/S簇成熟因子,從而對哺乳動物的細胞鐵離子平衡調(diào)節(jié)產(chǎn)生直接影響[6]。有研究表明,提高大鼠海馬內(nèi)IRP1的表達量,進而使TfR表達量增加,鐵蛋白表達量減少,最終導致大鼠腦內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)失衡,相應腦區(qū)鐵離子含量增加[18]。Casarrubea等[19]研究發(fā)現(xiàn)IRP1過表達會導致細胞鐵代謝紊亂,強調(diào)了適當?shù)腎RP1調(diào)節(jié)在鐵代謝的中樞器官中的重要性。

本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),大鼠腦缺血再灌注后腦組織中IRP1和FAM96A的表達顯著增加,其直接結(jié)果導致鐵離子內(nèi)流增加,而外輸減少,致使神經(jīng)元線粒體結(jié)構(gòu)破壞而鐵死亡發(fā)生;溫陽復元湯可下調(diào)IRP1和FAM96A的表達,促進細胞內(nèi)鐵的外排,減少神經(jīng)元損傷,發(fā)揮神經(jīng)保護作用,且其作用明顯優(yōu)于補陽還五湯。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。