寧瑩瑩，張鑫，趙丹

（1黑龍江大學生命科學學院/農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心/黑龍江省寒區(qū)植物基因與生物發(fā)酵重點實驗室/黑龍江省普通高校微生物重點實驗室，哈爾濱 150080；2長春金賽藥業(yè)有限責任公司，長春 130012）

0 引言

β-甘露聚糖酶（EC 3.2.1.78，本研究簡稱為甘露聚糖酶）是可以隨機切割甘露聚糖主鏈中β-1,4糖苷鍵的一類酶的總稱[1]，產(chǎn)物包括單糖或甘露低聚糖。由于不同來源的酶序列和結(jié)構(gòu)存在差異，可將這些酶分屬于不同的糖苷水解酶家族(Glycoside hydrolasefamily,GH)，微生物甘露聚糖酶的編碼基因大部分來源于GH5、GH26 和GH113。甘露聚糖酶在保健食品、醫(yī)藥、飼料和紡織等行業(yè)有廣泛的應用前景[2]。動植物及微生物均能分泌甘露聚糖酶，其中微生物來源的甘露聚糖酶不僅可以工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)并高效分離純化制備，還具有活性高、成本低等顯著優(yōu)點，已引起高度的關(guān)注和開發(fā)應用[3-4]。甘露聚糖酶的性質(zhì)根據(jù)其來源不同，表現(xiàn)出多樣性和特異性。挖掘其潛能及特異性，將不同類型的酶更全面的應用于多個領域，為日后甘露聚糖酶的實際生產(chǎn)應用提供基礎[5]。

目前，采用基因和蛋白質(zhì)工程技術(shù)研究甘露聚糖酶備受關(guān)注，包括基因克隆、異源表達和分子改造等分子生物學方面研究[6]，新型甘露聚糖酶基因的開發(fā)和酶的分子改造等研究逐漸成為研究熱點?？寺「事毒厶敲富蚝笸ㄟ^生物信息學分析其序列，對酶的一級結(jié)構(gòu)和高級結(jié)構(gòu)獲得初步認識，可以為甘露聚糖酶的構(gòu)效關(guān)系及分子生物學技術(shù)對酶分子改造等方面的研究提供理論依據(jù)。 LIU 等[7]從產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)中成功克隆一個由731個氨基酸殘基編碼的甘露聚糖酶基因(Man1E)。經(jīng)預測Man1E 被歸為GH1，且Man1E 催化中心有8 個基本殘基，分別是Trp166、Trp168、Asn229、Glu230、Tyr281、Glu309、Trp341和Lys374。將Man1E的碳水化合物結(jié)合模塊和催化模塊進行同源建模，疊加分析和分子對接進一步揭示了位于Man1E 催化模塊和Man1E 的CBM 中的殘基。關(guān)于甘露聚糖酶基因的克隆和生物信息學分析，后續(xù)可以采用異源表達手段獲得基因工程菌株，以重組菌株的產(chǎn)酶效果體外驗證甘露聚糖酶基因的功能，并且可在此基礎上，采用基因敲除的方法進一步驗證甘露聚糖酶在原始菌株中蛋白表達的多少[8-9]。

隨著分子生物學的快速發(fā)展，有關(guān)克隆表達不同來源的甘露聚糖酶基因以獲得高效重組酶的研究日益增加[10-11]。乳酸菌(lactic acid bacteria, LAB)作為公認的安全(generally recognized as safe,GRAS)菌株[12]，不僅可以直接分泌表達胞外甘露聚糖酶，還可異源表達重組甘露聚糖酶。但目前報道的關(guān)于LAB 產(chǎn)甘露聚糖酶的研究僅限于產(chǎn)酶菌株的分離、產(chǎn)酶培養(yǎng)基成分和條件優(yōu)化、酶的性質(zhì)等方面，未涉及到其編碼基因的研究，NCBI 等數(shù)據(jù)庫中也沒有LAB 甘露聚糖酶基因的相關(guān)信息。

本研究以課題組前期分離到的一株產(chǎn)甘露聚糖酶的干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)HDS-01 為研究對象，根據(jù)基因組序列進行本地BLAST 比對分析，獲得并克隆甘露聚糖酶的編碼基因。通過生物信息學分析深入挖掘LAB基因組數(shù)據(jù)，不僅為甘露聚糖酶的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系及分子改造研究提供理論依據(jù)，還可探討全基因組數(shù)據(jù)庫比對和生物信息學分析等獲得功能基因的方法的可操作性，為日后挖掘功能基因的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株L.caseiHDS-01 分離自酸菜發(fā)酵液[13]；克隆轉(zhuǎn)化所需的大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α購自上海唯地生物技術(shù)有限公司；重組蛋白表達載體pET-28a、基因M1 的克隆載體pT-M1均由黑龍江大學微生物重點實驗室自行構(gòu)建；限制性核酸內(nèi)切酶NdeI、HindIII 和SacI 購自NEB 公司；SalI 購自江蘇愚公生命科技有限公司；細菌基因組DNA 提取試劑盒(DP302-02)購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

（1）MRS液體培養(yǎng)基：牛肉膏1 g，蛋白胨1 g，葡萄糖2 g，酵母提取物0.5 g，磷酸氫二鉀0.2 g，檸檬酸銨0.2 g，無水亞硫酸鈉0.01 g，硫酸鎂0.02 g，無水乙酸鈉0.5 g，硫酸錳0.005 g，吐溫-80 0.1 mL，蒸餾水0.1 L；pH 5.5，于121℃條件下滅菌15 min，用于L.caseiHDS-01的培養(yǎng)。

（2）MRS固體培養(yǎng)基：向MRS液體培養(yǎng)基中加入2.5%(w/v)的瓊脂粉，于121℃條件下滅菌15 min，用于L.caseiHDS-01菌落計數(shù)。

（3）魔芋粉產(chǎn)酶培養(yǎng)基(KGM)：魔芋粉0.6 g，牛肉膏0.1 g，蛋白胨0.1 g，葡萄糖0.1 g，酵母浸粉0.5 g，磷酸氫二鉀0.2 g，檸檬酸銨0.2 g，無水亞硫酸鈉0.01 g，硫酸鎂0.02 g，無水乙酸鈉0.5 g，硫酸錳0.005 g，吐溫-80 0.1 mL，蒸餾水0.1 L；pH 5.5，121℃滅菌15 min，用于L.caseiHDS-01發(fā)酵產(chǎn)甘露聚糖酶。

1.3 本地BLAST比對

L. caseiHDS- 01 基因組總長為3038767 bp（GenBank 登錄號：CP026097.1）。從NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫中下載幾十種微生物來源的甘露聚糖酶的蛋白序列為查詢序列，與L. caseiHDS-01基因組中的全部氨基酸序列作本地BLAST比對分析?；诒镜谺LAST 比對結(jié)果，最終以L.caseiHDS-01 基因組中編號為2884 基因為研究對象，本研究簡稱為基因為M1，對應的酶蛋白簡稱為M1。

1.4 qRT-PCR檢測M1基因的表達水平

將Trizol 法[14]用于L. caseiHDS-01 總RNA 的提取。以MRS（葡萄糖為底物）培養(yǎng)基作為對照組，L.caseiHDS-01 培養(yǎng)在KGM（魔芋粉為底物）培養(yǎng)基為實驗組，每12 h 時按上述方法獲得L.caseiHDS-01 模板，擴增16S內(nèi)參基因和甘露聚糖酶基因。qRT-PCR反應體系：2×ChamQ Universal SYBR Mastermix 10.0 μL、Template cDNA-- 、Forward primer 0.4 μL、Reverse primer 0.4 μL、ddH2O 20 μL。qRT-PCR反應程序：94℃預變性180 s；94℃變性10 s；60℃退火30 s；72℃延伸30 s。參照GB 4789.2—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數(shù)測定》的方法計算L. caseiHDS-01 活菌數(shù)。將獲得各樣品的CT 值以相對定量2-△△CT法進行分析[15]，以內(nèi)參基因16SrDNA 校正。經(jīng)2-△△CT計算后，以MRS 培養(yǎng)基的L.caseiHDS-01 對照組基因的表達量設為1，KGM培養(yǎng)基較MRS培養(yǎng)基的假定基因表達量為2-△△CT。

1.5 L.casei HDS-01 M1基因的克隆

以L.caseiHDS-01的基因組DNA為模板，以M1-up： gtgccgcgcggcagccatatgATGCAGAAAGTTCATG TTATTGCC、M1- down：accagtcatgctagccatatgTCAT AACGACTCCTTTTTCGATGC 為引物對進行PCR 擴增。PCR 反應體系：Mix (green) 45 μL、基因組DNA 1 μL、M1- up 2 μL、M1- down 2 μL、Total volume 50 μL。PCR 反應程序：98℃預變性2 min；98℃變性10 s；60℃退火15 s；72℃延伸1 min；72℃終延伸5 min。將回收成功的DNA 片段進行加A 反應，金屬浴72℃，30 min，經(jīng)加A尾與克隆載體連接。將上述反應后的產(chǎn)物熱激法轉(zhuǎn)至E. coliDH5α中。利用引物M13-up：GTAAAACGACGGCCAGT 和M13-down：GTCATAGCTGTTTCCTG 對轉(zhuǎn)化后得到的菌落進行PCR及酶切驗證，根據(jù)片段大小驗證基因片段是否成功與克隆載體連接。將含有基因克隆載體的陽性菌株命名為E.coliDH5α-pT-M1，并送交至北京擎科公司作測序分析。

1.6 L.casei HDS-01 M1基因生物信息學研究

利用在線網(wǎng)站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi對M1基因進行開放閱讀框分析；利用在線網(wǎng)站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi對M1基因進行rpsblast 分析；利用在線網(wǎng)站http://www.expasy.org/tools/protscale.html 對M1基因進行疏水性分析；利用在線網(wǎng)站http://www.expasy.org/cgibin/protparam 進行蛋白質(zhì)穩(wěn)定性分析；利用在線網(wǎng)站http://genome.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/進行磷酸化位點分析；利用在線網(wǎng)站http://www.ebi.ac.uk/Radar/進行蛋白質(zhì)重復序列分析；利用在線網(wǎng)站http://npsapbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_hnn.h進行蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預測。

2 結(jié)果與分析

2.1 L.casei HDS-01 M1基因的確定

M1 與特征性甘露聚糖酶氨基酸序列比對結(jié)果（圖1）所示?；騇1(WP_003585751.1)長2640 bp，基因組中預測功能為α-甘露糖苷酶，與副干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)JCM 8130 甘露糖苷酶（登錄號：BAN72915.1）、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)GG 甘露糖苷酶（登錄號：BAI40620.1）、彎曲乳桿菌(Lactobacillus curvatus)甘露糖苷酶（登錄號：ASN60910.1）、L. paracaseiWCFS1 甘露糖苷酶（登錄號：CCC80587.1）的序列相似性分別為99.10%、45.36%、31.46%和23.33%。

圖1 L.casei HDS-01 M1基因和特征性甘露糖苷酶的motif比對

2.2 L.casei HDS-01 M1基因的誘導表達

測定L.caseiHDS-01在MRS培養(yǎng)基和KGM培養(yǎng)基中不同時間內(nèi)M1基因的差異表達情況。由圖2 可知，第12 h時，與對照組相比，基因M1下調(diào)表達，由于甘露聚糖酶為胞外誘導酶，此時HDS-01 主要消耗培養(yǎng)基中的少量葡萄糖，導致基因下調(diào)；在36 h基因M1的表達量達到最大，為對照組的4.70倍，此時培養(yǎng)基中的葡萄糖消耗殆盡，多聚糖的存在誘導甘露聚糖酶的表達，此時培養(yǎng)基中活菌數(shù)最多（圖3），菌群的產(chǎn)酶能力大幅度提升，基因表達量相對提高。較MRS培養(yǎng)基相比，KGM 培養(yǎng)基中魔芋甘露聚糖的存在使基因M1在48 h、60 h和72 h持續(xù)上調(diào)表達，表達量分別提高了164%、26%和48%。多種比較結(jié)果顯示（表1），以多聚糖為底物培養(yǎng)時，明顯提高基因M1的轉(zhuǎn)錄水平，表明KGM培養(yǎng)基中的魔芋粉比MRS培養(yǎng)基中葡萄糖更有效的誘導基因的表達。

表1 L.casei HDS-01中M1基因的相對表達量

圖2 L.casei HDS-01 M1基因在MRS和KGM培養(yǎng)基中的表達情況

圖3 L.casei HDS-01在MRS和KGM培養(yǎng)基中的總數(shù)動態(tài)變化

2.3 L.casei HDS-01基因組提取及M1基因的克隆

提取L.caseiHDS-01 基因組DNA 的結(jié)果（如圖4 A）所示，約在15000 bp 處有明顯的單一條帶，說明L. caseiHDS-01 基因組DNA 提取成功?；騇1的PCR 擴增片段長度分別約為2640 bp（圖4 B），與預期大小一致。

圖4 L.casei HDS-01基因組DNA(A)、M1基因PCR結(jié)果(B)

構(gòu)建基因M1克隆載體的驗證結(jié)果所示，單菌落PCR結(jié)果中8～11泳道在2800 bp左右有單一明亮條帶（圖5 A），將驗證的陽性克隆子搖瓶培養(yǎng)后進行單酶切驗證，在5400 bp 左右處有明顯條帶（圖5 B），基因M1的克隆載體獲得成功。

圖5 M13-up和M13-down引物對PCR結(jié)果(A)和pT-M1酶切結(jié)果(B)

2.4 L.casei HDS-01 M1基因生物信息學特征

經(jīng)M1基因一級結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，M1長2640 bp，可翻譯成879 個氨基酸。經(jīng)ORF 分析（圖6）結(jié)果可知M1基因序列在1～2640位的ORF長2640 bp，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA。

圖6 L.casei HDS-01 M1基因ORF分析結(jié)果

利用NCBI的nucleotide blast工具對M1進行同源性分析（圖7 A）可知，M1不僅與L. paracaseiHD1.7（登錄號：CP026097.1）全基因組某一基因同源性最高(100% )，而且與L. paracasei10266（ 登錄號：CP031785.1）也有100%的同源性。將M1翻譯成氨基酸后形成的酶蛋白命名為假定甘露聚糖酶(M1)。rpsblast比對結(jié)果（圖7 B）所示，M1屬于GH38家族，其中COG0383含有甘露糖苷酶的重復單元，負責碳水化合物的轉(zhuǎn)運和代謝。重復序列分析表明，M1 中可能存在9個重復序列（圖7 C）。

圖7 L.casei HDS-01 M1基因blastn(A)、rpsblast(B)、蛋白重復序列分析結(jié)果(C)

對M1 進行氨基酸序列基本分析，通過預測翻譯后M1 的理論分子量為98723.55 Da，理論等電點為5.58。（圖8）表示可能含有23個Ser，39個Thr，13個Tyr成為M1蛋白激酶磷酸化的位點。

圖8 L.casei HDS-01 M1蛋白磷酸化位點分析

氨基酸分子式為C4424H6840N1210O1317S21，原子總數(shù)為13812 個，預測其在280 nm 水溶液中的消光系數(shù)為118400，半衰期為30 h，脂肪族氨基酸指數(shù)為85.88。疏水性分析表明，M1 的親水性平均值為-0.307（圖9）。M1 質(zhì)不穩(wěn)定指數(shù)為29.92，是一種穩(wěn)定蛋白質(zhì)。對M1 進行二級結(jié)構(gòu)預測，（圖10）表示M1 蛋白含有34.02%的α-螺旋，20.14%的β-折疊，6.37%的β-轉(zhuǎn)角，39.48%的無規(guī)則卷曲。

圖9 L.casei HDS-01 M1蛋白疏水性分析結(jié)果

3 討論與結(jié)論

近年來，植物半纖維素的利用和功能性寡糖的研究逐漸成為研究熱點，而甘露聚糖酶作為關(guān)鍵酶既可以降解半纖維素中的甘露聚糖，也可催化生產(chǎn)功能性寡糖而備受關(guān)注。國內(nèi)外對甘露聚糖酶的研究，主要集中在甘露聚糖酶的產(chǎn)酶菌株及酶資源發(fā)掘和優(yōu)化蛋白表達條件等研究，從而提高產(chǎn)酶水平。由于分子生物學領域的迅速發(fā)展，不同來源的甘露聚糖酶基因成功的進行外源表達，不僅預測酶蛋白的初級結(jié)構(gòu)（氨基酸序列），為酶的構(gòu)效關(guān)系及分子改造等方面奠定基礎，也可以通過基因工程菌株的高效表達以提高甘露聚糖酶的產(chǎn)酶水平。

在已報道的編碼甘露聚糖酶的基因中，產(chǎn)酶主要來源有芽孢桿菌屬(Bacillussp.)、放線菌屬(Actinomycessp.)、曲霉菌屬(Aspergillussp.)和木霉菌屬(Trichodermasp.)等[16-17]，關(guān)于甘露聚糖酶基因的主要研究包括密碼子優(yōu)化、強啟動子過表達，以及其他生物調(diào)節(jié)方式以增加甘露聚糖酶的產(chǎn)量。SUN等[18]使用兩個最佳工程啟動子cbh1pA 和cbh1pX 驅(qū)動黑曲霉(Aspergillus niger)中甘露聚糖酶基因的表達，使甘露聚糖酶的分泌表達分別提高3.6和5.0倍，進一步證明該基因在飼料工業(yè)中具有很高的應用潛力。張丹陽等[19]克隆表達枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)G1 中出甘露聚糖酶基因Bsman A，致力于將甘露聚糖酶生物催化生產(chǎn)甘露低聚糖應用于工業(yè)生產(chǎn)。綜上，已知甘露聚糖酶的編碼基因，對酶分子進行理性改造，以提高其在工業(yè)生產(chǎn)的應用潛力。

全基因組測序的成本逐漸降低，使不同微生物的基因組序列的相關(guān)報道越來越多，通過基因挖掘技術(shù)，以基因組為研究對象獲得新酶基因逐漸稱為研究熱點。LAB 是對人體有益、公認安全的微生物，目前報道的產(chǎn)甘露聚糖酶的LAB 除了L.caseiHDS-01 還有乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)M17[20]、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum) RI11[21]、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum) ATCC14917TM[22]。但是這些研究集中在產(chǎn)酶菌株的分離、產(chǎn)酶培養(yǎng)基成分和條件優(yōu)化、酶的性質(zhì)等方面，暫時未涉及到甘露聚糖酶編碼基因的報道。本研究基于本地BLAST 比對結(jié)果從L. caseiHDS-01 基因組序列中挖掘得到M1基因，與L. paracaseiJCM 8130 序列相似性為99.10%?；騇1在基因組中的預測功能為甘露糖苷酶，糖苷水解酶家族同時包括糖苷酶和聚糖酶[23]，所以甘露糖苷酶具有直接將甘露聚糖降解的聚糖酶功能。

采用qRT-PCR 測定MRS 培養(yǎng)基和KGM 培養(yǎng)基中甘露聚糖酶基因的差異表達情況，L.caseiHDS-01在KGM培養(yǎng)基培養(yǎng)時，甘露聚糖酶酶活及M1表達量明顯提高，表明KGM 培養(yǎng)基中的魔芋粉比MRS 培養(yǎng)基中葡萄糖更有效的誘導基因的表達。多數(shù)細菌和真菌以魔芋粉、瓜爾膠、槐豆膠等多聚糖類作為唯一碳源，如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)WMYB-2[24]在魔芋粉10.0 g/L、大豆蛋白胨10.0 g/L、CaCl220.6 g/L 的條件下發(fā)酵培養(yǎng)，酶活力可達到355.75 U/mL。

通過PCR 擴增成功的克隆了甘露聚糖酶編碼基因M1 并進行生物信息學分析，該基因長2640 bp，擁有完整的ORF，編碼879個氨基酸，且核苷酸對比結(jié)果同源性達100%。同時，rps-blast分析顯示該基因序列屬于GH38 家族，具有碳水化合物的轉(zhuǎn)運和代謝功能。氨基酸序列分析結(jié)果可知，M1 的分子量為98723.55 Da，等電點為5.58。并且可能含有Ser，Thr，Tyr 成為M1 蛋白激酶磷酸化的位點。關(guān)于甘露聚糖酶基因的克隆和生物信息學分析，不僅可以了解酶蛋白的初級結(jié)構(gòu)，為探究甘露聚糖酶的構(gòu)效關(guān)系和酶的定向進化夯實基礎[25]，也可以此基礎上采用異源表達[26]的方式構(gòu)建重組菌株，獲得表達量更高的基因工程菌株并進一步研究甘露聚糖酶基因的表達調(diào)控。

本研究采用本地數(shù)據(jù)庫比對和生物信息學等方法挖掘LAB基因組中甘露聚糖酶的編碼基因，不僅給生物安全性高的產(chǎn)酶微生物提供了菌株來源，同時深入挖掘LAB基因組數(shù)據(jù)，為甘露聚糖酶的分子改造研究提供依據(jù)。